專利名稱：IFN-γ受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及IFN-y受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒減毒載 體以及基于此載體構(gòu)建的表達HIV-1各種抗原(單價及多價)的IFN-y受體 基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒艾滋病疫苗。本發(fā)明的天壇株重 組痘苗病毒減毒載體能夠顯著降低痘苗病毒載體的毒力，可以用于構(gòu)建表 達同一病原多種抗原、不同病原多種抗原的多價重組痘苗病毒。本發(fā)明的 重組痘苗病毒艾滋病疫苗能夠誘導(dǎo)高水平的抗人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)的體液和細胞免疫應(yīng)答，并有效提高重組痘 苗病毒艾滋病疫苗的安全性及免疫原性。
背景技術(shù)：
痘苗病毒天壇株(vaccine virus TianTan strain，VTT)為我國消滅天花 作出巨大貢獻，在活載體疫苗研究應(yīng)用也十分活躍，重組痘苗病毒疫苗具 有效果好、對熱穩(wěn)定性好，接種方便，不需佐劑等優(yōu)點，然而痘苗病毒接 種人體后產(chǎn)生較重的局部反應(yīng)，特別是在一定比例的免疫缺陷患者中可引 起嚴重的并發(fā)癥。表達某些免疫原的重組痘苗病毒未能達到理想的免疫效 果，如何能在增強重組痘苗病毒的免疫原性同時進一步提高痘苗病毒載體 的安全性，學(xué)者們作出很多深入的研究。隨著新的病毒疾病不斷出現(xiàn)，對 宿主抗病毒免疫機理的深入了解，構(gòu)建表達同一病原多種抗原、不同病原 多種抗原的多價重組痘苗病毒載體，尋找更多穩(wěn)定有效的外源基因插入?yún)^(qū) 意義重大。
痘苗病毒基因組編碼一些特殊蛋白抑制宿主免疫系統(tǒng)，據(jù)文獻報道和
基因分析，可知痘苗病毒天壇株B8R基因與IFN-y受體膜外區(qū)域具有高度同 源性[1]。 IFN-y在抗病毒及免疫調(diào)節(jié)方面具有重要的作用。本發(fā)明構(gòu)建缺失 IFN-y受體基因的天壇株重組痘苗病毒載體，研究其毒力改變及B8R缺失區(qū) 插入外源基因表達的穩(wěn)定性。進一步提高天壇株痘苗病毒載體安全性、研制表達多價抗原重組痘苗病毒載體。
HIV—1全球流行導(dǎo)致了極高的致病率和病死率，為防治HIV—1的感
染，傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療、免疫治療以及新的方法得以不斷研究、發(fā)展，
對多數(shù)HIV感染者進行HAART，雖可有效抑制病毒血癥，延緩病程，但不 能清除潛伏的病毒。保護性的疫苗接種是解決防治HIV-1感染全球性問題 的最佳途徑?？茖W(xué)家們開展了減毒活疫苗、滅活疫苗、重組亞單位疫苗、 各種活載體疫苗(腺病毒、金絲雀痘病毒、流感病毒、痘苗病毒、狂犬病 毒、VSV、傷寒桿菌、鏈球菌等載體)的研究，傳統(tǒng)的減毒活疫苗及滅活 疫苗在HIV防治中存在一些問題。雖然減毒活疫苗在SIV模型證實有效， 但在初免疫成年獼猴中存在一定致死率。被HIV-1感染的猩猩仍可被第二 種不相關(guān)的HIV-1感染。由于活減毒株風(fēng)險性以及有證據(jù)表明無廣泛保護 性，減毒活疫苗應(yīng)用的爭議尚待進一步研究。在猩猩模型有研究表明，滅 活疫苗不能保護HIV-1攻擊，不能誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。病毒活載體疫苗和DNA 疫苗都既可以誘導(dǎo)細胞免疫，又可以誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，表達HIV-1抗原 重組痘苗病毒和HIV-1DNA疫苗的聯(lián)合免疫成為新的疫苗研究策略。
發(fā)明內(nèi)容
為了進一步提高重組痘苗病毒疫苗的安全性及有效性，本發(fā)明目的在 于提供一種同源重組構(gòu)建B8R基因缺失區(qū)插入外源基因的的IFN-Y受體基 因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒VTTAB8RlacZ及其在制備重組痘 苗病毒疫苗中的應(yīng)用。
具體涉及一種B8R基因缺失、表達HIV-l抗原的VTKgpeAB8R (B8R基 因缺失不帶lacZ選擇標記，TK區(qū)插入B7C型CN54株HIV-1 gagpol env 基因)的天土云株重組痘苗病毒 com6/"贈vacc/m'a vzWms VTKgpe的艾滋病 疫苗，該重組痘苗病毒recom6,"贈vacc/"/a vzWws VTKgpe于2004年2月24 日在北京保藏，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，其保藏號為CGMCC No.l099;涉及一種B8R基因缺失表達HIV-1抗原 的VTKgpeAB8RlacZ (B8R基因缺失為lacZ所取代，TK區(qū)插入BVC型 CN54株HIV-1 gagpol env基因)的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗； 還涉及一種B8R基因缺失、表達乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的(B8R基因缺失插入HBSAg抗原，TK區(qū)插入IL-2基因)的天壇株重組痘苗病毒 的乙型肝炎病疫苗。
本發(fā)明的目的在于提供用于以痘苗病毒VTT為母本病毒，構(gòu)建B8R區(qū)缺 失，同時在該區(qū)插入各種外源基因的重組痘苗病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R、 pSKB8RLacZ 、 pSKB8RNeo、 pSKB8RPNeo和它們的構(gòu)建方法。
本發(fā)明提供了一種用于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ構(gòu)建的質(zhì)粒pSC65，含有 該質(zhì)粒的大腸埃希氏菌￡^^士/^"http://已于2004年2月24日在北京保藏,保藏 單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為 CGMCC No. 1097。
本發(fā)明提供了一種用于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8Rneo構(gòu)建的質(zhì)粒pVI75，含有該 質(zhì)粒的大腸埃希氏菌^/^n'c/n'a co/z'已于2004年2月24日在北京保藏，保藏 單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為 CGMCC No. 1098。
