專利名稱：構(gòu)樹葉總黃酮提取物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種構(gòu)樹葉提取物及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及一種構(gòu)樹葉總 黃酮提取物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
構(gòu)樹(5TOuwo"e"a; fl/^n/era(L.) Ven.t)為?？茦?gòu)樹屬植物，在我國大部分J;也 區(qū)有分布，日本、越南、印度等國亦有分布，資源十分豐富。構(gòu)樹的成熟果實，稱 為"楮實子"，收載于歷版《中國藥典》，為常見中藥，具有補腎清肝、明目利尿 的功效。構(gòu)樹葉又稱為楮葉，性涼味甘，無毒，能清熱利濕，涼血止血，殺蟲解毒， 可用于治療吐血、衄血、血崩、外傷出血、水腫、疝氣、痢疾和癬瘡等。
從20世紀(jì)80年代開始，人們即開始對構(gòu)樹的化學(xué)和藥理進行研究。如高允生 等(高允生，邱玉芳，高聆，等.構(gòu)葉醇提取物與黃酮苷對離體心房的抑制作用[J].中 國藥理學(xué)通報，1988， 4 (2) : 122-123)。另外Lee等從構(gòu)樹的整株植物中分離得 到了多個黃酮類化合物(Lee D， Bhat K， Fong H et al. Aromatase inhibitors from Broussonetiapapyrifera[J〗.丄Nat Prod， 2001， 64 (10) : 1286-1293)對構(gòu)樹葉的乙 醇提取物(BPAE)與總黃酮苷(BPF)對家兔和豚鼠離體心房的作用進行了研究， 發(fā)現(xiàn)BPAE和BPF均有抑制家兔和豚鼠心房收縮的作用，且BPF的效價強度遠大于 BPAE，證明了 BPF是構(gòu)樹抑制心房收縮的主要有效成分，同時也說明了構(gòu)樹葉具 有類似鈣拮抗劑的作用。但目前尚沒有關(guān)于具有抑菌和抗炎作用的構(gòu)樹葉總黃酮的 相關(guān)研究報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)樹葉總黃酮提取物及其制備方法與應(yīng)用。
本發(fā)明提供的制備構(gòu)樹葉總黃酮提取物的方法，包括如下步驟
1) 將構(gòu)樹葉粉碎成粉末；
2) 將所述步驟l)得到的構(gòu)樹葉粉末用乙醇的水溶液進行提取，過濾提取液后 合并濾液，濃縮，得到濃縮液，再對所述濃縮液用脫脂溶劑進行脫脂，得到脫脂濃 縮液；
3) 將所述步驟2)得到的脫脂濃縮液進行分離純化，干燥后，得到所述構(gòu)樹葉 總黃酮提取物。
該方法的步驟l)中，所述構(gòu)樹葉包含葉柄；所述粉末的目數(shù)為2—60目；所述步驟2)中，乙醇的水溶液的體積百分比濃度為0-100%，優(yōu)選40-75°/(/;
所述提取方法為回流提取法、索氏提取法、超聲提取法或閃式提取法，4尤選回 流提取法；回流提取時，提取溫度為乙醇的回流溫度，優(yōu)選50—10(TC，提取次數(shù)為 l一3次，每次提取所用時間為0.5—3小時；所述乙醇的水溶液的用量為所述步驟1) 得到的構(gòu)樹葉粗粉質(zhì)量的6—20倍；所述脫脂溶劑為石油醚或氯仿。
所述步驟2)中，乙醇的水溶液的體積百分比濃度為0-100%，優(yōu)選40-75%;所 述提取方法為回流提取法、索氏提取法、超聲提取法或閃式提取法，優(yōu)選回流提取 法；所述乙醇的水溶液的用量為所述步驟l)得到的構(gòu)樹葉粉末質(zhì)量的6—20倍；
所述步驟3)中，所述分離純化的方法為溶劑萃取法、聚酰胺柱層析法或樹脂 吸附法；
其中，溶劑萃取法包括如下步驟將所述步驟2)得到的脫脂濃縮液用水飽和 的正丁醇或乙酸乙酯進行萃取，萃取完畢后合并正丁醇或乙酸乙酯層萃取液；所述 水飽和的正丁醇或乙酸乙酯的用量為所述步驟2)得到的脫脂濃縮液體積的1/2—2
倍;萃取次數(shù)為l一6次；
所述聚酰胺柱層析法包括如下步驟將所述步驟2)得到的脫脂濃縮液用聚酰
胺色譜柱進行分離，淋洗液依次為水和20—80%的乙醇水溶液，收集20—80%乙醇 水溶液的洗脫液；所述聚酰胺色譜柱中，聚酰胺的用量為所述構(gòu)樹葉原料質(zhì)量的 0.5—2倍；
