專利名稱：一種調(diào)節(jié)肝細(xì)胞糖原含量的方法及藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)肝細(xì)胞糖原含量的方法及藥物，具體地說是利用抵抗素與胰
島素受體結(jié)合使血糖上升的特性制備而成的調(diào)節(jié)肝糖原含量的藥物。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見的代謝性疾病，由于體內(nèi)胰島素絕對或相對不足引起血中葡萄 糖濃度的升高，進(jìn)而導(dǎo)致一系列的臨床癥狀。近年來，隨著生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病 率正逐年升高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2000年糖尿病患病總?cè)藬?shù)為1.43億。專家們預(yù)測到2010年糖尿 病患者將增加至2. 2億，2025年將突破3億。目前，全世界有6%的人正遭受著糖尿病的折 磨，而且這個(gè)群體仍在不斷壯大，這一嚴(yán)峻的事實(shí)不容忽視。 糖尿病主要分為三型1型糖尿病、2型糖尿病及妊娠糖尿病。l型糖尿病是一種 細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。致敏的T淋巴細(xì)胞攻擊破壞胰島B細(xì)胞，使胰島素分泌嚴(yán)重 不足。該病起病早，發(fā)病人數(shù)約占糖尿病總?cè)藬?shù)的10%。另有90-95%的糖尿病病人屬于 2型糖尿病。該病多在成年起病，是一種多因素誘發(fā)的疾病，由遺傳和環(huán)境等多種因素相互 作用所導(dǎo)致。主要表現(xiàn)為不同程度的胰島素抵抗、胰島素分泌功能受損及葡萄糖的生成增 加。妊娠糖尿病(GDM)是指以往未診斷糖尿病或糖耐量減低的婦女在妊娠期間首次發(fā)生的 糖耐量減低。臨床數(shù)據(jù)顯示GDM的發(fā)病率約為0. 2 2%。 抵抗素(resistin)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的活性多肽，主要由脂肪組織分泌，其 在肥胖患者血中的水平明顯升高。研究發(fā)現(xiàn)該多肽在體內(nèi)及體外能對抗胰島素的作用，介 導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生，因此命名為抵抗素(resistance to insulin, resistin)，被認(rèn)為是 連接肥胖與2型糖尿病的"紐帶"。 (1)抵抗素和抵抗素樣分子家族(Resistin-Like Molecules Family, RELMs)的 發(fā)現(xiàn) 抵抗素于2001年由St印pan等發(fā)現(xiàn)。用噻唑烷二酮類(TZDs)胰島素增敏劑處理 體外培養(yǎng)的3T3-L1脂肪細(xì)胞，通過與正常脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜差異顯示篩選法，St印pan等 發(fā)現(xiàn)了一種新的mRNA，且受TZDs降調(diào)節(jié)，這種mRNA編碼的蛋白質(zhì)被稱為"抵抗素"。隨后， 抵抗素樣分子家族的其它成員也被逐一發(fā)現(xiàn)，包括RELMa和RELMP。它們與抵抗素具有 相似的結(jié)構(gòu)特征，例如羧基端具有獨(dú)特的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)，由3個(gè)共同的結(jié)構(gòu)域組成等 等。在鼠類，已發(fā)現(xiàn)3種RELMs蛋白。但是在人類，迄今僅發(fā)現(xiàn)2種RELMs蛋白抵抗素和 RELM P 。 (2)抵抗素的結(jié)構(gòu)特征 人類抵抗素基因位于19號染色體上，小鼠和豬的抵抗素基因分別定位于12號和 2號染色體。St印pan等報(bào)道抵抗素由108個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為12. 5kDa。最近研 究發(fā)現(xiàn)人類抵抗素由108個(gè)氨基酸殘基組成，而大鼠和小鼠抵抗素由114個(gè)氨基酸殘基組 成，豬抵抗素含109個(gè)氨基酸殘基。抵抗素富含半胱氨酸殘基，占全部氨基酸殘基的12%。 由二硫鍵連接形成同源二聚體，N端26位上的半胱氨酸殘基是形成同源二聚體所必須的，此半胱氨酸的突變將導(dǎo)致抵抗素多肽以單體形式分泌。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種降血糖藥物。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案 —種調(diào)節(jié)肝細(xì)胞中糖原含量的方法，該方法為促進(jìn)或抑制抵抗素與肝細(xì)胞膜上抵 胰島素受體的結(jié)合。 —種基于權(quán)利要求1所述方法的降血糖的藥物，其中，該藥物能夠抑制抵抗素和 肝細(xì)胞膜上胰島素受體的結(jié)合。 上述的降血糖的藥物，其中，該藥物能夠阻斷胰島素受體上的抵抗素結(jié)合位點(diǎn)。
