專利名稱：接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中成藥含量測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種含骨碎補(bǔ)的中成藥含量測(cè) 定方法，特別是涉及接骨續(xù)筋制劑中骨碎補(bǔ)的含量測(cè)定。本發(fā)明具體是以骨碎 補(bǔ)中的柚皮苷作為指標(biāo)成分計(jì)的含量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
接骨續(xù)筋片收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第11冊(cè)第170頁(yè)，標(biāo) 準(zhǔn)編號(hào)WS廠B-2226-96,處方為蜥蜴500g、骨碎補(bǔ)333g、穿山龍167g，劑型為 糖衣片，功能活血化瘀、消腫止痛，主治軟組織損傷、骨折等，但缺乏含量測(cè) 定方法。
骨碎補(bǔ)是接骨續(xù)筋片(糖衣片)以及按照接骨續(xù)筋片處方制成的薄膜衣片、分 散片、膠囊、顆粒劑等接骨續(xù)筋制劑的主要藥味，而柚皮苷是骨碎補(bǔ)的主要成 分之一，且性質(zhì)穩(wěn)定。因此，以柚皮苷含量作為接骨續(xù)筋制劑的質(zhì)量控制指標(biāo) 是一種行之有效的辦法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法，本發(fā)明 利用高效液相色譜法測(cè)定接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量，以提高接骨續(xù)筋制劑 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法包括以下步驟
1) 對(duì)照品溶液的制備取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，以甲醇溶解，再 用甲醇和l. 5 ~ 2. 5%的醋酸溶液稀釋，配制成一定柚皮苷濃度的對(duì)照品溶液；
2) 供試品溶液的制備取處理過(guò)的接骨續(xù)筋制劑樣品適量，精密稱定，加 甲醇適量，超聲提取，再用甲醇和1.5 2. 5%的醋酸溶液稀釋，配制成與對(duì)照品 溶液柚皮苷濃度相適應(yīng)的供試品溶液，用O. 45戶微孔濾膜濾過(guò)；
3) 采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，其色譜條件為色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；
流動(dòng)相甲醇1.5-2. 5%醋酸溶液=35 : 65 ~ 40 : 60; 柱溫35~45°C; 檢測(cè)波長(zhǎng)283nm;
4) 分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，測(cè)定柚皮苷色 譜峰的峰面積；
5) 以外標(biāo)法計(jì)算接骨續(xù)筋制劑樣品中的柚皮苷含量；
其中，制備成的對(duì)照品溶液與供試品溶液中的溶媒應(yīng)滿足甲醇1.5-2. 5% 醋酸溶液=1 : 0.8-1.3。
進(jìn)一步地，本發(fā)明的接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法包括
1) 對(duì)照品溶液的制備精密稱取柚皮苷對(duì)照品適量，置適當(dāng)?shù)牧科恐校?甲醇至刻度，搖勻，精密量取amL,置bmL量瓶中，加甲醇cmL，并滿足a+c^. 5b; 再用1. 5 ~ 2. 5%醋酸溶液稀釋至刻度，配制成一定柚皮苷濃度的對(duì)照品溶液；
2) 供試品溶液的制備精密稱取處理過(guò)的接骨續(xù)筋制劑樣品適量，置具塞 錐形瓶中，加甲醇25mL,稱定重量，超聲處理30min,冷卻至室溫，再稱定重量， 用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5mL，置10mL量瓶中，加 1.5~2. 5%醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，用O. 45戶微孔濾膜濾過(guò)，配制成與對(duì)照 品溶液柚皮苷濃度相適應(yīng)的供試品溶液；
3) 采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，其色譜條件為 色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；
流動(dòng)相甲醇1. 5 ~ 2. 5%醋酸溶液=35 : 65 ~ 40 : 60; 柱溫35~45°C; 檢測(cè)波長(zhǎng)2 8 3腿；
4) 分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，測(cè)定柚皮苷色 譜峰的峰面積；5)以外標(biāo)法計(jì)算接骨續(xù)筋制劑樣品中的柚皮苷含量； 以上百分濃度均為質(zhì)量百分濃度。
本發(fā)明接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法中
所述的對(duì)照品溶液為每lmL含10 6(^g柚皮苷的溶液，優(yōu)選每lmL含約30(ig 柚皮苷的溶液。
所述的流動(dòng)相比例可以適當(dāng)調(diào)整，但優(yōu)選甲醇1.5~2. 5%醋酸溶液=38 : 62;流動(dòng)相的流速為O. 8~ 1. 2mL . mirT1，優(yōu)選l. OmL . min—1。 所述的柱溫優(yōu)選4(TC。 進(jìn)樣量一般為10(aL或2(VL。
本發(fā)明中，所述對(duì)照品溶液和供試品溶液的柚皮苷濃度可做適當(dāng)調(diào)整，但 要與進(jìn)樣量相結(jié)合，以符合線性濃度范圍。
