專利名稱：：副溶血弧菌外膜蛋白vp2850的制備及其免疫保護功能的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的制備方法及其免疫保護功能的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是海水中常見的弧菌之一，是近年來引發(fā)微生物性食物中毒居首位的病原菌，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一種重要致病菌。對這類致病菌的防治主要包括藥物即抗生素防治以及免疫防治?？股仉m然在最初的使用中取得了巨大的進展，然而隨著抗生素的廣泛使用，也出現(xiàn)了一系列的相關(guān)問題，一方面抗生素的不合理使用，增加抗生素耐藥菌的產(chǎn)生，細(xì)菌感染增多；另一方面，因抗生素的耐藥性而人為地加大劑量，加劇耐藥性的產(chǎn)生。因此，研制以具有免疫保護作用的高效中和抗原為成分的疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景。在各種動物疾病的防治中，疫苗的使用是一個低成本、高效的方法，并且已經(jīng)有部分疫苗得到大規(guī)模使用并取得了不錯的防治效果。疫苗種類很多，以細(xì)菌為例，包括全菌疫苗、亞單位疫苗以及DNA疫菌等。從實際應(yīng)用的情況來看，全菌疫苗雖然具有制作相對簡單而且成本也較低的優(yōu)點，但也存在不少由于使用全菌體而固有的一些缺點，如減毒全菌疫苗可能出現(xiàn)菌株突變而導(dǎo)致毒性恢復(fù)等不良后果；滅活全菌疫苗則往往由于對細(xì)菌進行滅活而導(dǎo)致一些免疫保護基團活性改變，影響免疫保護的效果。而且對全菌疫苗來說，由于細(xì)菌成分的復(fù)雜性，其中往往存在一些毒性成分(如LPS等)，會導(dǎo)致機體產(chǎn)生不良反應(yīng)。常規(guī)制得的全菌疫苗免疫保護效果并不理想，然而，全菌疫苗仍然是目前最為主要的疫苗種類，其原因可能與高效中和抗原的發(fā)現(xiàn)和鑒定困難有關(guān)?；蚪M學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄分布圖技術(shù)的發(fā)展，為細(xì)菌疫苗提供了新的契機?；蚬こ桃呙缬捎谄涓咝Ф覕[脫了傳統(tǒng)疫苗的種種缺點，成為疫苗研究的重點，具有廣闊的應(yīng)用與開發(fā)前景。外膜蛋白(outermembraneprotein,0Mprotein)是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分之一，由于外膜蛋白直接面對宿主的體液及組織，細(xì)菌利用外膜蛋白進行黏附、侵入和炎癥等生理活動，更容易被宿主識別作為攻擊目標(biāo)，使得革蘭氏陰性菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不僅可以剌激體液免疫，而且對細(xì)胞免疫亦有剌激作用。近年來，細(xì)菌的一些外膜蛋白已經(jīng)被證實具有良好的免疫原性，對細(xì)胞免疫和體液免疫均有剌激作用，用其制備基因工程疫苗具有良好的前景，例如在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)外膜蛋白0mpX的免疫保護功能。然而，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的免疫保護功能及其應(yīng)用尚未被報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的制備方法，包括以下步驟1)副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因的擴增；2)副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因的克隆、篩選；3)副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因的表達；2/11頁4)副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的純化。本發(fā)明還提供了副溶血弧菌外膜蛋白VP2850作為疫苗組分的應(yīng)用。其中，所述的疫苗用于抵抗細(xì)菌感染，包括抵抗副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌以及嗜水氣單胞菌的感染。本發(fā)明還提供了副溶血弧菌外膜蛋白VP2850在制備抗細(xì)菌感染制劑中的應(yīng)用。其中，所述的細(xì)菌包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌。副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的被動免疫保護試驗、主動免疫保護試驗及主動交叉免疫保護試驗結(jié)果表明副溶血弧菌外膜蛋白VP2850免疫鯽魚后可顯著提高鯽魚對致病性副溶血弧菌的抵制力；免疫鯽魚和小鼠后還可以提高鯽魚和小鼠對溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌的抵抗力。由此可見，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850具有明顯的免疫保護作用，可用作疫苗組分或者抗細(xì)菌感染制劑，用于防治副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌感染所導(dǎo)致的疾病。