在分離純化之前，可按照如下方法對聚酰胺色譜柱進行預(yù)處理將聚酰胺在95%
乙醇中浸泡12小時后，回流2小時。過濾，用水清洗多次。裝入柱中，繼續(xù)用水洗
滌至乙醇含量小于1%，即可使用。
所述樹脂吸附法包括如下步驟將所述步驟2)得到的脫脂濃縮液用吸附樹脂
柱進行分離，淋洗液依次為水、20—80%的乙醇水溶液和95%的乙醇水溶液，收集 20—80%乙醇水溶液的洗脫液。
在分離純化之前，可按照如下方法對樹脂吸附柱進行預(yù)處理將樹脂先用95%
乙醇(樹脂乙醇的體積比為l: 2)浸泡12小時，回流2小時，然后裝入樹脂柱。
加入高于樹脂層10厘米的95%乙醇浸泡2小時，放出浸液，至洗滌液在試管中加水 稀釋(1毫升洗滌液加4毫升水)不混濁并且洗脫液紫外光譜掃描不得檢出吸收峰為 止。再用水洗滌至乙醇含量小于1%，即可使用。
所述吸附樹脂柱中，樹脂的型號為D101或AB-8，所述樹脂的用量為所述構(gòu)樹 葉原料質(zhì)量的0.5—2倍。
所述干燥方法選自下述方法中的一種或兩種減壓干燥法、冷凍法和噴霧干燥法。上述干燥方法均為常規(guī)操作。
另外，按照上述方法制備得到的構(gòu)樹葉總黃酮提取物，及該提取物在制備抑菌 和抗炎藥物中的應(yīng)用，以及以該提取物為活性成分的抑菌和抗炎藥物，也屬于本發(fā) 明的保護范圍。
本發(fā)明提供的方法制備所得構(gòu)樹葉總黃酮提取物，按照比色法測定的總黃酮的 重量含量為20% 70%，收率為1% 30%。經(jīng)藥理試驗證明，該構(gòu)樹葉總黃酮提取 物可單獨或與其它藥物組合作為原料藥應(yīng)用于具有抑菌和抗炎藥物的制劑中。該方 法制備所得構(gòu)樹葉總黃酮的純度高，方法簡便實用，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式
本發(fā)明中，采用下述文獻報道的比色法對總黃酮含量進行測定遲玉新，竇德
強.楮實子與構(gòu)樹葉中總黃酮的含量測定.中國現(xiàn)代中藥2008， 10(11) : 16-17。該
方法的簡要操作過程如下精密稱取一定量的總黃酮提取物，制備樣品溶液。加
Al(N03)3/NaN02試液顯色，以式I所示蘆丁為對照品，于505 nm處進行比色測定。 根據(jù)吸光度值的測定，即可計算得到構(gòu)樹葉中總黃酮的含量。
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(式I)
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。 本發(fā)明中所述乙醇水溶液的濃度均為體積百分比濃度。 實施例1、制備構(gòu)樹葉總黃酮
用溶劑提取法和溶劑萃取法制備構(gòu)樹葉總黃酮
將目數(shù)為30目的構(gòu)樹葉(含葉柄)粉末lkg，用60%的乙醇水溶液回流提取2 次，每次用10倍體積量的上述60%乙醇水溶液提取2小時，合并提取液，回收乙醇 溶液，濃縮至小體積(無醇味)，先用濃縮液一半體積量的石油醚脫脂，萃^i至近 無色。然后經(jīng)水飽和的等量正丁醇或乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，減壓^農(nóng)縮回 收正丁醇或乙酸乙酯得到浸膏；將浸膏經(jīng)減壓干燥得總黃酮提取物。
正丁醇萃取所得提取物為125g，測得總黃酮為53g，在浸膏中重量百分比為42.4%，占構(gòu)樹葉原料藥材總重的百分比即收率為5.3%;乙酸乙酯萃取所得提取物 為80g，測得總黃酮為45g，在浸膏中重量百分比為56.2%，占構(gòu)樹葉原料藥材總重 的百分比即收率為4.5%。
實施例2、制備構(gòu)樹葉總黃酮
用溶劑提取法和聚酰胺柱層析法制備構(gòu)樹葉總黃酮
將目數(shù)為45目的構(gòu)樹葉粉末1 kg，用60%的乙醇水溶液回流提取2次，每次用 10倍體積量的上述60%乙醇水溶液提取2小時，合并提取液，回收乙醇溶液，濃縮 至小體積，采用小體積濃縮液一半體積量的石油醚脫脂，萃取至近無色。脫脂后溶 液經(jīng)按照常規(guī)方法預(yù)先處理過的聚酰胺層析柱進行分離，依次用水、95%的乙醇水 溶液進行洗脫，水洗脫除雜質(zhì)，收集95%的乙醇水溶液的洗脫液，減壓回收乙醇， 干燥得總黃酮提取物80g，測得總黃酮為45g，占所述干燥后的總黃酮提取物的重量 百分比為56.2%，占構(gòu)樹葉原料藥材總重的百分比即收率為4.5%。