本發(fā)明中所述的接骨續(xù)筋制劑是指接骨續(xù)筋片(糖衣片、薄膜衣片、分散 片)、接骨續(xù)筋膠囊、接骨續(xù)筋顆粒劑等任何藥劑學(xué)中所述的劑型。
所述的接骨續(xù)筋制劑中柚皮苷的含量，是指接骨續(xù)筋制劑中骨碎補(bǔ)所含柚 皮苷的量。
本發(fā)明人認(rèn)為，中成藥標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代化是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的重要組成部分，含量 測(cè)定是中成藥標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代化的難點(diǎn)和重點(diǎn)。選擇中成藥的主要藥味中具有標(biāo)志性 的化學(xué)成分為指標(biāo)成分，測(cè)定其含量，是化學(xué)法測(cè)定中成藥含量的主要手段； 而發(fā)明與通用的藥品標(biāo)準(zhǔn)(特別是《中國(guó)藥典》)收載的中藥材所含指標(biāo)成分的 含量測(cè)定方法具有一致性的中成藥含量測(cè)定方法，也將應(yīng)該是化學(xué)法測(cè)定中成 藥含量的主流方向之一。
本發(fā)明選擇接骨續(xù)筋制劑中的主要藥味骨碎補(bǔ)所含柚皮苷為指標(biāo)成分，通 過(guò)采用高效液相色譜法測(cè)定接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量來(lái)作為接骨續(xù)筋制劑 的質(zhì)量控制指標(biāo)，所建立的測(cè)定方法專屬性強(qiáng)，線性關(guān)系好，準(zhǔn)確度高，重復(fù) 性好，測(cè)定時(shí)間短，簡(jiǎn)便、快速，可以更科學(xué)地評(píng)價(jià)柚皮苷的轉(zhuǎn)移率，有效地提高產(chǎn)品的質(zhì)量。
圖i是對(duì)照品溶液的高效液相色譜圖2是供試品溶液的高效液相色譜圖； 圖3是陰性對(duì)照溶液的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
接骨續(xù)筋片(依據(jù)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)WS廠B-2226-96處方制成的糖衣片)中的 柚皮苷含量測(cè)定。
1) 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(5^im, 4. 6mmx 200mm); 流動(dòng)相甲醇2.25%醋酸溶液=35 : 65; 流速0. 9mL min—； 檢測(cè)波長(zhǎng)283nm; 柱溫35°C。
理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于2000。
2) 對(duì)照品溶液的制備精密稱取在ll(TC千燥至恒重的柚皮苷對(duì)照品10rag， 置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取3mL,置10raL量瓶中，加甲醇 2mL，再用2. 25%醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。
3) 供試品溶液的制備將接骨續(xù)筋片除去糖衣，粉碎，混勻，稱取2. Og， 精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25mL,稱定重量，超聲處理30min，放冷， 再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5raL,置10mL 量瓶中，力口2.25%醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(O. 45,)濾過(guò)，即 得。
4) 測(cè)定法分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各2(^L，注入液相色譜
7儀，測(cè)定。
5)計(jì)算法按照外標(biāo)法計(jì)算，即得。
分別測(cè)定3批接骨續(xù)筋片樣品，每片接骨續(xù)筋片中含柚皮苷分別為O. 19, 0.21, 0. 20mg。 實(shí)施例2
接骨續(xù)筋膠囊(依據(jù)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-2226-96處方制成的膠囊，規(guī)格: 每粒裝0.4g)中的柚皮苷含量測(cè)定。
1) 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(10罔,4, 6mmx 250mm); 流動(dòng)相甲醇2. 25%醋酸溶液=38 : 62; 流速1. OmL min-1; 檢測(cè)波長(zhǎng)283nm; 柱溫4(TC。
理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于2000。
2) 對(duì)照品溶液的制備精密稱取柚皮苷對(duì)照品3mg,置10mL量瓶中，加甲 醇至刻度，搖勻，精密量取lmL,置10mL量瓶中，加甲醇4mL,再用2. 25%醋酸溶 液稀釋至刻度，制成每lmL含柚皮苷30ng的溶液，即得。
3) 供試品溶液的制備取接骨續(xù)筋膠囊內(nèi)容物2. Og，精密稱定，置具塞錐 形瓶中，加甲醇25mL,稱定重量，超聲處理30min,冷卻至室溫，再稱定重量， 用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5mL，置10mL量瓶中，加 2.25%醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(O. 45,)濾過(guò)，即得。