上述的降血糖的藥物，其中，該藥物能夠阻斷抵抗素上的胰島素受體的結(jié)合位點(diǎn)。
—種基于權(quán)利要求1所述方法的升血糖的藥物，該藥物能夠促進(jìn)抵抗素和肝細(xì)胞 膜上胰島素受體的結(jié)合。 本研究發(fā)現(xiàn)，抵抗素對胰島素受體(IR)和葡萄糖激酶(GK)蛋白水平的影響由于 IR和GK是糖原合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，我們考察了抵抗素和胰島素處理后的肝細(xì)胞IR和GK 蛋白水平。Western Blot分析顯示，經(jīng)100ng/ml抵抗素處理24小時(shí)后的胰島素受體水平 略有降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(control group :100. 00±25. 48% ;resistin_treated group: 92. 11±25.48% )。胰島素或胰島素加葡萄糖也會是IR略有降低，而當(dāng)含有抵抗素時(shí)都 明顯下降(Insulin :117. 28±25. 48%， resistin+insulin :65. 45±25. 48%， *P < 0. 05 ; i固lin+glucose :123. 09±25. 48 %， resistin+i固lin+glucose :63. 21±25. 48 %，承P < 0. 05)。單獨(dú)使用胰島素或抵抗素，會使GK的蛋白水平輕微的增加，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (n = 6， *P < 0. 05) 抵抗素單獨(dú)作用于肝細(xì)胞，肝細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)的表達(dá)下降但沒有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在胰島素存在的條件下，抵抗素可以明顯降低GLUT2的表達(dá)。研究同時(shí)發(fā) 現(xiàn)，抵抗素單獨(dú)處理肝細(xì)胞后，糖原磷酸化酶(GP)的表達(dá)沒有變化，但當(dāng)有胰島素存在的 條件下，抵抗素可以明顯提高GP的活性。 本研究中使用的抵抗素購自深圳晶美生物工程有限公司北京分公司，批號為 111229 L2006。 我們對比了用100ng/ml抵抗素孵育含或不含lOOnM胰島素的肝細(xì)胞后糖原含量 的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用100ng/ml抵抗素處理原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞24h后，與對照組相比， 基礎(chǔ)狀態(tài)下肝糖原含量有所下降，但是尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(對照組100. 00±3. 58% ;抵抗素 組87±7.00%)。胰島素剌激下的糖原含量則明顯減少，較對照組減少了約45%，有顯著 性差異(對照組134. 33±4. 51% ;抵抗素組73. 33±13. 65% )。這表明抵抗素對肝細(xì)胞 糖原代謝具有一定的影響，使胰島素剌激狀態(tài)下的糖原含量降低。 為了考察抵抗素對肝糖原代謝的影響是否是靠改變GLUT2， GK， GS和GP的mRNA水 平，我們用Real-Time PCR的方法分析了這些基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明抵抗素不改變GK 和GP的基因表達(dá)水平，但會改變GLUT2和GS的mRNA水平。 抵抗素對大鼠肝細(xì)胞GK mRNA水平的影響。與對照組相比(第 一 組，無抵 抗素或胰島素作用)，經(jīng)抵抗素作用后GK水平略有降低(resistin :0.890士0.099 ;control :1. 000±0. 000)。在向含有30mM葡萄糖，含或不含抵抗素的培養(yǎng)基中加入胰島 素后GK的mRNA水平繼續(xù)降低(resistin+i固lin :0. 575±0. 417 ;control+i固lin : 0. 585±0. 375)。但各組之間尚未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P < 0. 05) (Figure 3a)。
