專利名稱：：從小薊中提取抗腫瘤活性物質(zhì)的方法以及小薊抗腫瘤藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥和保健領(lǐng)域，具體涉及藥食兩用小薊中抗腫瘤活性部位的提取和純化工藝以及小薊中抗腫瘤活性物質(zhì)的醫(yī)藥和保健用途。
背景技術(shù)：
：在上個(gè)世紀(jì)末到本世紀(jì)初，惡性腫瘤發(fā)病率在各國高居不下。從上個(gè)世紀(jì)50年代以來，由于醫(yī)療技術(shù)的改進(jìn)，使心臟病等其它慢性疾病的死亡率大大降低，而腫瘤仍然沒有任何下降的趨勢(shì)。由于惡性腫瘤發(fā)病比較隱匿，腫瘤病因復(fù)雜病理變化多樣，發(fā)現(xiàn)時(shí)常為晚期，因此給社會(huì)和家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)。同時(shí)，由于惡性腫瘤治療復(fù)雜，患者家庭等很多相關(guān)人群為此付出了沉重的代價(jià)。目前腫瘤是人類死亡的第一殺手，研究如何消滅癌癥、讓癌癥病人能生活的更好，是醫(yī)藥領(lǐng)域中的研究重點(diǎn)，因此尋找高效、低毒、選擇性強(qiáng)的有臨床應(yīng)用價(jià)值的理想的新型抗腫瘤藥物是一項(xiàng)長期的世界性科學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)，尤其從藥食兩用的無毒且原料廉價(jià)易得的中藥里尋找抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤藥物開發(fā)的重要方向與希望所在。本發(fā)明研究對(duì)象——小薊(CirsiumSetosum(Willd.)MB.)為菊科植物刺兒菜的干燥地上部分，全國各地均產(chǎn)，主產(chǎn)于安徽、山東、江蘇等省。《中國藥典》2005版記載其性甘、苦，味涼，歸心、肝經(jīng)；具有涼血止血、祛瘀消腫之功效?？捎糜谥委燈卵?，尿血，便血，崩漏下血，外傷出血，癰腫瘡毒等，為歷代中醫(yī)臨床的常用藥之一。小薊同時(shí)也可以食用，作為藥食兩用的野生植物資源含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，為人們喜愛的民間野菜。有關(guān)小薊臨床應(yīng)用的報(bào)道頗多，如單獨(dú)大劑量、長期服用用來降血壓，未見不良反應(yīng)的報(bào)告，也無明顯毒副作用且安全(張京.小薊的降壓作用及其機(jī)制分析.中醫(yī)藥臨床雜志，2005,7(4):344-344.;張京.小薊治療原發(fā)性高血壓3例報(bào)告.安徽醫(yī)學(xué),2005,26(4):339-339.;李桂敏，田林忠.小薊花生酒治療原發(fā)性高血壓IOO例療效觀察.國醫(yī)論壇，1989,4(5):31-31.);和其它中藥配伍使用可治療慢性活動(dòng)性肝炎和肝硬化；用小薊作為藥引子可以治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病，被廣泛地用于治療尿路感染、增生性腎炎、急性腎小球腎炎、腎功能衰竭、血尿、血精癥等各種泌尿生殖系統(tǒng)疾?。徊捎靡孕∷E單方葉鮮汁治療鼻妞、出血性胃炎和胃切除后近期出血效果顯著，與其它藥物組方可以治療外傷出血、血尿、外陰腫瘤出血、和多種各種不明原因的出血癥等；用小薊還可治療頑固性失眠，療效確切，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，一般服用15min即可入睡，維持時(shí)間8小時(shí)以上，如果中斷睡眠或醒后，無不適感，白天對(duì)思維和情緒無影響；將小薊與蓖麻籽搗爛治療關(guān)節(jié)炎，療效確切，且經(jīng)濟(jì)方便；用小薊膏治療癤瘡，療效好，且對(duì)皮膚無刺激性，易于清洗。小薊飲子加減可治療殺蟲脒中毒血尿；小薊飲子加減治可療過敏性紫癜，療效確切；小薊飲子加減治療膀胱癌具有較好的效果。小薊的現(xiàn)代研究始于20世紀(jì)60年代。