專利名稱：：植物病毒在制備治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地說是涉及煙草花葉病毒在制備治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。植物病毒(煙草花葉病毒)轉(zhuǎn)染惡性腫瘤細(xì)胞(Hela)后，不僅在惡性腫瘤細(xì)胞中發(fā)生了復(fù)制，而且使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)空泡效應(yīng)誘導(dǎo)其發(fā)生了自噬(細(xì)胞程序性II型凋亡)及凋亡。
背景技術(shù)：
：1911年美國(guó)病毒學(xué)家勞斯發(fā)表醫(yī)學(xué)報(bào)告，首次提出癌腫瘤是病毒所致的這一學(xué)說，并獲得1966年的諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎(jiǎng)，時(shí)隔大半個(gè)世紀(jì)后德國(guó)科學(xué)家楚爾郝森因發(fā)現(xiàn)人類乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)引發(fā)子宮頸癌而獲得2008年諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)，再次論證了這一學(xué)說。上世紀(jì)初，醫(yī)生在臨床上觀察到一些患有腫瘤的病人在經(jīng)歷一場(chǎng)病毒感染之后驚奇的發(fā)現(xiàn)腫瘤消失了。這個(gè)謎團(tuán)一直在上世紀(jì)二十年代才得以解開，并引起眾多科學(xué)家及臨床醫(yī)生的重視，由此也興起了利用病毒治療腫瘤的嘗試。到上世紀(jì)中葉，己有50多種病毒被用于人或動(dòng)物腫瘤的治療[MullenJT，TanabeKK.2002.Viraloncolysis.Owco/og/W.7(2):廳-19;McCormickF.2001.Cancergenetherapy:fringeorcuttingedgei\to7evOmcw.1(2):130-41]。1956年，在美國(guó)國(guó)家癌癥研究所，Smith先生領(lǐng)導(dǎo)的課題組[Smitheta1.(1956)9:1211-1218]，利用10種野生的人類腺病毒感染Hela細(xì)胞或KB細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞裂解上清液對(duì)30多位患有子宮腫瘤的病人進(jìn)行原位注射及靜脈給藥治療。所有的病人在接受治療之后腫瘤腫塊縮小且出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞裂解現(xiàn)象。一直以來(lái)，生物界中存在不同種屬間的相互干擾現(xiàn)象，例如1928年英國(guó)細(xì)菌學(xué)家亞歷山大弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉菌會(huì)抑制葡萄球菌生長(zhǎng)而發(fā)明了青霉素，并因此而獲得1945年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，人類從此走進(jìn)抗生素時(shí)代；接著1946年美國(guó)科學(xué)家賽爾曼，瓦克斯曼發(fā)現(xiàn)鏈霉菌可抑制結(jié)核桿菌生長(zhǎng)，從而使鏈霉素廣泛應(yīng)用于抗結(jié)核治療，并因此獲得1952年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。近年來(lái)不斷有跨生物界遠(yuǎn)緣病毒入侵人類，比如SARS病毒來(lái)源于野生動(dòng)物棕櫚貓；HIV病毒來(lái)源于非洲黑猩猩。隨著病毒本身的高度變異，病毒能否入侵人體細(xì)胞，己經(jīng)不完全決定于特異性受體的有無(wú)。在生物進(jìn)化過程中，整個(gè)生物群體也在不斷地應(yīng)對(duì)跨生物界的全新病毒、或發(fā)生變異的原有病毒，先進(jìn)生物技術(shù)的拓展，削弱了原有的生物界物種屏障，多種轉(zhuǎn)染技術(shù)可以將蛋白、核酸、大顆粒物質(zhì)直接導(dǎo)入細(xì)胞；人類的探索活動(dòng)向世界各地縱深，拉近了人與不同物種間的距離，跨生物界生命物質(zhì)比以往任何時(shí)候都更容易發(fā)生交叉與融和。本發(fā)明就是以跨生物界遠(yuǎn)緣病毒入侵，即植物病毒入侵人類細(xì)胞為出發(fā)點(diǎn)，以引導(dǎo)治療腫瘤的新方向?yàn)槟繕?biāo)，為探索遠(yuǎn)緣病毒對(duì)人類致病病毒的干擾做了相關(guān)科學(xué)研究，發(fā)明采用對(duì)人類無(wú)特異性受體、無(wú)主動(dòng)侵襲性的植物病毒(煙草花葉病毒，TMV，以下簡(jiǎn)稱T病毒)，以及在全世界細(xì)胞研究中使用最早、應(yīng)用最廣泛的人類細(xì)胞Hda細(xì)胞系為代表進(jìn)行相關(guān)研究，借助生物轉(zhuǎn)染技術(shù)將T病毒直接導(dǎo)入Hela細(xì)胞。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于通過探索遠(yuǎn)緣病毒與人類致病病毒間的干擾，將植物病毒(T病毒)導(dǎo)入惡性腫瘤細(xì)胞(Hela)中，觀察植物病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用與影響，進(jìn)而提供T病毒在制備治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。為達(dá)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)措施-1)觀察到植物病毒可有效地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。2)觀察到植物病毒RNA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。