本發(fā)明所涉及的一種B8R基因缺失為kcZ所取代的重組病毒 VTTAB8RlacZ可以作為同源重組構(gòu)建B8R基因缺失區(qū)插入外源基因的疫 苗株的親本毒株。VTTAB8RlacZ構(gòu)建方法即將痘苗病毒天壇株VTT (北 京生物制品所保藏，Tiantan株752-1 )與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF 細胞進行同源重組,經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為 lacZ所取代的重組病毒VTTAB8RlacZ。提取DNA，進行PCR擴增及DOT BLOT鑒定、檢測重組病毒B8R基因缺失的穩(wěn)定性，表明VTTAB8RlacZ 在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因缺失穩(wěn)定。VTTAB8RlacZ在CEF 細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代插入外源基因lacZ穩(wěn)定表達。重組缺失病毒 VTTAB8RlacZ在CEF、 TKH43、 CV-1細胞中的繁殖生長曲線測定，結(jié)果 表明VTTAB8RlacZ的生長曲線與VTT生長曲線相似。B8R基因缺失對重 組缺失病毒在細胞中的繁殖復(fù)制沒有影響。兔皮內(nèi)毒力實驗表明 VTT752-l形成紅腫痘皰面積顯著大于VTTAB8RlacZ形成痘皰，VTT752-l 形成紅腫痘皰而后出現(xiàn)潰破接痂，VTT厶B8RlacZ形成痘皰無潰破接痂， VTTAB8RlacZ形成痘皰消褪較VTT752-l形成痘皰消褪早。B8R基因缺失 顯著降低痘苗病毒天壇株病毒毒力。
本發(fā)明涉及的一種B8R基因缺失、表達HIV-l抗原的VTKgpeAB8R (B8R基因缺失不帶lacZ選擇標記，TK區(qū)插入B7C型CN54株HIV-1 gagpolenv基因)的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗及一種B8R基因缺失表達HIV-l抗原的VTKgpeAB8RlacZ (B8R基因缺失為IacZ所取代，親 本毒株VTTAB8RlacZ的TK區(qū)插入B7C型CN54株HIV-1 gagpol env基 因)的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗。即將VTKgpe (TK區(qū)插入B7C 型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天壇株重組痘苗病毒)與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組,經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、 鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTKgpeAB8RlacZ，再以 VTKgpeAB8RlacZ為親本株與pSKB8RNeo共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組, 經(jīng)G418壓力篩選、藍白斑篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失不 帶lacZ選擇標記的重組病毒VTKgpeAB8R 。裸鼠毒力實驗表明 VTKgpeAB8R毒力較VTKgpe顯著降低，腹腔接種VTT (104pfo)及VTKgpe (10ifli)15天裸鼠死亡，接種VTKgpeAB8R(107 pfo)裸鼠存活。胞內(nèi)IFN-y. 染色流式細胞儀分析、T淋巴細胞增殖、CTL檢測顯示B8R基因缺失顯著 提高表達HIV-1基因的天壇株重組痘苗病毒特異性細胞免疫。本發(fā)明上述 所涉及的TK區(qū)
是指Tiantan株Genebank,gi6969640基因組的79799bp-81271 bp的 一 段核苷
酸序列。
本發(fā)明涉及B8R基因缺失、表達HIV-1和乙型肝炎病毒各種單價或多 價抗原的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病及乙型肝炎病疫苗。
本發(fā)明涉及B8R基因缺失、表達外源基因單價或多價抗原的天壇株重 組痘苗病毒包括重組疫苗、表達外源基因重組痘苗病毒以及它們在制 備治療病毒病的重組痘苗病毒疫苗藥物中的應(yīng)用。
以上本發(fā)明所描述的技術(shù)特征目前國內(nèi)外未見任何報道，所以本發(fā)明 具有創(chuàng)造性、新穎性和實用性。對人類病毒病的重組痘苗病毒疫苗藥物治 療將帶來十分重要的意義。
圖l顯示轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R、 pSKB8RLacZ 、 pSKB8RNeo的構(gòu)建路線 圖2顯示pSKB8R酶切確認分析結(jié)果，圖中泳道2，3:分子量標記DL2000， DL15000 (購自大連寶生物工程有限公司)，泳道l:pSKB8R (Ndel禾口 BgLII)。圖3顯示pSKB8RlacZ酶切確認分析結(jié)果，圖中泳道l:分子量標記 DL15000，泳道2:pSKB8RLacZ(Spel)，泳道3: pSKB8RLacZ (Sacl), 泳道4: pSKB8RLacZ(Ndel)。
圖4顯示pSKB8RNeo酶切確認分析結(jié)果，圖中泳道l:分子量標記 DL15000，泳道2: pSKB8RNeo (BamHI和BgLII)。
圖5顯示pSKB8RPNeo酶切確認分析結(jié)果，圖中泳道l 2:分子量標記 DL2000，15000，泳道3: pSKB8RPNeo (SaLI/SmaLI)。 圖6顯示重組病毒VTTAB8RlacZ、 VTKgpeAB8RlacZ、 VTKgpeAB8R構(gòu)
建示意圖。
圖7顯示PCR擴增檢測重組病毒VTTAB8RlacZ B8R基因缺失
1,6: DNA標準 2 : VTTDNAPCR擴增產(chǎn)物(引物B8RLF、 B8RRR)
3: VTTDNA擴增產(chǎn)物(弓I物B8RF、 B8RRR)
圖8 Dot Blot檢測病毒基因組中B8R基因