在化學(xué)成分方面，從中分離鑒定了包括黃酮類(14個(gè))、甾體類(5個(gè))、三萜類(2個(gè))和有機(jī)酸衍生物類(5個(gè))等物質(zhì)，在藥理學(xué)方面，主要是對(duì)小薊提取物的研究報(bào)道，表明小薊水或乙醇提取物具有抗氧化、降壓、止血和對(duì)心血管系統(tǒng)的作用等(陳毓，丁安偉，楊星昊，張麗.小薊化學(xué)成分藥理作用及臨床應(yīng)用研究述要.中醫(yī)藥學(xué)刊，2005,23(4):614-615.)，同時(shí)僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道小薊水提液可使人白血病細(xì)胞K562、肝癌細(xì)胞HepG2、宮頸癌細(xì)胞Hela和胃癌細(xì)胞BGC823的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生皺縮、變圓、脫壁、裂碎等變化，生長受到明顯抑制，抑制率最高可達(dá)86.03%，首次報(bào)道了小薊的抑癌作用(李煜，王振飛，賈瑞貞.小薊水提液對(duì)4種癌細(xì)胞生長抑制作用的研究.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(2):274-275.)。但是該文獻(xiàn)沒有提示小薊具有抑癌作用的活性組分以及其它提取方法。關(guān)于小薊中化合物的提取，通常為水提，醇提方法中最具有代表性的方式是先經(jīng)乙醇提取，然后依次使用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取，從不同的萃取部位進(jìn)行化學(xué)成分的分離(潘珂，尹永芹，孔令義.小薊化學(xué)成分的研究.中國現(xiàn)代中藥，2006,8(4):7-9.)，這些文獻(xiàn)確證了從不同部位獲得的化合物，但沒有揭示其藥物活性。也有文獻(xiàn)介紹大孔吸附樹脂對(duì)小薊總黃酮成分的分離純化作用(楊星昊，劉海，丁安偉.大孔吸附樹脂分離純化小薊總黃酮的研究.浙江中醫(yī)雜志,2006，41(1):50-52.)，提示了富集的黃酮類化合物具有止血作用。這些文獻(xiàn)均沒有提示小薊提取物具有抑癌作用以及活性部位，并且，從提取方法上，均為實(shí)驗(yàn)室研究工藝，例如多次萃取過程的繁雜、大孔樹脂的預(yù)處理等，不適用產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能提取小薊中抗腫瘤活性部位并純化獲得抗腫瘤活性物質(zhì)的方法，進(jìn)而提供從小薊中獲取的抗腫瘤活性物質(zhì)和小薊抗腫瘤藥物。本發(fā)明首先提供一種小薊中抗腫瘤活性物質(zhì)的提取方法，采用以下步驟步驟一從小薊干粉中用乙醇超聲提取，去除乙醇得濃縮液；步驟二對(duì)濃縮液先用石油醚多次萃取，水相再過大孔吸附樹脂吸附，然后分別4用水和45%乙醇洗脫，收集45%乙醇洗脫液；步驟三減壓回收45%乙醇洗脫液得到小薊中抗腫瘤活性物質(zhì)。其中，步驟二所述大孔吸附樹脂優(yōu)選為HP-20型大孔吸附樹脂。其中，所述步驟一濃縮液以下述過程獲取向小薊干粉中加入乙醇溶液分多次超聲提取，合并濾液，過濾去渣，濾液減壓濃縮至乙醇全部蒸出即可。這里，使用質(zhì)量濃度為60%~80%單一濃度的乙醇多次提取，優(yōu)選用80%的乙醇單一重復(fù)提取三次?；蛘?，在65%95%范圍內(nèi)依次由高濃度至低濃度使用兩種或兩種以上質(zhì)量濃度的乙醇溶液組合提??；優(yōu)選依次使用95%、80%和65%乙醇組合提取三次。上述方法獲取的小薊抗腫瘤活性物質(zhì)也是本
發(fā)明內(nèi)容之一。該抗腫瘤活性物質(zhì)為小分子物質(zhì)，主要為醇提物經(jīng)石油醚萃取后的剩余水相經(jīng)大孔吸附樹脂吸附后45%乙醇洗脫液的濃縮液或干浸膏。本發(fā)明通過體外活性實(shí)驗(yàn)的跟蹤檢測(cè)，最終確定了一條最佳的提取和純化的工藝路線，該提取和純化方法具有提取量大、部位準(zhǔn)確的特點(diǎn)，獲得的活性物質(zhì)效果明顯，可作為一種高效、低毒且原料廉價(jià)易得的抗腫瘤藥物或保健品。