4) 測(cè)定法分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各10pL，注入液相色譜 儀，測(cè)定。
5) 計(jì)算法按照外標(biāo)法計(jì)算，即得。
分別測(cè)定3批接骨續(xù)筋膠囊樣品，每粒接骨續(xù)筋膠囊中含柚皮苷分別為0.26， 0.27， 0. 26mg。 實(shí)施例3
接骨續(xù)筋膠囊(依據(jù)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-2226-96處方制成的膠囊，規(guī)格: 每粒裝0.4g)中的柚皮苷含量測(cè)定。
1) 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(l(Vm， 4. 6mmx 250mm); 流動(dòng)相甲醇2. 25%醋酸溶液=40: 60; 流速1. 2mL min— 檢測(cè)波長(zhǎng)283nm; 柱溫45°C。
理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于2000。
2) 對(duì)照品溶液的制備精密稱取在ll(TC干燥至恒重的柚皮苷對(duì)照品15mg, 置50mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取lmL,置10mL量瓶中，加甲醇4mL， 再用2. 25%醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。
3) 供試品溶液的制備取接骨續(xù)筋膠囊內(nèi)容物2. Og，精密稱定，置具塞錐 形瓶中，加甲醇25mL，稱定重量，超聲處理30rain，冷卻至室溫，再稱定重量， 用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5mL，置10mL量瓶中，加 2.25%醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45，)濾過(guò)，即得。
4) 測(cè)定法分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各10^iL，注入液相色譜 儀，測(cè)定。
5) 計(jì)算法按照外標(biāo)法計(jì)算，即得。
分別測(cè)定3批接骨續(xù)筋膠囊樣品，每粒接骨續(xù)筋膠囊含柚皮苷分別為0. 26, 0.26， 0. 27mg。 實(shí)施例4
專屬性考察按照本發(fā)明提供的對(duì)照品溶液和供試品溶液制備方法分別制
9備對(duì)照品溶液和供試品溶液；按照接骨續(xù)筋制劑的處方比例及工藝制備缺骨碎 補(bǔ)的陰性對(duì)照樣品，再按照供試品溶液的制備方法，制備不含骨碎補(bǔ)的陰性對(duì) 照溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各1(^L注入液 相色譜儀，得到圖1~圖3的液相色譜圖。
由圖1和圖2可以看出，供試品溶液的高效液相色譜圖中，在與對(duì)照品溶
液高效液相色譜圖的相應(yīng)位置處有一個(gè)相同的柚皮苷色譜峰；而從圖3可以看 出，陰性對(duì)照溶液的高效液相色譜圖中，在此相應(yīng)位置上無(wú)色譜峰。說(shuō)明本發(fā) 明的測(cè)定方法具有專屬性。
實(shí)施例5
線性關(guān)系考察分別精密吸取對(duì)照品溶液(30.7mg . L-" 5、 10、 15、 20、 25jiL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以柚皮苷峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、對(duì)照品溶 液進(jìn)樣量(pg)為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y-1853.3X-1.5374， r-O. 9999。表明柚皮苷在0. 1535 ~ 0. 7675pg范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量線性關(guān)系 良好。
實(shí)施例6
重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品6份，分別測(cè)定其柚皮苷含量，RSD為0."y。， 表明本發(fā)明建立的測(cè)定方法重復(fù)性良好。 實(shí)施例7
穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，于制備后0、 2、 4、 6、 8h分別精密吸取 10nL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，柚皮苷峰面積的RSD為0.20%,表明供試 品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
實(shí)施例8
回收率試驗(yàn)采用加樣回收法，取已知柚皮苷含量的同一批樣品內(nèi)容物6 份，分別精密加入柚皮苷對(duì)照品甲醇溶液2. 5mL(307mg L-1)，再分別測(cè)定其柚 皮苷含量，計(jì)算平均回收率及其RSD,見表l。表l柚皮苷加樣回收率取樣量樣品中含量測(cè)得量回收率平均值RSD
(g)(mg )(mg )(y。("(%)
1. 02830. 66841. 422198. 2
1. 01520. 65991. 422299. 3
1. 00380. 65251. 410498. 7
99. 10. 67
1. 02090. 66361. 428199. 6
1. 01920. 66251. 420398. 7
0. 99260. 64521. 4125100. 0
權(quán)利要求