圖1為VP2850基因PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖2為VP1192基因PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖3為重組PV2850基因雙酶切鑒定圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖4為重組PV1192基因雙酶切鑒定圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖5為VP2850基因表達與純化產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖，其中a為基因表達產(chǎn)物，b為純化產(chǎn)物；圖6為VP1192基因表達與純化產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖，其中a為基因表達產(chǎn)物，b為純化產(chǎn)物；圖7為副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的MALDI-TOF/MS肽指紋圖譜。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(2001byColdSpringHarborLaboratoryPress)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例一副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的制備和純化將全長的副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的基因編碼序列或片段構(gòu)建入大腸桿菌蛋白質(zhì)原核表達載體中，以表達和提純目的蛋白。副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因編碼序列如下ttatttagcgaagttgatgatagggaaacatttgaagaagccgttatccg50cacagttcaacagaccaatttgcacgccatcgatttggtcagtcatgttg100aagaagccaagttggaagttagactttttagaaatactcgccagaccaac150atctgccatggtgtaaccttctgagtagttcaccgcactccagtttaggc2004ctttcacgttgttcgtgatgtttaccgcaccaaagttcacaccagttgtt250tggccttggttccagttaaccaaaccaagtgacgcacctttcatctcttg300gtttactttcgctgccccaaagaacagaccgaagttcacacccgtagtac350ggtcagtttc3g3catecct3g朋ctgag3agtcgacgccttttacttcg400tttacttggccatgcagtaccgccaaacgaacaccaccaaC3gC3g3gtt450tgatggagcgttegtetggtcgatcgttga朋3C3tc3C3ggggtgctgt500tcgcaagagcaacaggtgatgcgatagtggctgcaacagccaatgacgtc550ataagctttttcatttttatctccat576副溶血弧菌外膜蛋白VP2850氨基酸序列如下MEIKMKKLMTSLAVAATIASPVALANSTPVMFSTIDHTNAPSNSAVGGVR50LAVLHGQVNEVKGVDFSVLGMSETDRTTGVNFGLFFGAAKVNQEMKGASL100GLV麗NQGQTTGVNFGAVNITNNVKGL麗SAVNYSEGYTMADVGLASISK150KSNFQLGFFNMTDQIDGVQIGLLNCADNGFFKCFPIINFAK1911、副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因的擴增根據(jù)NCBI公布的副溶血弧菌的全基因組序列，設(shè)計一對引物，引物序列如下正向引物(Senseprimer):5，-GCGGAATTCTTACTGCTTACCATCAT-3，；反向引物(Anti-sensePrimer):5'-TGTCTCGAGTTTGGTATCTGGCTTT-3'。為便于克隆和表達載體的構(gòu)建，在引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點EcoRI和XhoI。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以熱變性法獲得的副溶血弧菌的全基因組為模板，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下PCR反應(yīng)緩沖液2.5iil，10mmol/LdNTP共1yl，10ymol/L正向引物和反向引物各lyl，模板DNA12iU，用超純水將反應(yīng)體系補充至25iU。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下第一步94°C2min;第二步94。C變性60s，52。C退火60s，72。C延伸60s，30個循環(huán)。隨后繼續(xù)在72°C延伸10min，并在4t:下保存。