本發(fā)明采用MTT方法，在包括人肺癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞等多種體外細(xì)胞毒活性模型上，檢測(cè)小薊中抗腫瘤活性物質(zhì)的抗腫瘤效果，尋找到了小薊中的抗腫瘤活性部位。本發(fā)明還提供了一種抗腫瘤新藥，其中以上述活性部位作為藥用活性成分。所述藥物為小薊抗腫瘤片劑、膠囊劑、口服液或滴丸劑；其中小薊抗腫瘤片是按1:1的重量比例將小薊抗腫瘤活性物質(zhì)的干浸膏和淀粉混合，按制片工藝制成小薊抗腫瘤片成品；小薊抗腫瘤膠囊是按1:0.05的重量比例將小薊抗腫瘤活性物質(zhì)的干浸膏和硬脂酸鎂混合，按制膠囊工藝制成小薊抗腫瘤膠囊成品。本發(fā)明還提供了一種抗腫瘤功能的保健品，其中以上述活性部位作為活性成分。本發(fā)明提出了從小薊中提取抗腫瘤活性物質(zhì)的方法，首次提出小薊的主要抗腫瘤功效組分存在于乙醇提取液蒸去醇后用石油醚萃取后的剩余水相，再經(jīng)大孔吸附樹脂吸附的45%乙醇洗脫部位，并依此得到以該活性部位制成的藥品和保健品。實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明提取的活性部位有明顯的抗腫瘤功能，又由于小薊本身就可食用，所以其具有無毒、安全等特點(diǎn)，以此活性部位作為活性成分可以得到有效的抗腫瘤新藥和/或抗腫瘤保健品，具有高效、無毒且原料廉價(jià)易得的特點(diǎn)；本發(fā)明活性部位的提取純化工藝適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)要求，粗提物采用混合醇提取以提高產(chǎn)量，富集過程先經(jīng)石油醚萃取再5通過大孔吸附樹脂吸附，提高純化效率，并且，純化中采用優(yōu)選的HP-20型大孔吸附樹脂，可以直接上柱操作，且樹脂不需繁瑣的預(yù)處理，均為活性部位提取的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了好的措施。本發(fā)明為抗腫瘤的防治開辟了一條新途徑。圖1為小薊中活性抗腫瘤部位的提取和純化工藝路線圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明從抗細(xì)胞毒活性出發(fā)，對(duì)小薊的藥效部位進(jìn)行了研究，經(jīng)采用MTT方法，在包括人肺癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞等多種體外細(xì)胞毒活性模型上，對(duì)小薊的醇提物進(jìn)行了細(xì)胞毒活性測(cè)試。實(shí)驗(yàn)表明，用不同濃度的醇提取的浸膏對(duì)人卵巢癌細(xì)胞均有選擇性細(xì)胞毒活性。將乙醇粗提物的浸膏分散在水中，用石油醚萃取后，水相經(jīng)過大孔吸附樹脂HP-20吸附和不同濃度的乙醇梯度洗脫后，再對(duì)以上分離得到的各個(gè)部位進(jìn)行細(xì)胞毒活性的測(cè)試，發(fā)現(xiàn)各部位的抗細(xì)胞毒活性存在明顯差異，表明小薊中存在具有不同抗細(xì)胞毒的多種活性成分。要研究清楚具有不同抗細(xì)胞毒的活性成分分別是什么，首先需研究清楚小薊的主要抗細(xì)胞毒活性部位，進(jìn)而找到真正量較大的主要抗細(xì)胞毒活性物質(zhì)，為開發(fā)利用廉價(jià)易得的資源提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)開發(fā)新型抗腫瘤藥物具有潛在的顯著應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提取小薊中抗腫瘤活性部位的方法，為從小薊粗粉中盡可能多的將原料中的抗腫瘤活性物質(zhì)提出，再通過后續(xù)適于產(chǎn)業(yè)化的分離純化工序來富積抗腫瘤活性物質(zhì)。具體的，首先用乙醇(如6080%的乙醇或組合濃度乙醇)超聲提取得到粗提物浸膏，浸膏水溶后用小極性溶劑(如石油醚)萃取，剩余水相過大孔吸附樹脂，再依次用水、45%乙醇洗脫；將45%乙醇洗脫液減壓濃縮成膏后就可以得到小薊中大部分的抗腫瘤活性組分。本發(fā)明從小薊中獲得抗腫瘤活性物質(zhì)的工藝路線參見圖1所示。本發(fā)明中，濃度"％"均指質(zhì)量百分比濃度。體外抗腫瘤活性的測(cè)定a.