實施例3、制備構(gòu)樹葉總黃酮 溶劑提取法和樹脂吸附法制備構(gòu)樹葉總黃酮-
將目數(shù)為60目的構(gòu)樹葉粉末1 kg，乙醇的體積百分含量為60%的乙醇水溶液回 流提取2次，每次用10倍體積量的上述60%乙醇水溶液提取2小時，合并提取液， 回收乙醇溶液，濃縮至小體積，經(jīng)小體積濃縮液一半量的石油醚萃取后得脫脂溶液。 脫脂溶液經(jīng)已預(yù)先處理過的D101大孔吸附樹脂柱，依次用水、65%的乙醇水溶液、 95%的乙醇水溶液進行洗脫，65%的乙醇洗脫液減壓回收乙醇，干燥得總黃酮提取物 105g，測得總黃酮為51g，占所述干燥后的總黃酮提取物的重量百分比為48.5%，占 構(gòu)樹葉原料藥材總重的百分比即收率為5.1%。
實施例4、構(gòu)樹葉總黃酮的抗炎活性研究 構(gòu)樹葉總黃酮抑制小鼠耳廓腫脹實驗
總黃酮(TFS)溶液的制備按實施例3制備所得構(gòu)樹葉總黃酮提取物，分別 精密稱定提取物，用純凈水分別定容至100mL容量瓶中，加入lmL吐溫-80，純凈 水稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為4.4mg/mL、 8.8mg/mL、 17.6mg/mL的TFS低、中、 高劑量總黃酮溶液，分別為TFS3高、中、低劑量組。
將實施例1制備所得正丁醇萃取提取物和實施例2制備所得提取物按照與上完 全相同的方法制備總黃酮溶液，分別為TFS1和TFS2。陽性對照品溶液的制備將醋酸地塞米松片置研缽中研成細(xì)粉，精密稱取一定
量的細(xì)粉，用純凈水溶解并定容至100ml容量瓶中，加入吐溫-80 1 mL，用純凈水
稀釋至刻度，得濃度為0.082 mg/mL的陽性對照品溶液。
方法與結(jié)果健康小鼠98只隨機分成7組，即TFS3高、中、低劑量組、TFS2
和TFS1、陽性對照組和空白對照組，每組14只。TFS3低、中、高劑量組，分別以
100， 200， 400mg/kg灌胃給藥，TFS2禾B TFS1只有200 mg/kg齊U量，陽性對照組給
地塞米松組1.8 mg/kg，空白對照組給同體積的生理鹽水，l次/d，連續(xù)7d，末次給
藥lh后在小鼠右耳用注射器涂0.2 ml的二甲苯，左耳作為自身對照，涂耳lh后處
死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑為9mm的打孔器分別在兩耳相應(yīng)部位打孔，電子
天平稱重，左耳為對照，以兩耳重量差為腫脹程度，計算腫脹度抑制率(％)。
腫脹度抑制率(％)=(給藥組腫脹度-對照組腫脹度)/對照組腫脹度。
結(jié)果顯示與空白對照組相比，TFS3各劑量組(100、 200和400 mg/kg)和TFS2
以及TFS1對小鼠耳廓腫脹有明顯抑制作用，并呈劑量依賴性，地塞米松陽性對照組
(1.8mg/kg)對小鼠耳廓腫脹亦有顯著的抑制作用。結(jié)果如表l所示。
_表l、構(gòu)樹葉對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(I±S)
劑量C/mg-kg-1 腫脹程度mg 抑制率(％)~~
空白對照-5.3±0.18-
陽性對照1.80.74±0.13'86.03
TFS3高劑量4001.2士0.12'77.35
TFS3中劑量2002.4±0.20*54.71
TFS3低齊廿量1003.5土0.13'33.96
TFS2劑量組2002.0±0.17*62.26
TFS1齊U量組2002.7士0.15'49.06
與空白對照組比較，*P<0.01， n=12。
實施例5、構(gòu)樹葉總黃酮的抑菌活性研究
對本發(fā)明提供的構(gòu)樹葉總黃酮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用 進行研究。上述兩菌種均購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，大腸桿菌的編號為 CMCC(B)44102，金黃色葡萄球菌的編號為CMCC(B) 26001 。