抵抗素對大鼠肝細(xì)胞GP mRNA水平的影響與對照組相比(第一組，無抵抗素或胰 島素作用)，經(jīng)抵抗素作用后GP水平略有降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(resistin :0.95±0. 283 ; control :1. 000±0. 000)。在向含有30mM葡萄糖，含或不含抵抗素的培養(yǎng)基中加入胰島 素后GP的mRNA水平繼續(xù)降低(resistin+insulin :0. 680±0. 255 ;control+insulin : 0. 710±0. 339)。但仍然沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P < 0. 05) (Figure3b)。
抵抗素對大鼠肝細(xì)胞GLUT2mRNA水平的影響與對照組相比(第一組，無抵抗素 或胰島素作用)，在向含有30mM葡萄糖，100ng/ml抵抗素的培養(yǎng)基中加入胰島素后GLUT2 的mRNA水平顯著降低(resistin+insulin :0. 370±0. 141 ;control :1. 000±0. 000 ;*p < 0. 05)，同時(shí)不含抵抗素的對照組GLUT2的mRNA水平也顯著降低(control+insulin :
0. 515±0. 120 ;control :1. 000±0. 000 ;*p < 0. 05);抵抗素單獨(dú)作用的肝細(xì)胞中GLUT2 的mRNA水平也略有降低，但尚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(resistin :0. 925±0. 120 ;control :
1. 000±0. 000)。在兩個(gè)抵抗素作用組之間，GLUT2的mRNA水平在胰島素加入后繼續(xù)顯 著下降(resistin+insulin :0. 370±0. 141 ;resistin :0. 925±0. 120 ;*p < 0. 05)。 另 外，有胰島素作用的兩組間，抵抗素使GLUT2的mRNA水平降低，但尚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (resistin+i固lin :0. 370±0. 141 ;control+i固lin :0. 515±0. 120)。 抵抗素對大鼠肝細(xì)胞GS mRNA水平的影響與對照組相比(第一組，無抵抗素或胰 島素作用)，經(jīng)抵抗素作用后GS的mRNA水平略有降低(resistin :1. 140±0. 141 ;control : 1. 000±0. 000)，而與胰島素組相比呈顯著下降(control+insulin :0. 630±0. 042 ; control :1.000±0. 000 ;*p < 0.05)。與第一組相比，抵抗素和胰島素的共同作用使GS 水平略有降低(resistin+insulin :0. 820±0. 028 ;control :1. 000±0. 000)。在兩個(gè)抵 抗素作用組之間，GS的mRNA水平在胰島素加入后繼續(xù)顯著下降(resistin+insulin: 0. 820±0. 028 ;resistin :1. 140±0. 141 ;*p < 0. 05)。同時(shí)，在有胰島素作用的兩組 間，GS的mRNA水平還有一個(gè)中等程度的增加，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(resistin+insulin: 0. 820±0. 028 ;control+insulin :0. 630±0. 042)。 抵抗素對關(guān)鍵酶活性的影響。為了考察抵抗素是否會影響糖原代謝過程中關(guān)鍵 酶的活性，我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并得到結(jié)果，肝細(xì)胞經(jīng)100ng/ml抵抗素作用24小時(shí)，再經(jīng)30mM 葡萄糖，含或不含lOOnM胰島素的培養(yǎng)基處理1小時(shí)后，除了最后一組有一個(gè)不具有統(tǒng)計(jì) 學(xué)顯著性的活性降低外，GK活性與對照組相似(control :設(shè)為1. 00±0. 00 ;resistin :
0. 99±0. 97 ;insulin :1. 00±0. 82 ;resistin+insulin :0. 74±0. 36)。 肝細(xì)胞經(jīng)100ng/ml抵抗素作用24小時(shí)，再經(jīng)30mM葡萄糖，含或不含100nM胰島 素的培養(yǎng)基孵育1小時(shí)后，抵抗素在沒有胰島素存在時(shí)使GS活性降低了 73% (control :
1. 00±1. 61 ;resistin :0. 37±0. 89 ;P < 0. 05)，而在有胰島素存在時(shí)降低了 16 % (insulin control :0. 90± 1. 58 ;resistin+insulin :0. 75±2. 24 ;P < 0. 05)。 同時(shí)， 我們發(fā)現(xiàn)抵抗素處理后再用胰島素孵育，GS活性雖然也有降低(control :1.00士1.61 ; resistin+insulin :0. 75±2. 24 ;P < 0. 05)，但幅度明顯小于單獨(dú)使用抵抗素時(shí)的降低幅 度(resistin :0. 37±0. 89 ;resistin+insulin :0. 75±2. 24 ;P < 0. 05)。