實(shí)驗(yàn)材料①被測(cè)樣品本發(fā)明實(shí)施例獲得的系列小薊提取物，用DMSO溶解。②MTT(四甲基偶氮唑鹽)用新鮮的RRM1640培養(yǎng)液(Serva公司生產(chǎn))配制。③體外培養(yǎng)HCT-8,Bel-7402,BGC-823,A549和Ketr3細(xì)胞株(醫(yī)科院藥物研究所提供)。④5-氟脲嘧啶為對(duì)照品。b.實(shí)驗(yàn)方法①細(xì)胞培養(yǎng)采用含有10%牛胎血清、100U/ml青霉素和100mg/L的RRMI1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞在37"C、5%<302飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。②MTT法取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化后充分吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后稀釋成lxlO、ell/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，100pl/L。每一被測(cè)樣品設(shè)4-5個(gè)濃度級(jí)別，然后在實(shí)驗(yàn)孔中加入100^培養(yǎng)基和不同濃度級(jí)別的被測(cè)樣品，每一濃度級(jí)別平行3孔。對(duì)照組加入等體積溶劑(DMSO)。將96孔培養(yǎng)板置于37'C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入新鮮配制的含0.20mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)基，37°C下繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，離心，除去上清液。每孔加入150^1lDMSO溶解甲瓚(formazan，是一種藍(lán)紫色結(jié)晶)沉淀，置微量震蕩器上震蕩5分鐘使其充分溶解。在BIORAD550型酶標(biāo)儀上測(cè)定570入m處的光密度值。按下列公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生成抑制率，再以藥物濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞生成抑制率作圖得到計(jì)量曲線，從曲線上讀取藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。腫瘤細(xì)胞生長抑制率(％)=(l—實(shí)驗(yàn)孔測(cè)定值/對(duì)照孔測(cè)定值)xl00%實(shí)施例一小薊中抗腫瘤活性部位的粗提本發(fā)明實(shí)施例中使用的小薊來自安徽九華山。稱六份小薊干粉，每份200g，分為六組，每組加小薊重量12倍的不同質(zhì)量濃度的乙醇溶液超聲提取，每次1小時(shí)，共提取三次，合并濾液，過濾去渣，濾液減壓濃縮得粗提品浸膏，具體分組操作如下第一組200g小薊干粉，每次加2400ml95。/。乙醇超聲提取1小時(shí)，共提取三次，過濾，合并三次濾液，減壓濃縮得干浸膏10.2g。第二組200g小薊干粉，每次加2400ml80Q/。乙醇超聲提取l小時(shí)，共提取三次，過濾，合并三次濾液，減壓濃縮得干浸膏11.4g。第三組200g小薊干粉，每次加2400ml70。/。乙醇超聲提取l小時(shí)，共提取三次，過濾，合并三次濾液，減壓濃縮得干浸膏9.3g。第四組200g小薊干粉，每次加2400ml60。/。乙醇超聲提取1小時(shí)，共提取三次，過濾，合并三次濾液，減壓濃縮得干浸膏8.1g。第五組200g小薊干粉，每次加2400ml50Q/。乙醇超聲提取1小時(shí)，共提取三次，過濾，合并三次濾液，減壓濃縮得干浸膏6.7g。第六組200g小薊干粉，第一次加2400ml95%乙醇超聲提取1小時(shí)，第二次加2400ml80%乙醇超聲提取1小時(shí)，第三次加2400ml65%乙醇超聲提取1小時(shí)，共提取三次，過濾，合并三次濾液，減壓濃縮得干浸膏12.5g。