1、接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法，包括以下步驟1)對(duì)照品溶液的制備取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，以甲醇溶解，再用甲醇和1.5～2.5％的醋酸溶液稀釋，配制成一定柚皮苷濃度的對(duì)照品溶液；2)供試品溶液的制備取處理過(guò)的接骨續(xù)筋制劑樣品適量，精密稱定，加甲醇適量，超聲提取，再用甲醇和1.5～2.5％的醋酸溶液稀釋，配制成與對(duì)照品溶液柚皮苷濃度相適應(yīng)的供試品溶液，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)；3)采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，其色譜條件為色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；流動(dòng)相甲醇1.5～2.5％醋酸溶液＝35∶65～40∶60；柱溫35～45℃；檢測(cè)波長(zhǎng)283nm；4)分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，測(cè)定柚皮苷色譜峰的峰面積；5)以外標(biāo)法計(jì)算接骨續(xù)筋制劑樣品中的柚皮苷含量；其中，制備成的對(duì)照品溶液與供試品溶液中的溶媒應(yīng)滿足甲醇1.5～2.5％醋酸溶液＝1∶0.8～1.3；以上百分濃度均為質(zhì)量百分濃度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法，其特征 是包括以下步驟1) 對(duì)照品溶液的制備精密稱取柚皮苷對(duì)照品適量，置適當(dāng)?shù)牧科恐校?甲醇至刻度，搖勻，精密量取amL，置bmL量瓶中，加甲醇cmL,并滿足a+c^. 5b; 再用1. 5 ~ 2. 5%醋酸溶液稀釋至刻度，配制成一定柚皮苷濃度的對(duì)照品溶液；2) 供試品溶液的制備精密稱取處理過(guò)的接骨續(xù)筋制劑樣品適量，置具塞 錐形瓶中，加甲醇25mL,稱定重量，超聲處理30min,冷卻至室溫，再稱定重量， 用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5mL,置10mL量瓶中，加,1. 5~2. 5%醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.45pm微孔濾膜濾過(guò)，配制成與對(duì)照 品溶液柚皮苷濃度相適應(yīng)的供試品溶液；3) 采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，其色譜條件為 色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；流動(dòng)相甲醇1.5~2. 5%醋酸溶液=35 : 65 - 40 : 60; 柱溫35~45°C; 檢測(cè)波長(zhǎng)283nm;4) 分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，測(cè)定柚皮苷色 譜峰的峰面積；5) 以外標(biāo)法計(jì)算接骨續(xù)筋制劑樣品中的柚皮苷含量； 以上百分濃度均為質(zhì)量百分濃度。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法，其特 征是每lmL對(duì)照品溶液中含柚皮苷IO ~ 60pg。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法，其特 征是每1 mL對(duì)照品溶液中含柚皮苷約3 Ojig 。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法，其特征是所述接骨續(xù)筋制劑是接骨續(xù)筋片、接骨續(xù)筋膠囊、接骨續(xù)筋顆粒劑中的一種。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法，其特征是所述柚皮苷的含量是接骨續(xù)筋制劑中骨碎補(bǔ)所含柚皮苷的量。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法，其特 征是所述的流動(dòng)相優(yōu)選甲醇1. 5~2. 5%醋酸溶液=38 : 62。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法，其特 征是流動(dòng)相的流速為O. 8 ~ 1. 2mL min—。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法，其特 征是所述的柱溫優(yōu)選4(TC。
全文摘要
一種接骨續(xù)筋制劑中的柚皮苷含量測(cè)定方法，是選擇柚皮苷作為接骨續(xù)筋制劑中骨碎補(bǔ)的指標(biāo)成分，以甲醇和醋酸溶液配制柚皮苷對(duì)照品溶液和接骨續(xù)筋制劑供試品溶液，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，以甲醇∶1.5～2.5％醋酸溶液＝35∶65～40∶60為流動(dòng)相，在283nm檢測(cè)波長(zhǎng)下進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算接骨續(xù)筋制劑樣品中的柚皮苷含量。本發(fā)明建立的測(cè)定方法專屬性強(qiáng)，線性關(guān)系好，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，測(cè)定時(shí)間短，可依此方法科學(xué)評(píng)價(jià)柚皮苷的轉(zhuǎn)移率，有效提高產(chǎn)品的質(zhì)量。
文檔編號(hào)A61K36/88GK101485808SQ20091007385
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者平 朱, 娜 李, 王志敏 申請(qǐng)人:王志敏