用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定DNA片段的長度(見圖1)并回收DNA片段。2、副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因的克隆、篩選和鑒定用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI分別酶切DNA片段和pET-32a(Novagen)表達載體，參照Takara公司的DNA連接試劑盒使用說明書進行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下酶溶液5ii1，經(jīng)酶切的PCR反應(yīng)產(chǎn)物1y1，經(jīng)酶切的pET-32a表達載體0.5y1，用超純水將反應(yīng)體系補充至10iU，于16t:左右保溫1416小時。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后將菌體涂于含氨芐青霉素(50iig/mL)的LB固體平板上，于37。C培養(yǎng)1216小時。隨機挑取含氨芐青霉素的LB平板上的重組子，接種于含氨芐青霉素(50iig/mL)的LB液體培養(yǎng)基上，同時接種含有空pET-32a質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a，于37。C培養(yǎng)1216小時后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定(見圖3)。將有插入的重組子送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定，結(jié)果表明與NCBI中報道的副溶血弧菌外膜蛋白VP2850有98%的同源性，說明得到了正確的重組PV2850基因。3、副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因的表達將正確的重組PV2850基因以熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達菌，于37。C培養(yǎng)1216小時。將單菌落接種于含氨芐青霉素(50i!g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，同時接種含有空pET-32a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21作為對照，于37。C培養(yǎng)至0D值為0.6，加入0.5mmol/LIPTG，于35tH秀導(dǎo)3小時，離心收集菌體。通過SDS-PAGE檢測重組PV2850基因是否表達蛋白以及表達蛋白的分子量大小，結(jié)果如圖5所示。4、副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的純化大量培育轉(zhuǎn)化菌體，離心后進行超聲處理，離心收集上清液用Ni-NTAHisBind親和柱進行純化。第一步，用沖洗緩沖液BufferE(8M尿素、0.1MNaH2P04、10mmTris-HCl，用HCl調(diào)節(jié)pH值至6.3)洗滌5次，每次用量為lml;第二步，用洗脫緩沖液BufferF(8M尿素、0.1MNaH2P04、10mmTris-HCl，用HC1調(diào)節(jié)pH值至5.9)洗脫目的蛋白4次，每次用量為lml，收集洗脫液A;第三步，用洗脫緩沖液BufferG(8M尿素、0.1MNaH2P04、10mmTris-HCl，用HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5)洗脫未結(jié)合Ni-NTAHisBind親和柱的蛋白4次，每次用量為lml，收集洗脫液B。取收集的洗脫液A和洗脫液B進行SDS-PAGE分析，純化結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，重組PV2850基因表達蛋白的分子量均相當(dāng)于野生型VP2850基因表達蛋白的分子量，即比實際小20kD，提示其不含融合蛋白分子量。為證明該推論，通過質(zhì)譜對重組菌株高表達的純化蛋白進行分析，質(zhì)譜結(jié)果(如圖7所示)表明，該蛋白為副溶血弧菌外膜蛋白VP2850(見表1)。將純化好的副溶血弧菌外膜蛋白VP2850分裝，冷凍干燥成粉末后，凍存于-8(TC冰箱中。表1副溶血弧菌外膜蛋白VP2850肽質(zhì)量指紋圖譜的MatrixMowse檢索結(jié)果蛋白登錄號描述物種分子量(kDa)等電點質(zhì)譜匹配(%)Mowse得分VP2850GI|28899624|假想蛋白副溶血性弧菌202147.7734%98實施例二副溶血弧菌外膜蛋白VP1192的制備和純化將全長的副溶血弧菌外膜蛋白VP1192的基因編碼序列或片段構(gòu)建入大腸桿菌蛋白質(zhì)原核表達載體中，以表達和提純目的蛋白。