提取痘苗病毒VTT752-lDNA及重組病毒VTTAB8RlacZ傳代15代DNA，以 B8R基因地高辛標記探針進行Dot Blot檢測。VTT752-lDot Blot結(jié)果顯示 雜交印跡斑點，VTTAB8RlacZ傳代15代Dot Blot結(jié)果未顯示雜交印跡斑 點，表明VTTAB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失 圖9顯示重組缺失病毒VTTAB8RlacZ細胞中的繁殖曲線測定 以VTTAB8RlacZ重組病毒在CEF中增殖，其不同時間收獲的病毒PFU值， 繪制病毒繁殖曲線(與TK一143、 Wish、 CV-1細胞上繁殖曲線相似)。結(jié)果 表明VTTAB8RlacZ的繁殖曲線與對照VTT繁殖曲線相似。B8R基因缺失對 重組缺失病毒在細胞中的繁殖復(fù)制沒有影響。48h病毒繁殖高峰達 107PFU/ml。(生長曲線縱軸為PFU對數(shù)值)
圖10 顯示兔皮內(nèi)毒力實驗結(jié)果兔背皮內(nèi)左側(cè)接種1X10卞FU的 VTT厶B8RlacZ，右側(cè)接種lXl()6pFlJ/ml的VTT752-l ，將0.1ml lX107pfu/ml VTTAB8RlacZ重組病毒,對兔背皮內(nèi)注射后，逐日觀察皮膚紅腫面積，第5 天可見紅腫痘皰，明顯小于對照痘苗病毒，且無潰破，消褪較早。表明重 組病毒VTTAB8RlaeZ毒力比對照VTT7S2-1顯著減弱。 圖ll顯示PCR擴增檢測重組病毒VTKgpeAB8R B8R基因缺失 提取重組病毒DNA為模板，以引物B8RLF、 B8RRR進行PCR擴增。重組病毒VTKgpeAB8R由于B8R基因缺失，PCR擴增出1244 bp片段，包括B8R基 因外左側(cè)同源序列B8RL片段583 bp、右側(cè)同源序列B8RR片段661 bp。而 對照VTTDNA為模板擴增出2Kb片段，包括B8R基因外左側(cè)同源序列BSRL 片段583 bp、 B8R基因818bp、右側(cè)同源序列B8RR片段661 bp。結(jié)果表明 VTKgpeAB8R在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失。
圖12、 Dot Blot檢測病毒VTKgpeAB8R基因組中B8R基因 1、 VTT752-1 2、 VTKgpeAB8R
提取痘苗病毒VTT752-lDNA及重組病毒VTKgpeAB8R傳代15代DNA，以 B8R基因地高辛標記探針進行Dot Blot檢測。VTT752-lDot Blot結(jié)果顯示 雜交印跡斑點，VTKgpeAB8R傳代15代Dot Blot結(jié)果未顯示雜交印跡斑點， 表明VTKgpeAB8R在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失 圖13顯示胞內(nèi)IFN-Y.染色流式細胞儀分析結(jié)果。DNA + VTKgpeAB8R免疫 組小鼠脾細胞T淋巴細胞，在體外經(jīng)表位肽刺激后，分泌正1^丫的008+T淋 巴細胞占脾臟總CD8+T淋巴細胞的百分比數(shù)顯著高于DNA +VTKgpe免疫 組。VTKgpeAB8R免疫組小鼠脾細胞分泌IFN-y.CD8百分比數(shù)顯著高于 VTKgpe免疫組。
圖14顯示T淋巴細胞增殖3H-TdR法檢測結(jié)果。DNA + VTKgpeAB8R免疫 組小鼠脾細胞T淋巴細胞，在體外經(jīng)表位肽刺激后，刺激指數(shù)(SI)顯著 高于DNA + VTKgpe免疫組。
圖15顯示CTL乳酸脫氫酶法檢測結(jié)果。DNA + VTKgpeAB8R免疫組小鼠
脾細胞T淋巴細胞，特異性殺傷顯著高于DNA + VTKgpe免疫組。
VTKgpeAB8R免疫組高于VTKgpe免疫組
圖16 Western Blot分析VTKgpeAB8R目的基因表達
1 VTT感染CEF細胞 2,3,4 VTKgpeAB8R感染CEF細胞 5預(yù)染蛋白
Marker
具體實施方案
實施例一、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建 1.質(zhì)粒pBR-SK的構(gòu)建5'PBR322畫SACI畫FOR
GGAGCTCCGACCGATGCCCTTGAGAGCC
3,PBR322-KPNI-RE
GGGGTACCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG PCR擴增商業(yè)質(zhì)粒pBR322包括全部功能元件的序列，記為pBR。 反應(yīng)體系
反應(yīng)條件94。C預(yù)變性2min; 94°C30s，68°C5 min,共35個循環(huán)；72°C7min; 4°C。
純化并大連寶生物的KpnI和SacI共酶切PCR產(chǎn)物pBR，跑膠回收。
用大連寶生物的KpnI和SacI共酶切質(zhì)粒pBS-SK，得到多克隆位點序列 (小片段)，記為SK，跑1.5%瓊脂糖膠回收。
連接酶切回收產(chǎn)物pBR和SK，轉(zhuǎn)化ToplO大腸桿菌感受態(tài)，并篩選出 正確克隆子，記為pBR-SK。
2.轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R的構(gòu)建
在載體質(zhì)粒pBR-SK插入痘苗病毒天壇株B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL 片段、右側(cè)同源序列B8RR片段。見圖l。采用PCR技術(shù)分別以痘苗病毒
10xPyrobest Buffer dNTPMisture (各2.5mM) 3，PBR322-KPNI-RE (50,) 5'PBR322-SACI-FOR (50, pBR322
Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)
5^1 0，
0，
0，
ddH20
10DNA擴增痘苗病毒天壇株B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL片段(引物 B8RLF、 B8RLR)右側(cè)同、源序列B8RR片段(引物B8RRF、 B8RRR)， B8RL 片段、B8RR片段分別用BgLI徹連接，以連接產(chǎn)物為模板PCR擴增(引物 B8RLF、 B8RRR) B8R基因外左右側(cè)同源序列連接大片段B8RLR。大片段 B8RLR、 pBRSK質(zhì)粒分別以Kpnl/BamHI酶切、T4DNALigase連接構(gòu)建帶 有天壇株B8R基因外左右側(cè)同源臂的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R。引物序列 B8RLF : gtaataggtaccgtagcatcctattcg B8RLR : tataatagatcttatggtgttgtttg B8RRF: aactaaagatctcggtagcac B8RRR: attcgtggatccattgtaacaagatatc