GP活性受胰島素調(diào)節(jié)；所以我們分別考察了含或不含胰島素時(shí)抵抗素對GP活性的影響。我們的結(jié)果表明，抵抗素在胰島素共同存在是使GP活性升高了60X (control:0. 83±0. 45 ;resistin :1. 39±0. 19 ;P < 0. 05)，但沒有胰島素存在時(shí)GP活性不發(fā)生改變(control :1. 00±0. 48 ;resistin :0. 93±0. 09 ;P < 0. 05)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效益是 現(xiàn)有技術(shù)并不清楚抵抗素是如何使血糖上升的，本領(lǐng)域技術(shù)人員一直認(rèn)為抵抗素作用于肌肉或脂肪，經(jīng)過研究，我們首次發(fā)現(xiàn)了抵抗素作用于肝細(xì)胞膜上的胰島素受體，與胰島素受體結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)肝糖原下降，血糖上升，通過該特性我們可以進(jìn)一步開發(fā)新的以抵抗素為靶點(diǎn)或以肝臟上的胰島素受體為靶點(diǎn)的降糖藥物，其降糖作用更直接，降糖效果更好。 下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并非對發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
圖1為抵抗素對肝細(xì)胞肝糖原含量的影響。 圖2a為抵抗素對大鼠肝細(xì)胞GK mRNA水平的影響。 圖2b為抵抗素對大鼠肝細(xì)胞GP mRNA水平的影響。 圖2c為抵抗素對大鼠肝細(xì)胞GLUT2 mRNA水平的影響。 圖2d為抵抗素對大鼠肝細(xì)胞GS mRNA水平的影響。 圖3a為不同實(shí)驗(yàn)條件下胰島素受體的表達(dá)情況，電泳圖譜。 圖3b為不同實(shí)驗(yàn)條件下胰島素受體的表達(dá)情況。 圖3c為抵抗素對葡萄糖激酶表達(dá)的影響。 圖3d為抵抗素對葡萄糖激酶表達(dá)的影響，電泳圖譜。 圖4a :抵抗素對肝細(xì)胞GK活性的影響。 圖4b :抵抗素對肝細(xì)胞GS活性的影響。 圖4c :抵抗素對肝細(xì)胞GP活性的影響。 圖5 :抵抗素在肝糖原代謝中的作用。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 :
—.材料和方法( — )大鼠肝細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng) Sprague-Dawley雄性大鼠，體重約200_250g，采用兩步法膠原酶原位灌流分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。4t:預(yù)冷的清洗液低溫清洗細(xì)胞3遍后去掉死細(xì)胞等物質(zhì)。用臺盼藍(lán)法計(jì)算細(xì)胞活率，每次實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞活率均高于90%。用含20%胎牛血清的低糖DMEM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，鋪散細(xì)胞于塑料培養(yǎng)皿，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37°C ， 5% C02) 6小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，換成含或不含100ng/ml抵抗素的培養(yǎng)基繼續(xù)處理細(xì)胞24小時(shí)。
( 二 )抵抗素對原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞糖原代謝的影響
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待肝細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)液，換成含有100ng/ml抵抗素的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，以不含有抵抗素的細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對照。24h后，棄去培養(yǎng)液，換成含有30mM葡萄糖、含或不含100nM胰島素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3h后，胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞于1.5mlE卯endorf管中，PBS洗3遍，用于肝糖原含量的檢測。采用蒽酮法測定肝細(xì)胞中糖原的含量。首先加入100 iU堿溶液于收獲的肝細(xì)胞中，煮沸30min以裂解細(xì)胞，流水冷卻。然后加入含有蒽酮和濃硫酸的顯色液，混勻，煮沸5min。反應(yīng)后的藍(lán)色產(chǎn)物用分光光度計(jì)讀0D620nm的方法定量。用Bradford法測定樣品中蛋白濃度。肝糖原含量按mg glycogen/mg protein的方法表示。(三)抵抗素影響肝細(xì)胞糖原代謝的分子機(jī)制 1. Real-Time PCR檢測肝細(xì)胞中GLUT2、 GK、 GS和GP基因的相對表達(dá)量變化