副溶血弧菌外膜蛋白VP1192基因編碼序列如下ttagcgaggtacaacccttgcgtcattacc50cttggcctggctgg^^tcatgtttgggtttgcttcttg100atgatctttccatcctctaagcg^tegtgaggttcacaccatttctttt150cgcggttgcttcggcggctttactacctgcatagccacct200caccaatggctgcgatatccgagccag^ccgcccccaattttcgaaccc250朋朋tgCC3Cccacggcagcccctgctattgteccgatggcgttggattg300ggt卿ggC3tcaatggttacgggttctactttttctatcgtgccgtegt350aaacctgctgaactttgcgagtgtcggacgagccgtatgcatctccgtac400gggtteggtgagctacagccgCC33gC3Cgatcgcac^g450caacatgcctaacttgatgtgttttttcat■副溶血弧菌外膜蛋白VP1192氨基酸序列如下MKKHIKLGMLLTITCAIVLGGCSSPNPYGDAYGSSDTRKVQQVYYGTIEK50VEPVTIDASTQSNAIGTIAGAAVGGILGSKIGGGSGSDIAAIGGGLLGGY1006AGSKAAEATAKRNGVNLTIRLEDGKIISVVQEANPNMIFQPGQAVQINMS150GNDARVVPR1591、副溶血弧菌外膜蛋白VP1192基因的擴增根據(jù)NCBI公布的副溶血弧菌的全基因組序列，設(shè)計一對引物，引物序列如下正向引物(Senseprimer):5，-CGCGGATCCATGAAAAAACACATCAAGT_3，;反向引物(Anti-sensePrimer):5，-AGCAAGCTTTTAGCGAGGTACAACCC-3，。為便于克隆和表達載體的構(gòu)建，在引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點BamHI和HindIII。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以熱變性法獲得的副溶血弧菌的全基因組為模板，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下PCR反應(yīng)緩沖液2.5iil，10mmol/LdNTP共1yl，10ymol/L正向引物和反向引物各lyl，模板DNA12iU，用超純水將反應(yīng)體系補充至25iU。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下第一步94。C2min;第二步94。C變性60s，6(TC退火60s，72。C延伸60s，30個循環(huán)。隨后繼續(xù)在72°C延伸10min，并在4t:下保存。用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定DNA片段的長度(見圖2)并回收DNA片段。2、副溶血弧菌外膜蛋白VP1192基因的克隆、篩選和鑒定用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII分別酶切DNA片段和pET-32a(Novagen)表達載體，參照Takara公司的DNA連接試劑盒使用說明書進行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下酶溶液5iil，經(jīng)酶切的PCR反應(yīng)產(chǎn)物1iil，經(jīng)酶切的pET-32a表達載體0.5iil，用超純水將反應(yīng)體系補充至10iU，于16t:左右保溫1416小時。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后將菌體涂于含氨芐青霉素(50i!g/mL)的LB固體平板上，于37。C培養(yǎng)1216小時。隨機挑取含氨芐青霉素的LB平板上的重組子，接種于含氨芐青霉素(50i!g/mL)的LB液體培養(yǎng)基上，同時接種含有空pET-32a質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a，于37。C培養(yǎng)1216小時后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定(見圖4)。將有插入的重組子送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定，結(jié)果表明與NCBI中報道的副溶血弧菌外膜蛋白1192有97.5%的同源性，說明得到了正確的重組PV1192基因。3、副溶血弧菌外膜蛋白VP1192基因的表達將正確的重組PV1192基因以熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達菌，于37。C培養(yǎng)1216小時。將單菌落接種于含氨芐青霉素(50i!g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，同時接種含有空pET-32a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21作為對照，于37。C培養(yǎng)至0D值為0.6，加入0.5mmol/LIPTG，于35tH秀導(dǎo)3小時，離心收集菌體。通過SDS-PAGE檢測重組PV1192基因是否表達蛋白以及表達蛋白的分子量大小，結(jié)果如圖6所示。4、副溶血弧菌外膜蛋白VP1192的純化大量培育轉(zhuǎn)化菌體，離心后進行超聲處理，離心收集上清液用Ni-NTAHisBind親和柱進行純化。第一步，用沖洗緩沖液BufferE(8M尿素、0.1MNaH2P04、10mmTris-HCl，用HCl調(diào)節(jié)pH值至6.3)洗滌5次，每次用量為lml;第二步，用洗脫緩沖液BufferF(8M尿素、0.1MNaH2P04、10mmTris-HCl，用HC1調(diào)節(jié)pH值至5.9)洗脫目的蛋白4次，每次用量為lml，收集洗脫液A;第三步，用洗脫緩沖液BufferG(8M尿素、0.1MNaH2P04、10mmTris-HCl，用HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5)洗脫未結(jié)合Ni-NTAHisBind親和柱的蛋白4次，每次用量為lml，收集洗脫液B。