3)觀察到植物病毒蛋白在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。4)觀察到植物病毒在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生了復(fù)制。5)觀察到植物病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)合成完整子代病毒顆粒。5)觀察到植物病毒誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。6)觀察到植物病毒誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。4本發(fā)明提供的技術(shù)方案是植物病毒在制備治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。所述植物病毒為煙草花葉病毒。所述惡性腫瘤為由病毒感染引起的惡性腫瘤。所述惡性腫瘤為由人乳頭瘤病毒引發(fā)的宮頸癌。所述藥物以載體形式增進(jìn)植物病毒的輸入，如脂質(zhì)體藥物制劑等。本發(fā)明將植物病毒(T病毒)成功導(dǎo)入惡性腫瘤細(xì)胞中，進(jìn)一步T病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了復(fù)制并表達(dá)病毒蛋白，最終誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞(Hela)發(fā)生自噬與凋亡。本發(fā)明尚屬首創(chuàng)，野生型的植物病毒(T病毒)被有效地轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞(Hela)中，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了復(fù)制并合成了子代病毒顆粒，進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬與凋亡現(xiàn)象。針對(duì)該植物病毒這一特性可將其用于腫瘤的治療，如隨后具體實(shí)施例結(jié)果所示，T病毒對(duì)于腫瘤細(xì)胞無(wú)論在核酸水平還是蛋白水平都具有良好的抑瘤效果。該病毒可制備用于治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，可將其制成活性成分，在腫瘤治療中通過各種途徑給藥包括但不限于腫瘤內(nèi)給藥以及局部腫瘤血管內(nèi)給藥或者通過脂質(zhì)體包裝該病毒為一種脂質(zhì)體藥物制劑直接導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮殺傷腫瘤效應(yīng)。另外，還可將其以液體的形式配成注射液、噴霧劑、滴液等，直接用于惡性腫瘤治療中。另外，該病毒還可用于聯(lián)合其他治療惡性腫瘤的手段比如化學(xué)藥物療法、局部或瘤內(nèi)放射療法等非手術(shù)治療手段，而作為一種輔助抑瘤手段，或者是用于惡性腫瘤術(shù)后瘤床的治療。除此之外，植物病毒還可攜帶較大的外源基因如抑制血管生成的基因或能刺激免疫活性的基因進(jìn)入耙向器官，并具有更高的穩(wěn)定性。相比于以往一些進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的載體系統(tǒng)來(lái)說，植物病毒還具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果首先它易于制備，該病毒能在植物體內(nèi)可進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)；其次生物安全性高，相比動(dòng)物病毒來(lái)說，以遠(yuǎn)緣的植物病毒治療人類惡性腫瘤具有更高的安全性。本發(fā)明應(yīng)用于惡性腫瘤的治療，所指惡性腫瘤包括惡性上皮腫瘤與惡性非上皮腫瘤等。惡性上皮腫瘤包括癌與腺癌；其中包括但不限于宮頸癌、乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、肝癌等。惡性非上皮腫瘤包括但不限于卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、骨肉瘤、惡性黑色素瘤、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、血管瘤等。圖l為本發(fā)明摸索T病毒RNA經(jīng)Lippofectamine2000轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞的條件；圖2為本發(fā)明RT-PCR檢測(cè)T病毒正負(fù)鏈RNA在Hela細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；圖3為本發(fā)明Real-TimePCR檢測(cè)Hela細(xì)胞內(nèi)T病毒正負(fù)鏈RNA相對(duì)量；圖4為本發(fā)明Westernblot檢測(cè)T病毒在Hela細(xì)胞中CP的表達(dá)；圖5為本發(fā)明免疫熒光檢測(cè)Hela細(xì)胞內(nèi)CP的表達(dá)；圖6為本發(fā)明透射電鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染T病毒的Hela細(xì)胞內(nèi)的情況；圖7為本發(fā)明光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染T病毒的Hela細(xì)胞內(nèi)的自噬泡；圖8為本發(fā)明RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染T病毒的Hela細(xì)胞自噬基因Bedin-l的核酸水平變化表達(dá)；圖9為本發(fā)明Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染T病毒的Hela細(xì)胞自噬基因Beclin-1蛋白水平變化表達(dá)；圖10為本發(fā)明RT-PCR檢測(cè)T病毒RNA為誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生自噬的關(guān)鍵因素;圖11為本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染T病毒的Hela細(xì)胞凋亡率。