(1)細(xì)胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 肝細(xì)胞經(jīng)抵抗素(100ng/ml)作用24h，再經(jīng)30mM葡萄糖，含或不含lOOnM胰島素的培養(yǎng)液處理1小時(shí)后，用TRIzol Reagent(Life Technologies, Gibco)提取總RNA。然后按生產(chǎn)商提供的指導(dǎo)使用隨機(jī)引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies,Gibco)制備反轉(zhuǎn)錄cDNA。 (2) Real-Time PCR分析 Real-Time PCR采用SLAN雙通道熒光定量PCR儀進(jìn)行。向各管中加入不含染料2XPCR TaqMix 12. 5 ii 1， 20XEvagreen 1.25iil，25mM MgCl2 1. 0 ii 1 ; 10 ii M各基因正反向引物lyl，對應(yīng)的cDNA各liU。 一管中不加模板用作陰性對照。各管補(bǔ)加水至25iU?；靹?，置于SLAN熒光定量PCR儀中。95°C 5min預(yù)變性后，95。C 15s — 65°C 35s (熒光檢測)，40個(gè)循環(huán)。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。如果在放大過程后熒光強(qiáng)度大于20倍基線強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，則認(rèn)為此熒光信號有效。我們采用相對定量的A ACT法來確定表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用目的mRNA的循環(huán)閾值(CT)與同一樣品中內(nèi)參controlglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH)的CT值之差來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(A CT = CTtogrt_CTCAPDH)。然后進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化為A A CT ( A A CT = A CTGAPDH- A CT)。最后得到mRNA表達(dá)的改變(2 A ACT)。
2. Western blot法檢測肝細(xì)胞中GK、 IR蛋白的表達(dá) 肝細(xì)胞經(jīng)抵抗素(100ng/ml)作用24h，再經(jīng)30mM葡萄糖，含或不含lOOnM胰島素的培養(yǎng)液處理3小時(shí)后收獲細(xì)胞。加入三去污裂解緩沖液4t:裂解30分鐘。經(jīng)4t: lO，OOOg離心10min后吸取蛋白上清。采用Bradford法測定樣品總蛋白濃度。取蛋白液加入等體積的2*SDS凝膠加樣緩沖液，置于沸水浴中煮沸變性10min，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，再低溫電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜(Protran)。用5% (w/v)脫脂奶室溫封閉1 2h后，于4t:分別結(jié)合GK和IR —抗。TBST (或含Tween-20的脫脂奶)漂洗濾膜三次后，加入含堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，最后用TBST(或TBS)徹底漂洗。將膜轉(zhuǎn)移至NBT/BCIP染色試劑中顯色，并用Gel Doc 2000成像儀(Bio-Rad)拍照并掃描光密度值半定量比較。
3.酶活性的檢測