取收集的洗脫液A和洗脫液B進行SDS-PAGE分析，純化結(jié)果如圖6所示。7將純化好的副溶血弧菌外膜蛋白VP1192分裝，冷凍干燥成粉末后，凍存于-S(TC冰箱中。實施例三副溶血弧菌外膜蛋白VP2850抗血清的被動免疫保護作用將實施例一所制得的純化的副溶血弧菌外膜蛋白VP2850免疫家兔，獲取VP2850抗血清。具體步驟如下將副溶血弧菌外膜蛋白VP2850凍干粉溶于適量的超純水中，然后與等體積的弗氏完全佐劑(羊毛脂石蠟油=1:4v/v，卡介苗為30mg/ml)混合均勻，其中蛋白含量約為500iig，然后超聲處理2min，即制得VP2850抗原，采用皮下多點注射；20天后，將副溶血弧菌外膜蛋白VP2850與等體積的弗氏不完全佐劑(羊毛脂石蠟油=1:4v/v)混合，給家兔進行注射，其中蛋白含量約為500iig;20天后再注射一次，7天后頸動脈取血，4t:過夜后使血清自然析出；4°C3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，取上清液即得VP2850抗血清。按照相同方法，將實施例二所制得的純化的副溶血弧菌外膜蛋白VP1192免疫家兔，獲取VP1192抗血清，作為對照試驗用抗血清。采用Dot-ELISA技術(shù)，分別測定VP2850抗血清和VP1192抗血清的效價。測得VP2850抗血清的效價為2.5萬，VP1192抗血清的效價為5萬。將購買的鯽魚(約為20g/尾)飼養(yǎng)1周，水溫控制在25士2t:，每天早晚兩次投喂人工配合飼料，馴養(yǎng)1周后無異常的隨機分組進行免疫注射。根據(jù)上述Dot-ELISA的結(jié)果，取相等效價的VP2850抗血清和VP1192抗血清分別對鯽魚(約20克/條)進行被動免疫。實驗組中，給鯽魚腹腔注射100ii1抗血清，2.5小時后用5倍半數(shù)致死劑量的副溶血弧菌(5X108cfu/ml)進行感染?？瞻讓φ战M中，給鯽魚腹腔注射100iU生理鹽水后，用等量的副溶血弧菌進行感染。觀察72小時后各組鯽魚的生存情況，計算各組鯽魚的相對免疫保護率。結(jié)果顯示，VP2850抗血清的相對免疫保護率為75.0%，VP1192抗血清的相對免疫保護率僅為15.0%，空白對照組的鯽魚均死亡(見表2)。三組數(shù)據(jù)相互間具有非常顯著的差異，表明副溶血弧菌外膜蛋白VP2850具有明顯的被動免疫保護作用。[oogo]相對免疫保護率(％)=(1-試驗組死亡率/對照組死亡率)X100%表2副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的被動免疫保護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*P<0.05實施例四副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的主動免疫保護作用按照實施例三所述的條件飼養(yǎng)鯽魚，馴養(yǎng)1周后無異常的隨機分組進行免疫注射。將實施例一所制得的純化的副溶血弧菌外膜蛋白VP2850凍干粉溶于適量的超純水中，然后與等體積的弗氏完全佐劑(羊毛脂石蠟油=1:4v/v，卡介苗為30mg/ml)混合均勻，其中蛋白含量約為25iig，然后超聲處理2min，即制得VP2850抗原。實驗組中，給鯽魚腹腔注射VP2850抗原，25iig/尾魚；10天后，將副溶血弧菌外膜蛋白VP2850與等體積的弗氏不完全佐劑(羊毛脂石蠟油=1:4v/v)混合，給鯽魚進行腹腔注射，12.5iig/尾魚?？瞻讓φ战M中，給鯽魚腹腔注射生理鹽水100iU，每隔10天注射1次，共注射2次。第2次免疫注射7天后，對各組鯽魚用5倍半數(shù)致死劑量的副溶血弧菌(5X108cfu/mL)進行攻毒保護性實驗。觀察72小時后各組鯽魚的生存情況，計算各組鯽魚的相對免疫保護率并據(jù)此比較分析免疫原性蛋白質(zhì)的保護效果。結(jié)果顯示，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850免疫鯽魚對抗副溶血弧菌攻毒的相對免疫保護率為83.3X(見表3)。結(jié)果表明，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850具有明顯的主動免疫保護作用。表3副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的主動免疫保護作用分組尾數(shù)存活數(shù)死亡率相對免疫保護率VP2850免疫組201715%83.3%*空白對照組20290%*P<0.01實施例五副溶血弧菌外膜蛋白VP2850抗血清的主動交叉免疫保護作用1、對鯽魚的主動交叉免疫保護作用參照實施例四所述的方法進行試驗，其中進行攻毒保護性實驗所用的細(xì)菌為溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌及嗜水氣單胞菌。攻毒劑量定為溶藻弧菌5X108cfu/ml，熒光假單胞桿菌5X108cfu/ml，嗜水氣單胞菌4X108cfu/ml。觀察120小時后各組鯽魚的生存情況，計算各組鯽魚的相對免疫保護率。結(jié)果顯示，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850對抗溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌攻毒的相對免疫保護率依次為83.3%、92.9%和66.7%(見表4)。