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明試劑來(lái)源Lipofectamine2000(脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑)由Invitrogen公司提供。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol試劑、PCR試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒由MBI公司提供。T病毒衣殼蛋白(CP)多克隆抗體，本室制備兔抗血清，親和層析純化。Beclin-1單抗，由晶美生物技術(shù)有限公司提供。PVDF膜、DTT、Tween-20、DAB顯色試劑盒，由凌飛科技技術(shù)有限公司提供。AnnexinV/PIapoptosiskit由MULTISCIENCES公司提供。細(xì)胞固定劑武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院結(jié)構(gòu)中心電鏡室配制。透射電鏡HitachiH-600,由武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)結(jié)構(gòu)中心提供。一、提取T病毒從新鮮植物中直接提取T病毒，具體歩驟如下l)研磨新鮮(或冰凍)葉片放入研缽，加入液氮迅速研磨，至綠色粉末。2)過濾粉末移入量杯，加入3倍體積0.1M磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.2)，再加入0.1%巰基乙醇，攪拌10min，三層紗布過濾，收集濾液。3)氯仿沉淀攪拌濾液，緩慢加入10%氯仿(V/V)，混勻30min，靜置30min，離心(12000rpm，20min)，小心收集上清。4)鹽/PEG沉淀攪拌上清，緩慢加入4%(W/V)NaCl粉末，溶解后再緩慢加入4%(w/v)PEG6000粉末，攪拌4-10h，靜置10h，離心(12000rpm，20min),收集沉淀。5)洗滌沉淀沉淀中加入0.01M鹽酸緩沖液，20-30ml，攪拌4-10h，至全部溶解，離心(12000rpm，20min)，小心收集上清。沉淀重復(fù)處理1次。6)蔗糖墊超離上清底部小心加入20。/。(W/V)蔗糖10ml，離心(40000rpm，l-2h)，收集沉淀。7)收集沉淀沉淀中加入0.01MPB，3-5ml，重懸后，分裝-20。C保存?zhèn)溆?。二、建立T病毒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞(Hela)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體系1)提病毒RNA:發(fā)病葉片總RNA提取參照[LogemannJ，SchellJ，WillmitzerL.1987.ImprovedmethodfortheisolationofRNAfromplanttissues.爿wa/所oc/ze附.15;163(1):16-20]的方法進(jìn)行。2)摸索轉(zhuǎn)染條件按上述步驟提取T病毒總RNA后，先建立T病毒轉(zhuǎn)染惡性腫瘤細(xì)胞(Hela)的轉(zhuǎn)染體系，摸索T病毒RNA經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞的條件。轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行，將Lipofectamine2000與T-RNA分別以1:1、1:2、h3的比例轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，分別取T病毒RNA8嗎、16嗎、24嗎，分別溶于500pl無(wú)血清培養(yǎng)基，得到A液；取Lipofectamine200010pl加入500nl無(wú)血清培養(yǎng)基中，得到B液。將A、B液分別混勻，室溫孵育20min。孵育期間用無(wú)血清培養(yǎng)基將Hela細(xì)胞洗一遍，并加入無(wú)血清培養(yǎng)基，將A，B混合液加入到細(xì)胞中，輕輕混勻，放置37。C培養(yǎng)箱中孵育4-6h。3)通過PCR技術(shù)檢測(cè)，具體步驟如下采用Trizol法分別抽提三種轉(zhuǎn)染比例(1:1、1:2、1:3)的細(xì)胞總RNA，分別以5，TTAAGTTGCAGGACCAGAGG3，和5，ATGTCTTATAGTATCACTACTCCATC3，與01igo(dT)18—起為引物，按MBI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明合成cDNA，再用PCR試劑盒，以cDNA為模板，分別以T病毒CP的正向引物(5TCGTGTTCTTGTCATCAGCGTGGG3')和反向引物(5，GCCACCGTTGCGTCGTCTACTCT3，)擴(kuò)增目的DNA。反應(yīng)體系為Template(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即分別加入T病毒CP引物、01igo(dT),8進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到的T病毒cDNA及ActincDNA)4pl，10xTaqBuffer(NH4S04)5nl，2.5mMdNTPmix5^1，F(xiàn)orwardprimer(25|oM)2^1，Reverseprimer(25nM)2jal，Taq酶(5u/|xl)0.4^1，ddH2031.6^1。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94。C45sec，53。C45sec，72。