B8RL片段(引物B8RLF、B8RLR) ,B8RR片段(引物B8RRF、B8RRR)，， 連接大片段B8RLR (引物B8RLF、 B8RRR) PCR擴增反應(yīng)采用大連寶生物 工程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下
模板DNA lpl
正、反向引物 各lpl
10xPyrobest緩沖液 5;al dNTP混合物(各2.5mM) 5(il
Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5pl ddH20 37,5pl
PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性2 min; 94。C30s,58。C30s,72。C30s，共20個 循環(huán);72。C7min; 4'C。
大片段B8RLR延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進行純 化回收，回收產(chǎn)物Kpnl/BamHI共酶切(Takara公司產(chǎn))。。pBRSK質(zhì)粒載體 Kpnl/BamHI共酶切(Takara公司產(chǎn))。用Omega公司E.Z.N.A. Gel Extraction Kit進行電泳純化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司產(chǎn))連接構(gòu)建帶有天 壇株B8R基因外左右側(cè)同源臂的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感 受態(tài)大腸桿菌T叩IO，涂含氨芐青霉素的LB平板，37'C培養(yǎng)12-16小時。提 取質(zhì)粒，用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析鑒定，酶切鑒定結(jié)果分別參見圖2。
3.轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ的構(gòu)建
在pSKB8R左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段間插入痘苗 病毒啟動子序列pE/L、 p7.5及下游LacZ序列。以質(zhì)粒pSC65為模板擴增痘苗病毒啟動子序列pE/L、 p7.5及下游LacZ序歹(J(引物pSC65F、 pSC65R)。 pE/L、 p7.5及下游LacZPCR擴增片段(引物pSC65F、 pSC65R)以BamHI酶 切、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R以BgLII酶切，二者T4DNALigase連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pSKB8RLacZ。 pSKB8RLacZ帶有痘苗病毒啟動子序歹UpE/L、 p7,5和p7.5下 游的LacZ序列以及兩側(cè)的B8R基因夕卜同源臂。pSC65F : tctttcggatccttgttgaattagatcg pSC65R: gtttgccatacgctcacagaag
pE/L、 p7.5及下游LacZPCR擴增片段PCR擴增反應(yīng)采用大連寶生物工 程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下
質(zhì)粒pSC65 1^1 正、反向引物(pSC65F、 pSC65R) 各1|^1
10xPyrobest緩沖液 5pl dNTP混合物(各2.5mM) 5^1
Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0，
ddH20 37，
PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性2 min; 94。C30s，58。C30s,72。C30s，共20個 循環(huán)；72。C7min; 4°C。
pE/L、 p7.5及下游LacZPCR擴增片段延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進行純化回收，回收產(chǎn)物BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))。轉(zhuǎn)移質(zhì) 粒pSKB8R載體BgLII酶切(Takara公司產(chǎn))。用Omega公司E.Z.N.A. Gel Extraction Kit進行電泳純化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司產(chǎn))連接構(gòu) 建pSKB8RlacZ。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO，涂含氨節(jié)青霉 素的LB平板，37'C培養(yǎng)12-16小時。提取質(zhì)粒，用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切 分析鑒定，酶切鑒定結(jié)果分別參見圖3。
4轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8Rneo的構(gòu)建
即在pSKB8R左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段外側(cè)插入 痘苗病毒啟動子序列pH6及下游Neo序列。以質(zhì)粒pVI75為模板擴增痘苗病 毒啟動子序歹UpH6及下游Neo序歹!j(引物NeoF， NeoR)， BamHI、 SacII酶切 pH6+Neo片段、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RBamHI、 SacII酶切，二者T4DNALigase 連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RNeo 。 弓|物NeoF :cgcggatcctcgatccccagattacaaacaactagg ， 弓l 物 NeoR :
tccccgcggacagatttctccgtgatagggatcg
pH6及下游Neo序列PCR擴增反應(yīng)采用大連寶生物工程有限公司的試 劑盒，反應(yīng)體系如下
質(zhì)粒 lpl 正、反向引物(NeoF， NeoR) 各lpl 10xPyrobest緩沖液 5^1 dNTP混合物(各2.5mM) 5^1 Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5^1 ddH20 37，
PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性2 min; 94°C30s,58°C30s,72°C60s，共20個 循環(huán)；72。C7min; 4°C。
pH6及下游Neo序列PCR擴增片段延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進行純化回收，回收產(chǎn)物SacII/BamHI酶切(Takam公司產(chǎn))。 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R載體SacII/BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))。用Omega公司 E.Z.N.A. Gel Extraction Kit進行電泳純化回收.。二者T4DNALigase(Takara 公司產(chǎn))連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RNeo。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿 菌ToplO，涂含氨芐青霉素的LB平板，37'C培養(yǎng)12-16小時。提取質(zhì)粒，用 相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析鑒定，酶切鑒定結(jié)果分別參見圖4。
5轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RPNeo的構(gòu)建
即在pSKB8RNeo左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段間插 入兩個互為反向的痘苗病毒啟動子序列pE/L、 p7.5。以質(zhì)粒pSC65為模板 擴增痘苗病毒啟動子序列pE/L、 p7.5及多克隆位點。pE/L、 p7.5及多克隆 位點擴增片段(引物PMF， PMR)以BamHI酶切、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R以BgLH 酶切，二者T4DNALigase連接構(gòu)建pSKB8RP。質(zhì)粒pSKB8RPSacII/BamHI 酶切，pH6及下游Neo序列PCR擴增片段延伸產(chǎn)物用SacII/BamHI酶切 (Takara公司產(chǎn))，二者T4DNALigase連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RPNeo。 PMF: cgggatccgtcgacttcgaacttattt PMR: cgggatcccccgggctcgagttatgatctt pE/L、 p7.5及多克隆位點擴增片段PCR擴增反應(yīng)采用大連寶生物工程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下: 質(zhì)粒pSC65
正、反向引物(PMF， PMR) 10xPyrobest緩沖液 dNTP混合物(各2.5mM) Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml)
1|J 5^1
5^1 37，
ddH20
PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性2 min; 94°C30s,58°C30s，72°C30s，共20個 循環(huán)；72。C7min; 4°C。
pE/L 、 p7.5及多克隆位點擴增片段延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進行純化回收，回收產(chǎn)物BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))。轉(zhuǎn)移質(zhì) 粒pSKB8R載體BglII酶切(Takara公司產(chǎn))。用Omega公司E.Z.N.A. Gel Extraction Kit進行電泳純化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司產(chǎn))連接構(gòu) 建pSKB8RP。
質(zhì)粒pSKB8RP SacII/BamHI酶切，pH6及下游Neo序列PCR擴增片段(如前) 用SacII/BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))，二者T4DNALigase連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pSKB8RPNeo。圖5。
實施例二 B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTTAB8RlacZ的構(gòu)建。 圖6。
將痘苗病毒天壇株VTT與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源 重組，經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的 重組病毒VTT厶B8RlacZ。以0.1 0.01PFU/cell病毒量VTT752-l感染80。/。成 片CEF細胞吸附l 1.5h后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)(參照美國INVITROGEN 公司Lipofectin試劑盒)將重組質(zhì)粒pSKB8RLacZ轉(zhuǎn)染CEF細胞中。48小時 后收獲重組病毒液，用含200 )ig/mlX-gal營養(yǎng)瓊脂鋪斑，隨機挑取孤立藍 斑病毒，連續(xù)單斑純化5代，以待鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重 組病毒VTTAB8RlacZ。
提取DNA，進行PCR擴增及DOTBLOT鑒定、檢測重組病毒B8R基因缺失 的穩(wěn)定性，表明VTTAB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因缺失穩(wěn)定。VTTAB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代插入外源基因lacZ穩(wěn) 定表達。VTTAB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代，VTTAB8RlacZ傳 代第5、 15代分別感染CEF細胞，檢測其樣品中(3-半乳糖苷酶活性，同時設(shè) 立VTT感染細胞對照。第5代J3-半乳糖苷酶活測定OD420nJl為3.027，第15 代0042。肌值為2.819。 VTT感染細胞對照OD42Q肌值為0.04。結(jié)果表明 VTTAB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代插入外源基即acZ穩(wěn)定表達.(圖 7，圖8)和表l。