表4副溶血弧菌外膜蛋白VP2850對鯽魚的主動交叉免疫保護作用分組尾數(shù)存活數(shù)死亡率相對免疫保護率溶藻弧菌攻毒VP2850免疫組151313.3%83.3%*空白對照組20480.0%熒光假單胞菌VP2850免疫組15146.7%92.9%'攻毒空白對照組20195.0%嗜水氣單胞菌VP2850免疫組151033.3%66.7%*攻毒空白對照組200100%*P<0.052、對小鼠的主動交叉免疫保護作用采用約3周左右的昆明鼠作為試驗小鼠，分別用溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌及嗜水氣單胞菌進行攻毒保護性實驗。首先對小鼠進行副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的免疫。免疫過程如下將實施例一所制得的純化的副溶血弧菌外膜蛋白VP2850凍干粉溶于適量的超純水中，然后與等體積9的弗氏完全佐劑(羊毛脂石蠟油=1:4v/v，卡介苗為30mg/ml)混合均勻，其中蛋白含量約為lOOiig，然后超聲處理2min，即制得VP2850抗原。實驗組中，給昆明鼠腹腔注射VP2850抗原；10天后，將副溶血弧菌外膜蛋白VP2850與等體積的弗氏不完全佐劑(羊毛脂石蠟油=1:4v/v)混合，其中蛋白含量約為100i!g，給昆明鼠進行腹腔注射?？瞻讓φ战M中，給昆明鼠腹腔注射生理鹽水100iU，10天后再注射1次。第2次免疫注射約7天后，對小鼠進行攻毒保護性實驗。攻毒劑量定為溶藻弧菌5X109cfu/ml，熒光假單胞桿菌5X109cfu/ml，嗜水氣單胞菌4Xl()9cfu/ml。觀察72小時后各組小鼠的生存情況，計算各組小鼠的相對免疫保護率。結(jié)果顯示，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850對抗溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌攻毒的相對免疫保護率依次為80.0%、68.4%和73.3%(見表5)。表5副溶血弧菌外膜蛋白VP2850對小鼠的主動交叉免疫保護作用__只數(shù)存活數(shù)死亡率相對免疫保護率溶藻酸弧菌201715%80.0%*;^纟;熒光假單胞桿菌201430%68.4%**嗜水氣單胞菌201620%73.3%**溶藻酸弧菌20575%-—…^^^"熒光假單胞桿菌20195%—---嗜水氣單胞菌20575%------*P<0.05;**P<0.01結(jié)果表明，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850具有明顯的主動交叉免疫保護作用。綜上所述，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850具有明顯的免疫保護作用，可用作疫苗組分或者抗細(xì)菌感染制劑，用于防治副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌感染所導(dǎo)致的疾病。序列表〈110>中山大學(xué)〈120〉副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的制備及其免疫保護功能的應(yīng)用〈160>4〈210>1〈211>576〈212>DNA〈213〉副溶血弧菌外膜蛋白VP2850編碼基因〈400〉1ttatttagcgaagttgatgatagggaaacatttgaagaagccgttatccg50cacagttcaacagaccaatttgcacgccatcgatttggtcagtcatgttg100aagaagccaagttggaagttagactttttagaaatactcgccagaccaac150atctgccatggtgtaaccttctgagtagttcaccgcactccagtttaggc200ctttcacgttgttcgtgatgtttaccgcaccaaagttcacaccagttgtt250tggccttggttccagttaaccaaaccaagtgacgcacctttcatctcttg300gtttactttcgctgccccaaagaacagaccg朋gttC3C3cccgtagtac350ggtcagtttcagacatecct3g朋ctg3galagtcgacgccttttacttcg400tttacttggccatgcagtaccgccaaacgaC3gC3g3gtt450tgatggagcgttagtatggtcgatcgttgaggggtgctgt500tcgc朋gagcaacaggtgatgcgatagtgg-ctgcaacagccaatgacgtc550ataagctttttcatttttatctccat576〈210>2〈211>191〈212>PRT〈213〉副溶血弧菌外膜蛋白VP2850〈400>2MetGlulieLysMetLysLysLeuMetThrSerLeuAlaValAla51015AlaThrlieAlaSerProValAlaLeuAlaAsnSerThrProVal202530MetPheSerThrlieAspHisThrAsnAlaProSerAsnSerAla354045ValGlyGlyValArgLeuAlaValLeuHisGlyGinValAsnGlu505560ValLysGlyValAspPheSerValLeuGlyMetSerGluThrAsp657075ArgThrThrGlyValAsnPheGlyLeuPhePheGlyAlaAlaLys808590ValAsnGinGluMetLysGlyAlaSerLeuGlyLeuValAsnTrp95100105AsnGinGlyGinThrThrGlyValAsnPheGlyAlaValAsnlie110115120ThrAsnAsnValLysGlyLeuAsnTrpSerAlaValAsnTyrSer125130135GluGlyTyrThrMetAlaAspValGlyLeuAlaSerlieSerLys140145150LysSerAsnPheGinLeuGlyPhePheAsnMetThrAspGinlie155160165AspGlyValGinlieGlyLeuLeuAsnCysAlaAspAsnGlyPhe170175180PheLysCysPheProlielieAsnPheAlaLys185190ttagcgaggtacaacccttgcgtcattacc3g3C3tgttgatttg朋cgg50cttggcctggctgg朋朋tcatgtttgggtttgcttcttg朋Cg3C3g3t100atgatctttccatcctctaagcg朋tegtgaggttcacaccatttctttt150cgcggttgcttcggcggctttactacctgcatagccacctaataaaccac200caccaatggctgcgatatccg3gCC3g朋Ccgcccccaattttcgaaccc250朋朋tgCC3Cccacggcagcccctgctattgtaccgatggcgttggattg300ggt卿ggC3tcaatggttacgggttctactttttctatcgtgccgtagt350aaacctgctgaactttgcgagtgtcggacgagccgtatgcatctccgtac400gggtteggtgagctacagccgcc朋gcacg3tCgC3C33gt￡l￡ltggtg￡lg450caacatgcctaacttgatgtgttttttcat■〈210>4〈211>159〈212>PRT0167]〈210>30168]〈211>4800169]〈212>DNA0170]〈213〉副溶血弧菌外膜蛋白VP1192編碼基因0171]〈400>30185]0186]0187]0188]0189]0190]0191]0192]0193]0194]0195]0196]0197]0198]0199]0200]0201]0202]0203]0204]0205]〈213〉副溶血弧菌外膜蛋白VP1192〈400>4MetLysLysHislieLysLeuGlyMetAlalieValLeuAlaTyrGlySerGlyThrlieGluGinSerAsnAlalieLeuGlyAlalieGlySerGlyAlaGluAlaThrLeuGluAspGlyAsnMetliePhe5Gly20Ser35Lys50lie65Lys80Gly95Ala110Lys125GinGlyCysSerSerAspThrArgLysValGluProValGlyThrlieAlalieGlyGlyLeuLeuGlyGlyGlyLysArgAsnGlylielieSerValProGlyGinAlaLeu10Pro25Val40Thr55Gly70Ser85Tyr100Val115Val130ValLeuAsnGinlieAlaGlyAlaAsnGinGinThrlieProTyrGinValAspAlaAlaValSerAspGlySerLeuThrGluAlalieAsnThrGlyTyrSerGlylieLyslieAsnMetCys15Asp30Tyr45Thr60Gly75Ala90Ala105Arg120Pro135Ser12140145150GlyAsnAspAlaArgValValProArg15權(quán)利要求副溶血弧菌外膜蛋白VP2850作為疫苗組分的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的疫苗用于抵抗細(xì)菌感染。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的細(xì)菌包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌。4.副溶血弧菌外膜蛋白VP2850在制備抗細(xì)菌感染制劑中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的細(xì)菌包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌。全文摘要本發(fā)明公開了副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的制備方法、免疫保護功能及其作為免疫組分和抗細(xì)菌感染制劑的應(yīng)用。實驗證明，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850具有明顯的免疫保護作用，能夠有效抵抗副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌的感染，以及防治這些細(xì)菌感染所導(dǎo)致的疾病。文檔編號A61K39/106GK101703767SQ200910193558公開日2010年5月12日申請日期2009年11月2日優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日發(fā)明者葉明芝,彭宣憲,李惠申請人:中山大學(xué)