(1)肝細(xì)胞葡萄糖激酶活性的檢測 用預(yù)冷的生理鹽水清洗細(xì)胞后，加入預(yù)冷的勻漿緩沖液。收獲細(xì)胞，4t:放置5h使酶溶出。經(jīng)4。C3，000rpm離心5min后，吸取上清，即為酶粗提液。然后加入等體積的高糖/低糖反應(yīng)緩沖液(含有l(wèi)OOmM或0. 5mM葡萄糖)。反應(yīng)在加入葡萄糖_6_磷酸脫氫酶后立即開始。于3(TC下測定NADAH的生成量10min。酶粗提液總蛋白濃度的測定采用Bradford法，單個(gè)GK活性表示為高糖和低糖組間的活性比，最后各組的GK活性表示為第一組的百分比。 (2)肝糖原磷酸化酶活性的檢測 肝細(xì)胞經(jīng)抵抗素(100ng/ml)作用24h后，棄去培養(yǎng)液。換成含有30mM葡萄糖、含或不含lOOnM胰島素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)lh后，加入抽提緩沖液，4t:放置2h使酶溶出。抽提物經(jīng)4°C 13， OOOrpm離心10min后取上清，即為酶粗提液。加入反應(yīng)緩沖液后開始測定GP活性。反應(yīng)在加入葡萄糖-6-磷酸脫氫酶后立即開始。以未加入酶和糖原的溶液做空白，來校正內(nèi)源性NADH的產(chǎn)生。酶粗提液總蛋白濃度的測定采用Bradford法，GP活性表示為空白對照組(第一組)的百分比。
(3)肝細(xì)胞糖原合酶活性的檢測 肝細(xì)胞經(jīng)抵抗素(100ng/ml)作用24h后，棄去培養(yǎng)液。換成含有30mM葡萄糖、含或不含lOOnM胰島素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)lh后，收獲到抽提緩沖液中，4t:抽提2小時(shí)。然后經(jīng)4。C 13， OOOrpm離心10min后取上清，加入到反應(yīng)緩沖液1中30。C孵育30min。反應(yīng)在加入反應(yīng)緩沖液2后立即開始。于3(TC下測定NADAH的生成量10min。以未加入酶和糖原的溶液做空白，來校正內(nèi)源性NADH的產(chǎn)生。酶粗提液總蛋白濃度的測定采用Bradford法，GS活性表示為空白對照組(第一組)的百分比。
(四)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(；士s)表示，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析。兩組間顯著性比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各組之間顯著性比較采用單因素方差分析(oneiayA麗A)。 二.結(jié)果 1.為了確定抵抗素是否對肝細(xì)胞也有類似于對肌肉和脂肪細(xì)胞的作用，我們對比了用100ng/ml抵抗素孵育含或不含lOOnM胰島素的肝細(xì)胞后糖原含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用100ng/ml抵抗素處理原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞24h后，與對照組相比，基礎(chǔ)狀態(tài)下肝糖原含量有所下降，但是尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(對照組100.00士3. 58% ;抵抗素組87±7.00% )。胰島素剌激下的糖原含量則明顯減少，較對照組減少了約45%，有顯著性差異(對照組134. 33±4. 51%;抵抗素組73. 33±13. 65% )。這表明抵抗素對肝細(xì)胞糖原代謝具有一定的影響，使胰島素剌激狀態(tài)下的糖原含量降低(圖1)。 2.為了考察抵抗素對肝糖原代謝的影響是否是靠改變GLUT2， GK， GS和GP的mRNA
水平，我們用Real-Time PCR的方法分析了這些基因的表達(dá)情況。如圖2所示，結(jié)果表明抵
抗素不改變GK和GP的基因表達(dá)水平，但會改編GLUT2和GS的mRNA水平。 3.抵抗素對大鼠肝細(xì)胞GK mRNA水平的影響。與對照組相比(第一組，無
抵抗素或胰島素作用)，經(jīng)抵抗素作用后GK水平略有降低(resistin :0.890士0.099 ;
control :l.OOO士O.OOO)。在向含有30mM葡萄糖，含或不含抵抗素的培養(yǎng)基中加入胰島
素后GK的mRNA水平繼續(xù)降低(resistin+i固lin :0. 575±0. 417 ;control+i固lin :
0. 585 ±0. 375)。但各組之間尚未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P < 0. 05)(圖2a)。 4.抵抗素對大鼠肝細(xì)胞GP mRNA水平的影響。與對照組相比(第一組，無抵抗素或
胰島素作用)，經(jīng)抵抗素作用后GP水平略有降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(resistin :0. 95±0. 283 ;
8control :1. 000±0. 000)。在向含有30mM葡萄糖，含或不含抵抗素的培養(yǎng)基中加入胰島素后GP的mRNA水平繼續(xù)降低(resistin+insulin :0. 680±0. 255 ;control+insulin :0. 710±0. 339)。但仍然沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P < 0. 05)(圖2b)。