C45sec，35個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)觀察目的條帶，內(nèi)參照Actin為297bp。4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，以RNA:LIP=1:1的情況下，可以將T病毒RNA轉(zhuǎn)染至Hda細(xì)胞中。這說明，我們己成功建立T病毒轉(zhuǎn)染惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染體系，當(dāng)T-RNA:LIP-1:1時(shí)為最佳轉(zhuǎn)染條件。三、檢測(cè)T病毒轉(zhuǎn)染至Hda細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況1.RT-PCR檢測(cè)Hela細(xì)胞T病毒衣殼蛋白(T-CP)的正負(fù)鏈RNA的表達(dá)水平1)收集轉(zhuǎn)染T病毒后的Heal細(xì)胞，提取其總RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下將實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)組，其中未轉(zhuǎn)染T病毒RNA的Hela細(xì)胞(normalcell，NC)為正常對(duì)照，經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染T-RNA后分別于24h、48h、72h收集的Hela細(xì)胞。采用Trizol法分別抽提細(xì)胞2組Hela細(xì)胞總RNA，分別以5'TTAAGTTGCAGGACCAGAGG3'和5'ATGTCTTATAGTATCACTACTCCATC3'與Oligo(dT),s—起為引物，按MBI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明合成T病毒CPcDNA，再用PCR試劑盒，以cDNA為模板，分別以T病毒CP正向引物(5TCGTGTTCTTGTCATCAGCGTGGG3')禾B反向弓l物(5，GCCACCGTTGCGTCGTCTACTCT3')及Actin正向引物(5'TCACCCACACTGTGCCCCATCTACGA3')和反向引物(5'CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3')擴(kuò)增目的DNA。反應(yīng)體系為Template(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即分別加入T病毒衣殼蛋白基因正反向引物、01igo(dT)18進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA)4^1，10xTaqBuffer(NH4S04)5|il，2.5mMdNTPmix5^1，F(xiàn)orwardprimer(25pM)2^1,8Reverseprimer(25,2^1，Taq酶(5,0.4jxl，ddH2031.6jxl。反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min;94°C45sec，53°C45sec,72°C45sec，35個(gè)循環(huán);最后于72°C延伸5min。Actin為內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)觀察目的條帶。2)結(jié)果如圖2所示，經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染后的分別收集的24h、48h、72hHela細(xì)胞中清晰可見T病毒基因組衣殼蛋白CP正、負(fù)鏈RNA的條帶。由此說明T病毒CP正負(fù)鏈RNA在Hela細(xì)胞中持續(xù)存在達(dá)72h，T病毒RNA經(jīng)Lipofectamine2000己成功轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞中，并在Hela細(xì)胞中發(fā)生了復(fù)制。2.Real-TimePCR檢測(cè)Hela細(xì)胞T病毒衣殼蛋白(T-CP)正負(fù)鏈RNA相對(duì)量1)T病毒RNA經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞后，分別于6h、24h、48h、72h、96h收集Hela細(xì)胞，通過Real-TimePCR檢測(cè)Hela細(xì)胞T病毒CP的正負(fù)鏈RNA的相對(duì)量。2)具體實(shí)驗(yàn)步驟如下用Trizol試劑提取在不同時(shí)段(6h、24h、48h、72h、96h)收集的Hela細(xì)胞總RNA，以T病毒CP反向引物(5'TTAAGTTGCAGGACCAGAGG3')為引物，按MBI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明合成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR以SYBRGreenI為熒光標(biāo)記，并用ABIPRISM7700系統(tǒng)檢測(cè)，每一個(gè)PCR循環(huán)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)為實(shí)時(shí)定量PCR提供信息。特異性引物序列為T病毒CP正向引物(5TCGTGTTCTTGTCATCAGCGTGGG3，)和反向引物(5'GCCACCGTTGCGTCGTCTACTCT3,)，Actin正向引物(5'TCACCCACACTGTGCCCCATCTACGA3')和反向引物(5'CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3')。反應(yīng)體系為Template(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即分別加入T病毒衣殼蛋白基因正反向引物、Oligo(dT),s進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA)4^1，10xTaqBuffer(NH4S04)5^1，MgCl23nl,2.5mM證Pmix5pl，F(xiàn)orwardprimer(25,2^1Reverseprimer(25pM)2^1，Taq酶(5u4d)2pl，ddH2027pl。