表l
5passegeVTTAB8尺lacZ15passegeVTT厶B8RlacZVTT
0.D420nm3.0272.8190.04
重組缺失病毒VTTAB8RlacZ在CEF、 TK'143、 CV-1細胞中的繁殖生長曲 線測定，結(jié)果表明VTTAB8RlacZ的生長曲線與VTT生長曲線相似(圖90。 B8R基因缺失對重組缺失病毒在細胞中的繁殖復(fù)制沒有影響。兔皮內(nèi)毒力 實驗表明VTT752-l形成紅腫痘皰面積顯著大于VTTAB8RlacZ形成痘皰， VTT752-1形成紅腫痘皰而后出現(xiàn)潰破接痂，VTTAB8RlacZ形成痘皰無潰 破接痂，VTTAB8RlacZ形成痘皰消褪較VTT752-l形成痘皰消褪早。B8R 基因缺失顯著降低痘苗病毒天壇株病毒毒力。見圖IO。
實施例三B8R基因缺失表達HIV-l抗原的VTKgpe厶B8RlacZ (B8R基因 缺失為lacZ所取代，TK區(qū)插入B，/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)
的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗。
即將VTKgpe (TK區(qū)插入B7C型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天壇株 重組痘苗病毒)與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組,經(jīng) 藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為IacZ所取代的重組病 毒VTKgpeAB8RlacZ 。以0.1 ~0.01 PFU/cel1病毒量VTKgpe感染80%成片 CEF細胞吸附l 1.5h后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)(參照美國INVITROGEN公 司Lipofectin試劑盒)將重組質(zhì)粒pSKB8RLacZ轉(zhuǎn)染CEF細胞中。48小時后收獲重組病毒液，用含200嗎/ml X-gal營養(yǎng)瓊脂鋪斑，隨機挑取孤立藍斑 病毒，連續(xù)單斑純化5代，以待鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組 病毒VTKgpeAB8RlacZ
提取DNA，進行PCR擴增及DOTBLOT鑒定、檢測重組病毒B8R基因缺失 的穩(wěn)定性，表明VTKgpeAB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因 缺失穩(wěn)定。VTKgpeAB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代插入外源基 因gagpol env禾急定表達。
實施例四B8R基因缺失、表達HIV-l抗原的VTKgpeAB8R (B8R基因缺 失不帶lacZ選擇標記，TK區(qū)插入B，/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)
的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗。
再以VTKgpeAB8RlacZ為親本株與pSKB8RNeo共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源 重組,經(jīng)G418壓力篩選、藍白斑篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺 失不帶lacZ選擇標記的重組病毒VTKgpeAB8R。以0.1 0.01PFU/cell病毒量 VTKgpeAB8RlacZ感染8(P/。成片CEF細胞吸附l 1.5h后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 技術(shù)(參照美國INVITROGEN公司Lipofectin試劑盒)將重組質(zhì)粒 pSKB8RNeo轉(zhuǎn)染CEF細胞中。48小時后收獲重組病毒液，以400ug/mlG418 壓傳三代。用含200昭/mlX-gal營養(yǎng)瓊脂鋪斑，隨機挑取孤立白斑病毒， 連續(xù)單斑純化5代，以待鑒定獲得B8R基因缺失不帶lacZ選擇標記的重組病 毒VTKgpeAB8R。
提取DNA，進行PCR擴增及DOTBLOT鑒定、檢測重組病毒B8R基因缺失 的穩(wěn)定性，表明VTKgpe厶B8R在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因缺失 穩(wěn)定。VTKgpeAB8R在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代插入外源基因gagpo1 env禾急定表達。
裸鼠毒力實驗表明VTKgpeAB8R毒力較VTKgpe顯著降低，腹腔接種VTT (104pfii)及VTKgpe (1()6pfii)15天裸鼠死亡，接種VTKgpeAB8R(l()7pfij)裸 鼠存活(表2)。胞內(nèi)IFN-Y.染色流式細胞儀分析、T淋巴細胞增殖、CTL 檢測顯示B8R基因缺失顯著提高表達HIV-1基因的天壇株重組痘苗病毒特 異性細胞免疫(圖n， 14， 15)。表2
VirusDose (pfu>Number of death
VTT1020/4
1031/4
1044/4
VTKgpe1040/4
1050/4
1063/4
VTKgpe厶B服1050/4
1060/4
1070/4
實施例五PCR擴增檢測重組病毒VTKgpeAB8R B8R基因缺失。Western blot檢測VTKgpeAB8R傳代15代插入外源基因gagpo1 env穩(wěn)定表達