5.抵抗素對大鼠肝細(xì)胞GLUT2mRNA水平的影響。與對照組相比(第一組，無抵抗素或胰島素作用)，在向含有30mM葡萄糖，100ng/ml抵抗素的培養(yǎng)基中加入胰島素后GLUT2的mRNA水平顯著降低(resistin+insulin :0. 370±0. 141 ;control :l.OOO士O. 000;*p < 0. 05)，同時(shí)不含抵抗素的對照組GLUT2的mRNA水平也顯著降低(control+insulin :
0. 515±0. 120 ;control :1. 000±0. 000 ;*p < 0. 05);抵抗素單獨(dú)作用的肝細(xì)胞中GLUT2的mRNA水平也略有降低，但尚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(resistin :0. 925±0. 120 ;control :
1. 000±0. 000)。在兩個(gè)抵抗素作用組之間，GLUT2的mRNA水平在胰島素加入后繼續(xù)顯著下降(resistin+insulin :0. 370±0. 141 ;resistin :0. 925±0. 120 ;*p < 0. 05)。 另外，有胰島素作用的兩組間，抵抗素使GLUT2的mRNA水平降低，但尚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(resistin+insulin :0. 370±0. 141 ;control+i固lin :0. 515±0. 120)。(圖2c) 6.抵抗素對大鼠肝細(xì)胞GS mRNA水平的影響。與對照組相比(第一組，無抵抗素或胰島素作用)，經(jīng)抵抗素作用后GS的mRNA水平略有降低(resistin :1. 140±0. 141 ;control :1. 000±0. 000)，而與胰島素組相比呈顯著下降(control+insulin:0. 630±0. 042 ;control :1. 000±0. 000 ;*p < 0. 05)。 與第 一 組相比，抵抗素和胰島素的共同作用使GS水平略有降低(resistin+insulin :0. 820±0. 028 ;control :1.000±0.000)。在兩個(gè)抵抗素作用組之間，GS的mRNA水平在胰島素加入后繼續(xù)顯著下降(resistin+insulin :0. 820±0. 028 ;resistin :1. 140±0. 141 ;*p < 0. 05)。 同時(shí)，在有胰島素作用的兩組間，GS的mRNA水平還有一個(gè)中等程度的增加，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(resistin+insulin :0. 820±0. 028 ;control+insulin :0. 630±0. 042)。(圖2d)
7.抵抗素對胰島素受體(IR)和葡萄糖激酶(GK)蛋白水平的影響。由于IR和GK是糖原合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，我們考察了抵抗素和胰島素處理后的肝細(xì)胞IR和GK蛋白水平。Western Blot分析顯示，經(jīng)100ng/ml抵抗素處理24小時(shí)后的IR水平略有降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(control group :100. 00±25. 48% ;resistin-treated group :92. 11 ±25. 48% )。胰島素或胰島素加葡萄糖也會是IR略有降低，而當(dāng)含有抵抗素時(shí)都明顯下降(Insulin :117. 28±25. 48 %， resistin+insulin :65. 45±25. 48 %， *P < 0. 05 ;i固lin+glucose :123. 09±25. 48%，resistin+insulin+glucose :63. 21 ±25. 48%， *P < 0. 05，見圖3a、b、c和d)。單獨(dú)使用胰島素或抵抗素，會使GK的蛋白水平輕微的增加，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(n=6， *P < 0. 05) 8.抵抗素對關(guān)鍵酶活性的影響。為了考察抵抗素是否會影響糖原代謝過程中關(guān)鍵酶的活性，我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并得到如圖4所示結(jié)果，肝細(xì)胞經(jīng)100ng/ml抵抗素作用24小時(shí)，再經(jīng)30mM葡萄糖，含或不含lOOnM胰島素的培養(yǎng)基處理1小時(shí)后，除了最后一組有一個(gè)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的活性降低外，GK活性與對照組相似(control :設(shè)為1. 00±0. 00 ;resistin :0. 99±0. 97 ;insulin :1. 00±0. 82 ;resistin+insulin :0. 74±0. 36)(圖4a)。