反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min;94°C45sec，53。C45see,72°C45sec，35個(gè)循環(huán);最后于72。C延伸5min。Actin為內(nèi)參照。3)如圖3所示，左圖為轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞內(nèi)T病毒CP正鏈RNA相對(duì)量，6h、24h、48h、72h、96h分別是對(duì)應(yīng)時(shí)間段收集的Hela細(xì)胞，結(jié)果如圖所示，不同時(shí)間段的Hela細(xì)胞均表達(dá)T病毒CP正鏈RNA，并且相對(duì)于其它時(shí)間段來(lái)說，48h的Hela細(xì)胞尤其高表達(dá)T病毒CP正鏈RNA;右圖為轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞9內(nèi)T病毒CP負(fù)鏈RNA相對(duì)量，6h、24h、48h、72h、96h分別是對(duì)應(yīng)的時(shí)間段收集的Hela細(xì)胞。結(jié)果如圖所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染T病毒RNA的Hela細(xì)胞內(nèi)T病毒CP負(fù)鏈RNA相對(duì)量表達(dá)逐漸增多，96hHela細(xì)胞達(dá)到高峰。此結(jié)果從定量核酸水平證實(shí)了成功轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞中的T病毒在惡性腫瘤細(xì)胞Hela細(xì)胞中發(fā)生了復(fù)制，并且隨著時(shí)間的推移Hela細(xì)胞內(nèi)T病毒正負(fù)鏈RNA相對(duì)量逐漸增多。3.通過Westernblot檢測(cè)Hela細(xì)胞內(nèi)T病毒衣殼蛋白(CP)的蛋白水平變化1)T病毒RNA經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞后，對(duì)其CP的蛋白量做了相應(yīng)檢測(cè)，具體步驟如下A.SDS-PAGE:配制12n/。SDS-PAGE膠，將蛋白質(zhì)預(yù)染Marker及處理好的蛋白樣品上清液(裂解Hela細(xì)胞得到的樣品)上樣，電泳;B.轉(zhuǎn)膜:將電泳后的凝膠鋪于電轉(zhuǎn)緩沖液浸泡過的濾紙上，膠上覆蓋PVDF膜，趕盡膠與膜之間的氣泡，按從電泳槽負(fù)極到正極的順序依次為濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙；連接電源，4°C，200mA，轉(zhuǎn)膜60min;C.封閉加入含5%(W/V)脫脂奶粉的PBST溶液浸泡PVDF膜，37°C，lh;然后倒掉封閉溶液，用PBST溶液清洗PVDF膜，約30min;D.—抗加入用5n/。(W/V)脫脂奶粉的PBST溶液按適當(dāng)比例稀釋的一抗溶液覆蓋PVDF膜，37°C，lh;然后倒掉封閉溶液，用PBST溶液清洗PVDF膜，約30min;E.二抗加入用5。/。(W/V)脫脂奶粉的PBST溶液按適當(dāng)比例稀釋的二抗溶液覆蓋PVDF膜，37°C，lh;然后倒掉封閉溶液，用PBST溶液清洗PVDF膜，約30min;F.檢測(cè)加入DAB顯色試劑盒中的試劑，室溫放置5min，放入到暗處，待膜顯色5min，觀察顯影情況。2)結(jié)果如圖4所示，N指未經(jīng)轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，作為正常對(duì)照，；a、b分別為轉(zhuǎn)染后于24h、48h收集的Hela細(xì)胞CP蛋白量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染T病毒RNA的正常Hela細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)CP基因，轉(zhuǎn)染T病毒RNA24h、48h后，Hela細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到CP的表達(dá)。結(jié)果說明T病毒能夠在Hela細(xì)胞中表達(dá)T病毒CP。4.利用免疫熒光檢測(cè)Hela細(xì)胞內(nèi)CP的表達(dá)情況1)T病毒RNA經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)48h后通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)對(duì)其CP進(jìn)行檢測(cè)，以未轉(zhuǎn)染T病毒RNA的正常Hela細(xì)胞為對(duì)照。2)具體步驟如下A.將無(wú)菌蓋玻片置于24孔板中；B.胰酶消化細(xì)胞，接種與24孔板，每孔lml，封口膜封蓋37。C培養(yǎng)24h;C.用PBS洗板3次，每次5min;D.4%甲醛室溫下固定30min;E.PBS洗3次，每次5min;F.0.2%TritonX-100透膜4min;G.PBS洗3次，每次5min;H.用PBS配制5%BSA，封閉30min;I.—抗兔抗人抗體，2.5mg/ml，分別用1%BSA按1:25、1:50、1:100、1:200稀釋，每個(gè)濃度加入3個(gè)孔，每孔400^,最后兩孔加等量PBS，作為陰性對(duì)照，細(xì)胞培養(yǎng)板放入濕盒，4。C過夜；J.移去一抗，PBS洗3次，每次5min;K.二抗FITC標(biāo)記的抗兔IgG，按1:50、1:100、1:200稀釋，分別加入一抗的三個(gè)孔內(nèi)，每孔的一抗、二抗?jié)舛热缦卤?；L.37°C，避光共孵育lh;M.避光條件下移去二抗，PBS洗3次；N.