用MTT法測(cè)定六組小薊粗提物分別對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。分組精確稱取一定量小薊粗提物樣品，按前述方法將被測(cè)樣品配備好后進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試結(jié)果見表1:表l:小薊粗提物的體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果aC50pl/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注1、HCT-8為人結(jié)腸癌細(xì)胞，Bel-7402為人肝癌細(xì)胞，BGC-823為人胃癌細(xì)胞，A549為人肺癌細(xì)胞，A2780為人卵巢癌細(xì)胞。2、>50表明不具有抗細(xì)胞毒活性。該組實(shí)驗(yàn)表明，超聲提取過程中，使用質(zhì)量濃度為95%、80%和65%的乙醇組合(第六組)提取，粗提物在體外MTT實(shí)驗(yàn)中對(duì)人胃癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞的抗細(xì)胞毒活性作用明顯；從抗細(xì)胞毒活性作用效果看，使用質(zhì)量濃度為6080%乙醇的單一濃度提取，也可以達(dá)到較好的實(shí)驗(yàn)效果。另一方面，從六組粗提品浸膏提取量看，混合醇提(第六組)提取量最高，可達(dá)12.5克。當(dāng)然，不同濃度的乙醇組合提取的方式不限于第六組列舉的一種，可以是其它從高濃度至低濃度的乙醇的組合，可以在操作中靈活掌握，其原則是組合提取時(shí)活性物質(zhì)的提取量有所增加，表明能較充分地提取出了小薊中的活性物質(zhì)，同時(shí)提取物對(duì)人胃癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞的抗細(xì)胞毒活性作用也很明顯。因此，比較提取量和抗細(xì)胞毒活性的雙重效果，本發(fā)明粗提過程優(yōu)化的醇提方案為不同濃度乙醇組合提取，優(yōu)選依次用95%、80%和65%的不同濃度的乙醇超聲提取，每次提取的溶劑用量優(yōu)化為藥材量的12倍，每次提取一小時(shí)，合并三次濾液即得粗提物。實(shí)施例二、小薊中抗細(xì)胞毒活性物質(zhì)的分離和純化本實(shí)施例進(jìn)一步確定粗提物中抗細(xì)胞毒活性物質(zhì)的集中部位，并從工業(yè)應(yīng)用角度簡(jiǎn)化分離和純化抗細(xì)胞毒活性物質(zhì)的操作。取95%、80%和65%乙醇組合提取的小薊粗提浸膏(實(shí)施例一的最后一組粗提物)24g超聲水溶至240ml，先用石油醚萃取，每次720ml連續(xù)萃取46次，合并萃取液，得到石油醚萃取部分(分離部位l)和水相部分；將水相部分平均分成相同體積的兩份，其中的1/2水相部分過HP-20型大孔吸附樹脂，分別用水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇依次洗脫，收集各段洗脫液(其中分離部位2為純水洗脫部分，分離部位3為30%乙醇洗脫部分，分離部位4為60%乙醇洗脫部分，分離部位5為95%乙醇洗脫部分)；另1/2水相部分同樣過HP-20型大孔吸附樹脂，分別用水、45%乙醇、60%乙醇和95%乙醇依次洗脫，收集各段洗脫液(其中分離部位6為純水洗脫部分，分離部位7為45%乙醇洗脫部分，分離部位8為60%乙醇洗脫部分，分離部位9為95%乙醇洗脫部分)。將上述石油醚萃取部分和各部分洗脫液減壓濃縮成膏后，精確稱取，用MTT法測(cè)定。測(cè)定時(shí)，精確稱取各部分樣品，用MTT法測(cè)定不同樣品對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。