供試品溶液的制備按照實施例3制備所得65%乙醇水溶液的洗脫物，95°/0乙
8醇水溶液的洗脫物；按照實施例1的方法制備正丁醇萃取總黃酮提取物和實施例2 的方法制備總黃酮提取物。 方法與結(jié)果
滅菌與消毒將培養(yǎng)皿、鑷子、三角耙、移液管(0.5mL、 10mL)、試管各取 若干分別用報紙包扎緊密，放入電熱恒溫干燥箱內(nèi)140°C，干熱滅菌4小時。取出冷 卻放于無菌室備用。
含藥紙片的制備選用吸水力較強而質(zhì)地均勻的濾紙，用打孔機打成直徑6mm 的圓片若干，置潔凈干燥培養(yǎng)皿，用報紙包扎緊密，放人電熱恒溫干燥箱內(nèi)140°C， 干熱滅菌2h，放入無菌操作臺內(nèi)。
液體培養(yǎng)基的配制準(zhǔn)確稱取牛肉膏0.3g、蛋白胨lg、 NaC10.5 g放入燒杯， 牛肉膏用玻璃棒放入表面皿稱取，用熱水融化倒入。在燒杯中加入80 mL蒸餾水， 用玻璃棒攪勻，然后，放在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。藥品完全溶解后，再加蒸餾水 使培養(yǎng)基至100mL。先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，加減NaOH直至 pH值為7.2。取8個滅菌后的試管用移液管分別加入5 mL配好的培養(yǎng)基，用膠塞封 好。
無菌溶液的制備將上述配制好的液體、固體培養(yǎng)基及蒸餾水放入手提式不銹 鋼蒸汽消毒器中，維持121。C， 0.1Mpa高壓滅菌15 min。待壓力正常，稍涼后，取 出放入無菌室備用。
試驗菌的培養(yǎng)在無菌室內(nèi)取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，接菌針用酒精燈滅 菌后，在酒精燈下用其分別在試驗菌斜面上取得少量放入裝有液體培養(yǎng)基的試管中。 加上膠塞后放入醫(yī)用培養(yǎng)箱中，37t:培養(yǎng)24h。取出放入無菌室備用。
固體培養(yǎng)基的配制以不含任何抗生素的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 配方牛肉膏1.5 g、蛋白胨5g、氯化鈉2.5 g、水500mL和瓊脂10 g，加酸堿調(diào) 節(jié)pH值為7.6。
抑菌試驗方法采用濾紙片法。具體操作如下將6mm紙片制成分別含不同體
積百分比濃度的待試藥物，按梯度稀釋法進行2倍稀釋(樣品分別稀釋成l: 2， 1: 4， 1: 8， 1: 16， 1; 32， 1: 64， 1: 128， 1: 256， h 512， 1: 1024這10個濃度)
加入含菌平板中，觀察有無抑菌圈，判定是否具有抑菌活性，具有抑菌作用的含藥
物濃度最低的紙片的藥物濃度，即為藥物對該細(xì)菌的MIC值藥物濃度用梯度稀釋法 以無菌蒸餾水稀釋，接種量為1.0xl06cfu，培養(yǎng)條件和時間為37。C， 24h。
抑菌試驗結(jié)果通過觀察，無抑菌圈表示無抑菌作用，有抑菌圈表示有抑菌作 用，具有抑菌圈的含藥物濃度最低的紙片的藥物濃度，即為藥物對該細(xì)菌的MIC。結(jié)果表明大孔吸附樹脂柱65%乙醇水溶液洗脫部分抑菌活性最強。其中，大孔吸
附樹脂柱65%乙醇水溶液洗脫部分即為構(gòu)樹葉總黃酮部分。試驗結(jié)果如表2所示。
可知，總黃酮提取物的抑菌活性最強。
_表2、構(gòu)樹葉提取物對兩種菌抑制作用的MIC值(mg/mL)
SS 大腸桿菌 金色葡萄球菌
實施例3中水洗脫物17.330.6
實施例3中打孔樹脂65%乙醇水溶液洗脫8.619.2
物
實施例3中95%乙醇水溶液洗脫物24.544.2
實施例1總黃酮提取物10.322.0
實施例2總黃酮提取物7.210.5
10
權(quán)利要求
1、一種制備構(gòu)樹葉總黃酮提取物的方法，包括如下步驟1)將構(gòu)樹葉原料粉碎成粉末；2)將所述步驟1)得到的構(gòu)樹葉粉末用乙醇的水溶液進行提取，過濾提取液后合并濾液，濃縮，得到濃縮液，再對所述濃縮液用脫脂溶劑進行脫脂，得到脫脂濃縮液；3)將所述步驟2)得到的脫脂濃縮液進行分離純化，干燥后，得到所述構(gòu)樹葉總黃酮提取物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，所述構(gòu)樹葉包含葉柄；所述粉末的目數(shù)為2—60目；所述步驟2)中，乙醇的水溶液的體積百分比濃度為0-100%，優(yōu)選40-75%;所述提取方法為回流提取法、索氏提取法、超聲提取法或閃式提取法，優(yōu)選回流提取法;所述乙醇的水溶液的用量為所述步驟1)得到的構(gòu)樹葉粉末質(zhì)量的6—20倍；所述脫脂溶劑為石油醚或氯仿；所述步驟3)中，所述分離純化的方法為溶劑萃取法、聚酰胺柱層析法或樹脂吸附法；所述干燥方法選自下述方法中的一種或兩種減壓干燥法、冷凍法和噴霧干燥法。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，回流提取時，提取溫度為乙醇的回流溫度，優(yōu)選50—IO(TC，提取次數(shù)為l一3次，每次提取所用時間為0.5—3小時；所述步驟3)中，溶劑萃取法包括如下步驟將所述步驟2)得到的脫脂濃縮液用水飽和的正丁醇或乙酸乙酯進行萃取，萃取完畢后合并正丁醇或乙酸乙酯層萃取液；所述聚酰胺柱層析法包括如下步驟將所述步驟2)得到的脫脂濃縮液用聚酰胺色譜柱進行分離，淋洗液依次為水和20—80%的乙醇水溶液，收集20—80。/。乙醇水溶液的洗脫液；所述樹脂吸附法包括如下步驟將所述步驟2)得到的脫脂濃縮液用吸附樹脂柱進行分離，淋洗液依次為水、20—80%的乙醇水溶液和95%的乙醇水溶液，收集20—80%乙醇水溶液的洗脫液。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，溶劑萃取法中，所述水飽和的正丁醇或乙酸乙酯的用量為所述步驟2)得到的脫脂濃縮液體積的1/2—2倍；萃取次數(shù)為l一6次；所述聚酰胺柱層析法中，所述聚酰胺色譜柱中，聚酰胺的用量為所述構(gòu)趙*原料質(zhì)量的0.5—2倍；所述樹脂吸附法中，所述吸附樹脂柱中，樹脂型號為DIOI或AB-8，所述樹脂的用量為構(gòu)樹葉原料質(zhì)量的0.5_2倍。
5、 權(quán)利要求l-4任一所述方法制備得到的構(gòu)樹葉總黃酮提取物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取物，其特征在于所述構(gòu)樹葉總黃酮提取物中，總黃酮的質(zhì)量百分含量為20% 70%。
7、 權(quán)利要求5或6所述構(gòu)樹葉總黃酮提取物在制備抑菌藥物中的應(yīng)用。
8、 以權(quán)利要求5或6所述構(gòu)樹葉總黃酮提取物為活性成分的抑菌藥物。
9、 權(quán)利要求5或6構(gòu)樹葉總黃酮提取物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。
10、 以權(quán)利要求5或6所述構(gòu)樹葉總黃酮提取物為活性成分的抗炎藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了構(gòu)樹葉總黃酮提取物及其制備方法與應(yīng)用。該方法包括如下步驟1)將構(gòu)樹葉粉碎成粉末；2)將構(gòu)樹葉粉末用乙醇的水溶液進行提取，過濾提取液后合并濾液，濃縮，得到濃縮液，濃縮液用脫脂溶劑脫脂后得脫脂濃縮液；3)將脫脂濃縮液進行分離純化，干燥后，得到所述構(gòu)樹葉總黃酮提取物。該方法制備所得構(gòu)樹葉總黃酮提取物中，總黃酮的重量含量為20％～70％，收率為1％～30％。經(jīng)藥理試驗證明，該構(gòu)樹葉總黃酮提取物可單獨或與其它藥物組合作為原料藥應(yīng)用于具有抑菌和抗炎藥物的制劑中。該方法制備產(chǎn)物純度高，方法簡便實用，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61K36/185GK101637503SQ20091009054
公開日2010年2月3日 申請日期2009年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月19日
發(fā)明者偉 熊, 竇德強 申請人:大連中植環(huán)境生物科技有限公司