取出蓋玻片，置于載玻片上，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察；二抗<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1:一抗/二二抗?jié)舛缺?)通過效價(jià)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)B3最佳，I-抗?jié)舛葹?:50，II-抗?jié)舛葹?:200。如圖5所示，A為未轉(zhuǎn)染的正常對(duì)照；B-D為轉(zhuǎn)染T病毒48h的Hela細(xì)胞；C為光鏡下；B、D中箭頭所示為CP-FITC染色綠色，Barl0pm;實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染T病毒RNA后，CP在大多數(shù)Hda細(xì)胞中都有較強(qiáng)表達(dá)，CP位于特定位點(diǎn)(圖-5B)，而并非彌散整個(gè)細(xì)胞漿；CP與自噬體位置密切相關(guān)(圖-5D)。說明T病毒RNA能夠在人類Hela細(xì)胞中表達(dá)蛋白，并與自噬密切相關(guān)。5.通過透射電子顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染T病毒Hela細(xì)胞內(nèi)子代病毒粒體的復(fù)制情況1)T病毒RNA經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染48h小時(shí)后收集Hela細(xì)胞，用透射電子顯微鏡觀察48h的Hela細(xì)胞內(nèi)子代病毒粒體的復(fù)制情況。具體步驟如下:A.PBS洗滌細(xì)胞2次；B.離心(1000rpm,5min)，小心棄上清，EP管底細(xì)胞沉淀保留；C.4。C預(yù)冷細(xì)胞固定劑(2.5%戊二醛)300^1,沿管壁緩緩加入；D.送醫(yī)學(xué)院結(jié)構(gòu)中心電鏡室包埋制片。2)結(jié)果如圖6所示，A為未轉(zhuǎn)染的正常Hela細(xì)胞作對(duì)照；B-C為電鏡下在轉(zhuǎn)染T病毒后48h的Hela細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的子代病毒顆粒，如紅色箭頭所示。6-B中Bar500nm，6-C中Bar200nm。結(jié)果更一歩說明T病毒RNA成功轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞后，在Hela細(xì)胞除表達(dá)T病毒基因組核酸與蛋白外，并且還進(jìn)一步合成子代病毒完整顆粒，證實(shí)T病毒在人類Hek細(xì)胞內(nèi)確實(shí)發(fā)生了復(fù)制。以上5個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，均是證明T病毒在惡性腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)行為，說明植物病毒T病毒可以轉(zhuǎn)染進(jìn)入惡性腫瘤細(xì)胞中，并且利用人類宿主細(xì)胞(Hela)的酶系統(tǒng)、原料和能量復(fù)制T病毒的核酸，借助宿主細(xì)胞的核糖體翻譯T病毒衣殼蛋白(CP)，并合成了完整的子代病毒顆粒。四、檢測(cè)T病毒轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞后誘導(dǎo)其發(fā)生的自噬情況1.通過光鏡和掃描電鏡觀測(cè)Hela細(xì)胞中的自噬泡1)T病毒RNA經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，用光鏡和掃描電鏡制片觀察細(xì)胞自噬的形態(tài)學(xué)變化。具體歩驟如下A.PBS洗滌細(xì)胞2次；B.離心(1000rpm，5min)，小心棄上清，EP管底細(xì)胞沉淀保留；C.4°C預(yù)冷細(xì)胞固定劑(2.5%戊二醛)300^1，沿管壁緩緩加入；D.送醫(yī)學(xué)院結(jié)構(gòu)中心電鏡室包埋制片。2)經(jīng)Lipofectamine2000將T病毒轉(zhuǎn)染RNA至Hela細(xì)胞后，收集72h的Hela細(xì)胞分別在光鏡和電鏡下進(jìn)行觀測(cè)，如圖7所示，A、B分別為正常Hela細(xì)胞在光鏡和電鏡下的正常形態(tài)；C為光鏡下轉(zhuǎn)染T病毒72h后的Hela細(xì)胞，箭頭所示的為細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)的自噬空泡，Barl(Him;D為電鏡下轉(zhuǎn)染T病毒的Hda細(xì)胞中出現(xiàn)的自噬泡結(jié)構(gòu)，Bar20mn，右圖為局部放大圖；結(jié)果顯示相對(duì)于正常細(xì)胞來(lái)說，轉(zhuǎn)染T病毒72h后，Hela細(xì)胞出現(xiàn)典型的自噬現(xiàn)象。光鏡下細(xì)胞漿區(qū)域可見大量空泡樣結(jié)構(gòu)(圖7-C)，電鏡顯示空泡為雙層膜，泡腔內(nèi)存在膜樣或絮樣物質(zhì)(圖7-D)，推測(cè)為胞內(nèi)代謝、降解成分。說明經(jīng)脂質(zhì)體包裹的T病毒可誘導(dǎo)人類Hela細(xì)胞發(fā)生了很明顯的自噬現(xiàn)象，這是一種誘導(dǎo)細(xì)胞走向死亡途徑的n型凋亡。2.通過RT-PCR檢測(cè)Hela細(xì)胞中自噬基因Beclin-l的表達(dá)水平1)當(dāng)T病毒轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞后，通過檢測(cè)細(xì)胞中自噬基因Beclin-l的12核酸水平來(lái)觀察其自噬效應(yīng)的變化情況。2)具體步驟如下分別收集轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)(0、6h、24h、48h、72h、)的Hela細(xì)胞，用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA。得到Hela細(xì)胞總RNA后，以O(shè)ligo(dT)w為逆轉(zhuǎn)錄時(shí)引物，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明合成cDNA，再用PCR試劑盒，以cDNA為模板，分別以基因Beclin-l正向引物(5，ATACCGACTTGTTCCTTAC3')和反向引物(5'GTCTTCAATCTTGCCTTT3，)，基因Actin正向引物(5，TCACCCACACTGTGCCCCATCTACGA3')和反向引物(5'CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3')擴(kuò)增目的DNA。反應(yīng)體系為Template(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即加入01igo(dT)18進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA)4^1，10xTaqBuffer(NH4S04)5^1，MgCl23(xl，2.5mMdNTPmix5^1，F(xiàn)orwardprimer(25pM)2plReverseprimer(25^iM)2pl，Taq酶(5u^l)2pl，ddH2027nl。反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min;94°C45see,51。C45sec，72°C45see,35個(gè)循環(huán);最后于72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。3)如圖8所示，相對(duì)應(yīng)的條帶分別為轉(zhuǎn)染后Oh、24h、48h、72h收集的Hela細(xì)胞基因Beclin-l的RT-PCR的結(jié)果；SF(Serumfree)為無(wú)血清時(shí)饑餓培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，作為陽(yáng)性對(duì)照；Actin為內(nèi)參基因Actin的RT-PCR結(jié)果；M為Marker;結(jié)果顯示，Hela細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志分子表達(dá)顯著增加，T病毒RNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后6h即可檢測(cè)到顯著增多的Bclin-lmRNA，高水平表達(dá)持續(xù)到72h。自噬基因Beclin-l的高表達(dá)可抑制惡性腫瘤細(xì)胞(Hela)的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。3.通過Westernblot檢測(cè)Hda細(xì)胞自噬基因的蛋白水平變化1)T病毒RNA經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞后，分別收集不同時(shí)間點(diǎn)(0、6h、24h、72h)的Hela細(xì)胞并對(duì)其Beclin-l的蛋白量做了相應(yīng)檢測(cè)，具體步驟如下A.SDS-PAGE:配制12%SDS-PAGE膠，將蛋白質(zhì)預(yù)染Marker及處理好的蛋白樣品上清液(裂解Hela細(xì)胞得到的樣品)上樣，電泳；B.轉(zhuǎn)膜將電泳后的凝膠鋪于電轉(zhuǎn)緩沖液浸泡過的濾紙上，膠上覆蓋PVDF膜，趕盡膠與膜之間的氣泡，按從電泳槽負(fù)極到正極的順序依次為濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙；連接電源，4°C，200mA，轉(zhuǎn)膜60min;C.封閉加入含5n/。(W/V)脫脂奶粉的PBST溶液浸泡PVDF膜，37°C，lh;然后倒掉封閉溶液，用PBST溶液清洗PVDF膜，約30min;D.—抗加入用5。/。(W/V)脫脂奶粉的PBST溶液按適當(dāng)比例稀13釋的一抗溶液覆蓋PVDF膜，37°C,lh;然后倒掉封閉溶液，用PBST溶液清洗PVDF膜，約30min;E.二抗加入用5。/。(W/V)脫脂奶粉的PBST溶液按適當(dāng)比例稀釋的二抗溶液覆蓋PVDF膜，37°C，lh;然后倒掉封閉溶液，用PBST溶液清洗PVDF膜，約30min;F.檢領(lǐng)!l:加入DAB顯色試劑盒中的試劑，室溫放置5min，放入到暗處，待膜顯色5min，觀察顯影情況。2)如圖9所示，相對(duì)應(yīng)的條帶分別為轉(zhuǎn)染后Oh、24h、48h、72h收集的Hela細(xì)胞中自噬基因Beclin-l的蛋白量；SF(Serumfree)為無(wú)血清時(shí)饑餓培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，作為陽(yáng)性對(duì)照；Actin為內(nèi)參基因Actin;M為Marker;實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染T病毒RNA的Hela細(xì)胞自噬基因Beclin-l蛋白量高表達(dá)，并且持續(xù)了72h。五、通過RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞自噬的核心因素1)利用RT-RCR檢測(cè)各處理組Hela細(xì)胞內(nèi)Beclin-l-mRNA，首先分別收集單加T病毒RNA的Hela細(xì)胞(RNA，R)、單加Lipofectamine2000的Hela細(xì)胞(Upofectine2000,L)、以及經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染T病毒RNA的Hela細(xì)胞(RNA+lipofectine2000，RL)、無(wú)任何處理的Hela細(xì)胞，并提取其總RNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，具體操作步驟見四-2。