提取重組病毒DNA為模板,以引物B8RLF、 B8RRR進行PCR擴增。重組病 毒VTKgpeAB8R由于B8R基因缺失，PCR擴增出1244 bp片段，包括B8R基 因外左側(cè)同源序列B8RL片段583bp、右側(cè)同源序列B8RR片段661 bp。而 對照VTTDNA為模板擴增出2Kb片段，包括B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL 片段583 bp、 B8R基因818bp、右側(cè)同源序列B8RR片段661 bp (圖ll)。 結(jié)果表明VTKgpeAB8R在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失。 Dot Blot檢測病毒VTKgpeAB8R基因組中B8R基因，提取痘苗病毒 VTT752-lDNA及重組病毒VTKgpeAB8R傳代15代DNA，以B8R基因地高 辛標記探針進行Dot Blot檢測。VTT752-lDot Blot結(jié)果顯示雜交印跡斑 點，VTKgpeAB8R傳代15代Dot Blot結(jié)果未顯示雜交印跡斑點，表明 VTKgpeAB8R在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失。見圖12。 VTKgpeAB8R感染CEF細胞，48小時后收獲細胞和上清，以人多抗血清 (美國國立衛(wèi)生研究院艾滋病研究和參比試劑項目提供)進行Westem
17Blot分析，出現(xiàn)了特異的反應(yīng)條帶(gpl40,p55)說明所構(gòu)建的疫苗可以正確 的表達目的基因(圖16)。
實施例六、重組痘苗病毒艾滋病疫苗的效果實驗
本例中使用無菌飼養(yǎng)的6 —8周齡BALB/c(H-2d)雌性小鼠(體重19一25 克，購自中國藥品生物制品檢定所)檢測本發(fā)明疫苗的效力。各DNA疫苗 用lxPBS制備成lmg/ml的注射液。每種免疫組含10只小鼠。免疫前24小時 每只小鼠左右后肢脛骨前肌各注射50ul 25% (w/v)蔗糖高滲溶液以增加 肌肉細胞的通透性，提高攝取質(zhì)粒效率，同時，蔗糖還有一定的佐劑的作 用。蔗糖處理24小時后，脛骨前肌注射DNA 100ug/只(每后肢50ug)。每 間隔2周以同樣劑量加強免疫3次。第6周時1， 2組分別用VTKgpeAB8R 、 VTKgpe重組痘苗病毒加強，1(^pfti/鼠。第4,6周時3，4組分別用 VTKgpeAB8R 、 VTKgpe重組痘苗病毒免疫，1(fpfU/鼠。在第9周時取血 清及脾淋巴細胞檢測抗體以及細胞因子。對照使用pCDN A空載體、不插 入目的基因的痘苗病毒天壇株(天花疫苗，由北京生物制品所惠贈)以及 空白鼠對照(表3)。
表3
0 week2 week4 week6 week
DNA+ VTKgpeAB8RpcDNA-syngag, pcDNA-ngp120pcDNA陽syngag, pcDNA-ngp120pcDNA-syngag, pcDNA-ngp120VTKgpe厶B8R
VTKgpeAB服VTKgpeAB8RVTKgpe厶B8R
DNA+ VTKgpepcDNA-syngag, pcDNA，120pcDNA-syngag, pcDNA-ngp120pcDNA-syngag, pcDNA-ngp120VTKgpe
VTKgpeVTKgpeVTKgpe
VTTVTTVTT
DNA+VTTpcDNApcDNApcDNAVTT
18相關(guān)實驗及結(jié)果如下-
1、血清Gag特異性抗體IgG水平的檢測
為檢測不同重組痘苗病毒單獨免疫和加強免疫所誘導(dǎo)的特異性體液
免疫水平，在第四次免疫后兩周及取小鼠血清，用GagP55抗原(美國國立 衛(wèi)生研究院艾滋病研究和參比試劑項目惠贈)包被酶標板，間接ELISA法進 行Gag特異性IgG抗體水平的檢測。各免疫組Gag特異性IgG抗體滴度列于 表4。
表4
DNA + VTKgpeDNA + VTKgpAB8RVTKgAB8RVTKgpe
3 week35481316222560021134
4 week31622512002560025600
2、流式細胞儀檢測體外抗原表位肽剌激后分泌1 1^1的€08+ T淋巴細胞 CD8+T淋巴細胞是一種最重要的抗病毒效應(yīng)細胞，所以檢測了免疫后 脾淋巴細胞中分泌IFN-Y的HIV-1特異性CD8+ T淋巴細胞。脾淋巴細胞用 MHC-I限制性HIV (gag p24(AMQILKDTI), V3(SIRIGPGQTF YATGD ) and pol (NPDIVIYQYMDDLYVGSDL， YMDDLYVGSDLEIGQHRTK, KEPPFLWMGY ELHPDKWTV )刺激12小時后，對細胞內(nèi)IFN-Y和CD8， CD3分子進行染色，流式細胞儀(貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品)進行分析。 DNA + VTKgpeAB8R免疫組小鼠脾細胞T淋巴細胞，分泌圧^丫的€08+ T 淋巴細胞占脾臟總CD8+T淋巴細胞的百分比數(shù)顯著高于DNA +VTKgpe免 疫組。VTKgpeAB服免疫組小鼠脾細胞分泌IFNi.CD8百分比數(shù)顯著高于 VTKgpe免疫組。
實施例七、B8R基因缺失、表達乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的(B8R 基因缺失插入HBSAg抗原，TK區(qū)插入IL-2基因)的天壇株重組痘苗病毒 的乙型肝炎病疫苗的構(gòu)建。
構(gòu)建過程將重組痘苗病毒VTKIL-2 ( TK區(qū)插入IL-2基因)與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組，經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTKIL-2AB8RlacZ。將HBSAg基因插入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PSKB8RPNeo中(PSKB8RPNeoSaLI酶切補平，T4DNA連接酶連接HBSAg基因與PSKB8RPNeo)構(gòu)建質(zhì)粒PSKB8RPSNeo，HBSAg基因置于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒痘苗病毒啟動子下。將VTKIL-2AB8RlacZ與PSKB8RPSNeo共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組,經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因，缺失lacZ為HBSAg基因所取代的重組病毒VTKIL-2AB8RS。具體方法參見前述的方法。
權(quán)利要求