測(cè)試結(jié)果見表2:表2:小薊萃取和分離物的體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果(IC50pl/ml)樣品IC50(ng/ml)HCT-8Bel-7402BGC823A549A2780分離部位1>50>50>50>5041.16分離部位2>50>50>50>50>50分離部位3>50>50〉505.9112.48分離部位4>50>5012.3618.8714.32分離部位5>50>50>50>50>50分離部位6>50>50>50>50>50分離部位7>50>5019.356.5711.19分離部位8>50>50>50>50>50分離部位9>50>50>50>50>50注1、HCT-8為人結(jié)腸癌細(xì)胞，Bel-7402為人肝癌細(xì)胞，BGC-823為人胃癌細(xì)胞，A549為人肺癌細(xì)胞，A2780為人卵巢癌細(xì)胞。2、>50表明不具有抗細(xì)胞毒活性。9實(shí)驗(yàn)中，從分離部位2到分離部位5可以看出，過HP-20型大孔吸附樹脂，分別用水、30%乙醇、60%和95%乙醇依次洗脫后，抗細(xì)胞毒活性物質(zhì)在30%乙醇洗脫部分和60%乙醇部分都有；而從分離部位6到分離部位9可以看出，過HP-20型大孔吸附樹脂，分別用水、45%、60%和95%乙醇依次洗脫后，抗細(xì)胞毒活性物質(zhì)卻高度集中在45%乙醇洗脫部分，且45%乙醇洗脫部分(分離部位7)對(duì)人胃癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性均有較好的作用。因此，依據(jù)本實(shí)施例，將分離部位7洗脫的部分優(yōu)選作為本發(fā)明的抗細(xì)胞毒活性物質(zhì)。通過本實(shí)施例，說明本發(fā)明己經(jīng)非常精準(zhǔn)的確證了小薊抗細(xì)胞毒活性部位，較以往文獻(xiàn)介紹內(nèi)容有重大突破。本發(fā)明雖暫沒有鑒定通過實(shí)施例二富集得到的抗細(xì)胞毒活性物質(zhì)具體為哪些化合物，但通過分析已有文獻(xiàn)(楊星昊，劉海，丁安偉.大孔吸附樹脂分離純化小薊總黃酮的研究.浙江中醫(yī)雜志，2006,41(1):50-52.)可以了解，該部分富集的主要不是黃酮類化合物(按文獻(xiàn)結(jié)論，黃酮類化合物主要集中在濃度在70%以上的乙醇洗脫液中)，而實(shí)施例二中60%和95%乙醇洗脫液不具有抗細(xì)胞毒活性。因此判斷本發(fā)明獲得的富集物中可能存在的黃酮類化合物不是抗細(xì)胞毒活性的主導(dǎo)物質(zhì)。本發(fā)明提取部位中存在哪些化合物，哪些化合物可作為抗細(xì)胞毒活性的主導(dǎo)物質(zhì)，有待發(fā)明人的進(jìn)一步深入研究論證和更加細(xì)化的分離，本發(fā)明不包括這部分內(nèi)容。實(shí)施例三抗腫瘤新藥的制備以上通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了本發(fā)明提供的方法可以獲得小薊的抗腫瘤活性物質(zhì)。依據(jù)該結(jié)論，本領(lǐng)域技術(shù)人員均了解，將其作為藥用活性成分，可以加入適應(yīng)不同使用劑型的可藥用輔料或載體制成藥品，使用劑型包括片劑、膠囊劑、口服液或滴丸劑；也可以加入其他可食用的輔劑制成保健品，包括保健目的的吞咽片、咀嚼片、泡騰片、膠囊、口服液、或保健食品或飲料等等。在制藥或保健品的過程中，選用的小薊抗細(xì)胞毒活性物質(zhì)是用實(shí)施例二方法制備得到的濃縮液或干浸膏，優(yōu)選分離部位7的濃縮液或干浸膏；當(dāng)然，在忽視提取成本的情況下，分離部位3和4，或者直接使用60%乙醇進(jìn)行洗脫獲得的濃縮液或干浸膏，也屬于可用的小薊抗細(xì)胞毒活性物質(zhì)。以下例舉一二，其余按常規(guī)制法制備，本發(fā)明在此不一一贅述。小薊抗腫瘤片取分離部位7的干浸膏，按l:l的重量比例稱取干浸膏25g和淀粉25g,混勻，制成濕顆粒，在6(TC左右干燥，得干顆粒，壓成素片100片，包糖衣或薄膜衣，檢驗(yàn)合格，分裝，即得小薊抗腫瘤片成品。小薊抗腫瘤膠囊取分離部位7的干浸膏，按l:0.05的重量比例稱取干浸膏25g和硬脂酸鎂1.258,混勻，制成濕顆粒，在4(TC左右干燥，制成100粒膠囊，檢驗(yàn)合格，分裝，即得小薊降膠囊成品。本發(fā)明首次用實(shí)驗(yàn)確證了小薊中的主要抗腫瘤功效組分存在于大孔吸附樹脂吸附，45%乙醇洗脫部位，判斷小薊中的主要抗腫瘤活性物質(zhì)是小分子物質(zhì)。