9.肝細(xì)胞經(jīng)100ng/ml抵抗素作用24小時(shí)，再經(jīng)30mM葡萄糖，含或不含100nM胰島素的培養(yǎng)基孵育1小時(shí)后，抵抗素在沒有胰島素存在時(shí)使GS活性降低了 73%(control :1.00士1.61 ;resistin :0. 37±0. 89 ;P < 0. 05)，而在有胰島素存在時(shí)降低了16% (insulin control :0. 90±1. 58 ;resistin+i固lin :0. 75±2. 24 ;P < 0. 05)。同時(shí)， 我們發(fā)現(xiàn)抵抗素處理后再用胰島素孵育，GS活性雖然也有降低(control :1.00士1.61 ; resistin+insulin :0. 75±2. 24 ;P < 0. 05)，但幅度明顯小于單獨(dú)使用抵抗素時(shí)的降低幅 度(resistin :0. 37±0. 89 ;resistin+insulin :0. 75±2. 24 ;P < 0. 05)(圖4b)。
文獻(xiàn)表明，GP活性受胰島素調(diào)節(jié)；所以我們分別考察了含或不含胰島素時(shí)抵抗素 對GP活性的影響。我們的結(jié)果表明，抵抗素在胰島素共同存在是使GP活性升高了 60% (control :0. 83±0. 45 ;resistin :1. 39±0. 19 ;P < 0. 05)，但沒有胰島素存在時(shí)GP活性不 發(fā)生改變(control :1. 00±0. 48 ;resistin :0. 93±0. 09 ;P < 0. 05)(圖4c)。
圖5為抵抗素在肝臟中的作用示意圖，通過圖5可以看出，通過抵抗素影響肝臟中 肝糖原代謝。高濃度抵抗素可降低肝臟對于胰島素的敏感性，增加肝糖原的分解(通過促 進(jìn)GP的活性)，減少肝糖原合成(通過降低胰島素受體的水平和降低GS的活性)導(dǎo)致細(xì)胞 中肝糖原含量的下降和血糖升高。高血糖癥促進(jìn)胰腺B細(xì)胞分泌胰島素并導(dǎo)致高胰島素血 癥。高胰島素血癥進(jìn)一步導(dǎo)致肝臟等胰島素靶組織中的胰島素抵抗。 根據(jù)上述內(nèi)容我們可以得知，抵抗素對胰島素受體有影響，在胰島素和抵抗素同 時(shí)作用的情況下，胰島素受體表達(dá)下降，可以進(jìn)一步得出，抵抗素在肝臟的結(jié)合位點(diǎn)為胰島 素受體，利用該特性本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過抑制或促進(jìn)抵抗素和肝細(xì)胞膜上的胰島素受 體的結(jié)合來調(diào)控血糖。我們也可以進(jìn)一步開發(fā)出新的調(diào)節(jié)血糖的藥物，如該藥物能夠阻斷 胰島素受體上的抵抗素結(jié)合位點(diǎn)或藥物能夠阻斷抵抗素上的胰島素受體的結(jié)合位點(diǎn)等。上 技術(shù)手段有很多種，不僅限于此一種方式。
權(quán)利要求
一種調(diào)節(jié)肝細(xì)胞中糖原含量的方法，其特征在于，促進(jìn)或抑制抵抗素與肝細(xì)胞膜上胰島素受體的結(jié)合。
2. —種基于權(quán)利要求1所述方法的降血糖的藥物，其特征在于，該藥物能夠抑制抵抗 素和肝細(xì)胞膜上胰島素受體的結(jié)合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的降血糖的藥物，其特征在于，該藥物能夠阻斷胰島素受體上 的抵抗素結(jié)合位點(diǎn)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的降血糖的藥物，其特征在于，該藥物能夠阻斷抵抗素上的胰 島素受體的結(jié)合位點(diǎn)。
5. —種基于權(quán)利要求1所述方法的升血糖的藥物，其特征在于，該藥物能夠促進(jìn)抵抗 素和肝細(xì)胞膜上胰島素受體的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)肝細(xì)胞中糖原含量的方法及基于該方法的調(diào)節(jié)血糖的藥物，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)并不清楚抵抗素是如何使血糖上升的，本領(lǐng)域技術(shù)人員一直認(rèn)為抵抗素作用于肌肉或脂肪，經(jīng)過研究，我們首次發(fā)現(xiàn)了抵抗素作用于肝臟的肝細(xì)胞膜上的胰島素受體，進(jìn)而促進(jìn)血糖上升，通過該特性我們可以進(jìn)一步開發(fā)新的以抵抗素為靶點(diǎn)或以肝臟上的胰島素受體為靶點(diǎn)的降糖藥物，其降糖作用更直接，降糖效果更好。
文檔編號A61P3/10GK101721704SQ20091014773
公開日2010年6月9日 申請日期2009年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日
發(fā)明者牛剛, 譚煥然 申請人:譚煥然;牛剛