1.一種天壇株重組痘苗病毒減毒載體，其是B8R基因缺失的天壇株重組痘苗病毒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中缺失的B8R基因為lacZ所取代。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其為天壇株重組痘苗病毒 VTTAB8RlacZ，其構(gòu)建方法包括以下步驟構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ; 將痘苗病毒天壇株VTT與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同 源重組，經(jīng)藍白斑篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失且為lacZ 所取代的天壇株重組痘苗病毒減毒載體VTTAB8RlacZ。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ是在質(zhì)粒 pBR-SK中插入B8R基因左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR 片段、痘苗病毒啟動子序列pE/L、 p7.5以及LacZ基因序列得到的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ中的痘苗 病毒啟動子序列pE/L、 p7.5及下游LacZ序列來源于pSC65， pSC65的保 藏號是CGMCCNo.1097。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其為VTTAB8R。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的載體在制備重組痘苗病毒疫苗中 的應(yīng)用。
8. —種天壇株重組痘苗病毒艾滋病疫苗，其是通過在根據(jù)權(quán)利要求1 至6任一項所述的載體中表達HIV-1抗原而獲得的。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的艾滋病疫苗，其中所述HIV-1抗原是單價或 多價的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的艾滋病疫苗，其中所述HIV-1抗原是HIV-1 gagpol禾口 env基因。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8至io任一項所述的艾滋病疫苗，其中所述mv-i抗原是插入TK區(qū)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的艾滋病疫苗，其為重組痘苗病毒 VTKgpeAB8RlacZ，其構(gòu)建方法包括以下步驟轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ 與TK區(qū)插入HIV-1 CN54株gagpol和env基因的天壇株重組痘苗病毒VTKgpe進行同源重組，經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因 缺失為lacZ所取代的重組痘苗病毒VTKgpeAB8RlacZ。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的艾滋病疫苗，其為重組痘苗病毒 VTKgpeAB8R，其構(gòu)建方法包括以下步驟轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RNeo與權(quán)利 要求12所述的重組病毒VTKgpeAB8RlacZ再次同源重組，獲得B8R基 因缺失不帶lacZ選擇標記，TK區(qū)插入HIV-1CN54株gagpol和env基因 的天壇株重組痘苗病毒艾滋病疫苗VTKgpeAB8R。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的艾滋病疫苗，其中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RNeo 是在pBR-SK中插入左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段, 并在同源序列外側(cè)插入痘苗病毒啟動子序列pH6及Neo基因序列的一種 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項所述的艾滋病疫苗，其中VTKgpe 的保藏號為CGMCCNo. 1099。
16. —種天壇株重組痘苗病毒疫苗，其是通過在根據(jù)權(quán)利要求1至6 任一項所述的載體中表達外源基因而獲得的。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其中所述外源基因是病毒抗原基因。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其中在B8R基因缺失區(qū)插入外源 基因。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項所述的疫苗，其中所述病毒抗原 是單價或多價的。
20. —種天壇株重組痘苗病毒乙型肝炎病疫苗，其是通過在根據(jù)權(quán)利 要求1至6任一項所述的載體中表達乙型肝炎病毒抗原而獲得的。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的乙型肝炎病疫苗，其中所述乙型肝炎病毒 抗原是HBSAg。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的乙型肝炎病疫苗，其中缺失的B8R 基因為HBSAg基因所取代。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的乙型肝炎病疫苗，其中在TK區(qū)插入IL-2基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及IFN-γ受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒減毒載體以及基于此載體構(gòu)建的表達HIV-1各種抗原(單價及多價)的IFN-γ受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒艾滋病疫苗，一種天壇株重組痘苗病毒recombinant vaccinia virius VTKgpe毒recombinant vacciniavirus VTKgpe CGMCC.NO.1099和另外一種乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的天壇株重組痘苗病毒的乙型肝炎病疫苗。本發(fā)明在制備治療病毒病的重組痘苗病毒疫苗藥物中的應(yīng)用有著重要的意義。
文檔編號A61K39/275GK101671695SQ20091015778
公開日2010年3月17日 申請日期2004年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者穎 劉, 邵一鳴, 薇 黃 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心