抗腫瘤活性物質(zhì)應(yīng)用性由于本發(fā)明是從藥食兩用小薊中提取純化得到的抗腫瘤活性部位，提取過程中所用試劑和設(shè)備也均符合制藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，所以具有無毒、安全等特點(diǎn)；又因?yàn)樾∷E來源廣泛，價(jià)格低，資源廉價(jià)、易得，抗腫瘤功效已得到確證，活性部位可以開發(fā)成為一個(gè)新的抗腫瘤藥物和/或抗腫瘤保健保健品。權(quán)利要求1、一種小薊中抗腫瘤活性物質(zhì)的提取方法，其特征在于，采用以下步驟步驟一從小薊干粉中用乙醇超聲提取，去除乙醇得濃縮液；步驟二對(duì)濃縮液先用石油醚多次萃取，水相再過大孔吸附樹脂吸附，然后分別用水和45％乙醇洗脫，收集45％乙醇洗脫液；步驟三減壓回收45％乙醇洗脫液得到小薊中抗腫瘤活性物質(zhì)。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，其特征在于，步驟二中，所述大孔吸附樹脂優(yōu)選為HP-20型大孔吸附樹脂。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述步驟一濃縮液以下述過程獲取向小薊千粉中加入乙醇溶液分多次超聲提取，合并濾液，過濾去渣，濾液減壓濃縮至乙醇全部蒸出即可。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，使用質(zhì)量濃度為60%~80%單一濃度的乙醇多次提取，優(yōu)選用80%的乙醇單一重復(fù)提取三次。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，在65%~95%范圍內(nèi)依次由高濃度至低濃度使用兩種或兩種以上質(zhì)量濃度的乙醇溶液組合提?。粌?yōu)選依次使用95%、80%和65%乙醇組合提取三次。6、上述任一權(quán)利要求所述方法獲取的小薊抗腫瘤活性物質(zhì)。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述小薊抗腫瘤活性物質(zhì)，其特征在于，其為小分子物質(zhì)，主要為醇提物經(jīng)石油醚萃取后的剩余水相經(jīng)大孔吸附樹脂吸附后45%乙醇洗脫液的濃縮液或干浸膏。8、權(quán)利要求6或7所述小薊抗腫瘤活性物質(zhì)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，所述藥物為小薊抗腫瘤片劑、膠囊劑、口服液或滴丸劑；其中小薊抗腫瘤片是按1:1的重量比例將小薊抗腫瘤活性物質(zhì)的干浸膏和淀粉混合，按制片工藝制成小薊抗腫瘤片成品；小薊抗腫瘤膠囊是按1:0.05的重量比例將小薊抗腫瘤活性物質(zhì)的干浸膏和硬脂酸鎂混合，按制膠囊工藝制成小薊抗腫瘤膠囊成品。10、權(quán)利要求6或7所述小薊抗腫瘤活性物質(zhì)在制備抗腫瘤保健品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了從小薊中提取純化抗腫瘤活性物質(zhì)的方法，是用60％～80％乙醇超聲提取或依次使用不同濃度的乙醇組合提取得到粗提品，水溶后用石油醚萃取，剩余水相過HP-20型大孔吸附樹脂洗脫，收集45％乙醇洗脫液得到小薊中抗腫瘤活性物質(zhì)。本發(fā)明首次驗(yàn)證小薊的抗腫瘤功效組分主要存在于45％乙醇洗脫部分，并依此得到以該活性部位制成的藥品和保健品。實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明提取的活性組分有明顯的抗腫瘤功能，又由于小薊本身就可食用，所以其具有無毒、安全等特點(diǎn)，以上述活性組分可以得到有效的抗腫瘤新藥和/或抗腫瘤保健品，具有高效、無毒且原料廉價(jià)易得的特點(diǎn)。文檔編號(hào)A61P35/00GK101564410SQ20091008529公開日2009年10月28日申請(qǐng)日期2009年6月5日優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日發(fā)明者尚小雅,李泠泠,李金杰申請(qǐng)人:北京聯(lián)合大學(xué)