2)如圖10所示，M為marker;SF(Serumfree)為無(wú)血清時(shí)饑餓培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，作為陽(yáng)性對(duì)照；Blank為無(wú)處理Hda細(xì)胞；Lip為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(RL，RNA+Lip;R，RNA;L，Lip);結(jié)果顯示脂質(zhì)體處理細(xì)胞組(L)，沒有明顯Beclin-l表達(dá)，提示不能誘發(fā)自噬；細(xì)胞外裸露T病毒RNA(R)、紫外綿處理失活病毒也沒有明顯Beclin-l表達(dá)，提示不能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。只有轉(zhuǎn)染Ti毒RNA的細(xì)胞組、有活性的完整T病毒顆粒細(xì)胞組(RL)，可顯著誘導(dǎo)Beclin-l表達(dá)，提示誘導(dǎo)Hela細(xì)胞出現(xiàn)自噬的核心因素是病毒的核酸。六、檢測(cè)T病毒轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞后誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡的情況1)T病毒RNA經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，分別收集不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h)的Hela細(xì)胞后進(jìn)行AnnexinV/PI染色利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。根據(jù)AnnexinV/PI染色試劑盒說明書，操作步驟如下A.收集細(xì)胞約l-5xl()5個(gè)/ml，離心(500-1000rpm，5min)，棄培養(yǎng)液；B.3mlPBS洗滌2次；C.配制1Xannexin-bindingbuffer(將試劑盒中5Xannexin-bindingbuffer稀釋四倍)；D.離心(500-1000rpm，5min)，去PBS，加入500^1配好的1Xannexin-bindingbuffer,重懸細(xì)胞；E.加入5^1AnnexinV-FITC和10plPI染液，室溫孵育5min;F.流式細(xì)胞儀檢測(cè)。2)如圖11所示，A為正常對(duì)照組；B為單加Lipofectamine2000的Hela細(xì)胞(lipofectine2000，L);C-D分別為經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染T病毒RNA后24h、48h的Hela細(xì)胞。結(jié)果顯示，隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，T病毒可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別從核酸、蛋白水平檢測(cè)經(jīng)脂質(zhì)體包裹的T病毒RNA轉(zhuǎn)染至惡性腫瘤細(xì)胞(Hela)后，在Hda細(xì)胞中發(fā)生復(fù)制并組裝合成子代病毒顆粒，進(jìn)一歩在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)自噬基因Beclin-l，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制了腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。利用這一特性，將T病毒包裝成脂質(zhì)體藥物制劑運(yùn)送至實(shí)體瘤內(nèi)可最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬與凋亡，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，阻止腫瘤的惡性進(jìn)程。權(quán)利要求1.植物病毒在制備治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物病毒為煙草花葉病毒。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述惡性腫瘤為由病毒感染引起的惡性腫瘤。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述惡性腫瘤為由人乳頭瘤病毒引發(fā)的宮頸癌。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物以載體形式增進(jìn)植物病毒的輸入。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為脂質(zhì)體藥物制劑。全文摘要本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地說是涉及植物病毒在制備治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是以研究跨生物界遠(yuǎn)緣病毒入侵為出發(fā)點(diǎn)，以引導(dǎo)治療腫瘤的新方向?yàn)槟繕?biāo)，首次將植物病毒(煙草花葉病毒)成功轉(zhuǎn)染至惡性腫瘤細(xì)胞(Hela)中，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了復(fù)制并且誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬與凋亡。本發(fā)明可作為惡性腫瘤基因治療的一個(gè)新手段，為惡性腫瘤的治療開創(chuàng)一個(gè)新局面。文檔編號(hào)A61K35/66GK101653462SQ20091006337公開日2010年2月24日申請(qǐng)日期2009年7月28日優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日發(fā)明者何玉玲,瑞周,杰李,莉李,俐王,嵐王,威肖,肖睿景,譚錦泉申請(qǐng)人:武漢大學(xué)