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甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶及其制備與應(yīng)用的制作方法

文檔序號:1149089閱讀:544來源:國知局

專利名稱::甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及用甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶,及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)
:早在30多年前,Storr和Burton就提出控制氨基酸在腫瘤治療上的可能性(StorrJM,BurtonAF.Theeffectsofargininedeficiencyonlymphomacells.BrJCancer.30:50-59(1974)),其中,被研究的最多的是天冬酰胺酶,它能分解細(xì)胞生長和細(xì)胞生命維持所需的天冬酰胺。在許多白血病(Leukemia)患者中,白血病細(xì)胞與正常細(xì)胞不同,它們自己不能合成天冬酰胺,必須依靠外界提供的天冬酰胺來維持生存。天冬酰胺酶的治療耗盡體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所需的游離天冬酰胺,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡,而正常細(xì)胞不會受到太大影響。但是,L-天冬酰胺酶是來源于微生物,對人體來說具有很強的免疫原性,進(jìn)入人體以后很容易誘導(dǎo)生成抗天冬酰胺酶的抗體,產(chǎn)生副作用并影響其療效;但是,如同Y.K.Park等在AntieancerRes.1:373—376(1981)中描述的,由于L-天冬酰胺酶受其分子量大小的限制,進(jìn)入人體后容易被腎臟過濾清除,從而影響其在體內(nèi)的循環(huán)半衰期。用聚乙二醇共價修飾的大腸桿菌L-天冬酰胺酶降低了其抗原性,延長了其循環(huán)半衰期(Y.Kamisaki等,J.Pharmacol.Exp.Ther.216:410-414(1981));Y.Kamisaki等,Gann.73:47-474(1982))。正常細(xì)胞的生長不需要精氨酸,因為它們能通過由精氨琥珀酸合成酶和精氨琥珀酸裂解酶催化的一個兩步反應(yīng)從胍氨酸合成精氨酸。然而肝細(xì)胞瘤、黑色素瘤和其他一些的肉瘤不表達(dá)精氨琥珀酸合成酶,因而它們是精氨酸的營養(yǎng)缺陷型。精氮酸脫亞氨酶能催化精氨酸向胍氨酸的轉(zhuǎn)化,可被用來清除精氨酸。這方面的研究工作,最早是J.B.Jones在"精氮酸脫亞胺酶對小鼠白血病成淋巴細(xì)胞的作用",博士論文,TheUniversityofOklahoma,1-165頁(1981)中開始研究的。他從惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)中提取的精氨酸脫亞胺酶(ADI),在體外可以有效殺死腫瘤細(xì)胞,特別是肝癌和黑色素瘤相關(guān)的腫瘤細(xì)胞,但是從惡臭假單胞菌中提取的ADI在體內(nèi)卻沒能表現(xiàn)出其應(yīng)有的作用,研究發(fā)現(xiàn)是因為中性pH下幾乎沒有酶活性,并且因為惡臭假單胞菌中提取的精氨酸脫亞胺酶(ADI)對實驗動物來說具有很強的免疫原性,進(jìn)入機體以后很容易誘導(dǎo)生成抗體,形成抗原-抗體免疫復(fù)合物從實驗動物的血液循環(huán)中被快速清除,如Takakuetal,Int.J.Cancer,51:244-249(1992)和美國專利NO.5,474,928中描述的,在此將其公開全部引為參考。Takaku等人用聚乙二醇通過氰尿酰氯基團(tuán)對從精氨酸支原體中提取的精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行化學(xué)修飾。修飾后的精氮酸脫亞胺酶雖然在體外的生物學(xué)活性顯著下降,但是,由于PEG修飾降低了精氨酸脫亞胺酶的免疫原性,因此在體內(nèi)保留了抗腫瘤的活性(Takaku等,Jpn丄Cancer.Res.84:1195-1200(1993))。然而,限于當(dāng)時的技術(shù)水平,采用的修飾方式為氰尿酰氯連接基團(tuán),這種連接方式并不穩(wěn)定,而且有可能釋放出有毒的代謝產(chǎn)物,因此限制了其在臨床上的使用。進(jìn)一步的,Clark,MikeA在美國專利NO.6183738中所提到的,通過用琥珀酰亞胺基團(tuán)作為連接基團(tuán)來修飾精氨酸脫亞胺酶,避免了用氰尿酰氯基團(tuán)修飾存在的缺陷,也同樣制備獲得了在動物體內(nèi)具有抗腫瘤的活性的PEG化精氨酸脫亞胺酶,并在人體中的應(yīng)用進(jìn)行了研究(StevenACurley,Hepato-Gastroenterology,50:1208-1211(2003);Francescolzzo,JClinOncol.22:1815-1822(2004);PaoloA.Ascierto,JClinOncol23:7660-7668(2005))。但是,對于常規(guī)的用聚乙二醇來修飾生物活性的蛋白,包括精氨酸脫亞胺酶,L-天冬酰胺酶等都會導(dǎo)致酶活性的嚴(yán)重下降,甚至完全喪失。(RezaMehvarJ.PharmPharmaceutSci.3:125-136(2000))。例如O.Schiavon(IIFarmaco55:264—269(2000))研究了用不同的聚乙二醇來修飾Uricase,最終獲得的聚乙二醇化Uricase生物學(xué)活性僅為原來的0-40%之間;YuyingTan(PROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION12,45—52(1998));ZhijianYang(CANCERRESEARCH,64:6673~6678(2004)研究制備聚乙二醇化methioninase用于腫瘤的治療,用重均分子量為5000的聚乙二醇修飾methioninase后,也僅保留了40%的生物學(xué)活性。而且,對于一個蛋白分子結(jié)合多個聚乙二醇后,隨著聚乙二醇結(jié)合數(shù)量的增加,對活性的影響更加顯著。FrederickW.Holtsberg等(JournalofControlledRelease,80:259-271(2002))在研究聚乙二醇修飾精氨酸脫亞氨酶時發(fā)現(xiàn),當(dāng)一個精氨酸脫亞氨酶結(jié)合8-10個PEG2o,分子時,其酶活性僅保留了不到50%。對于用于治療用途的這些PEG修飾的酶,保留生物學(xué)活性和增加半衰期,降低免疫原性是一個矛盾。增加PEG修飾程度,可以增加酶在體內(nèi)的半衰期,降低免疫原性,但是,隨著PEG修飾度的增加,往往會導(dǎo)致活性的急劇下降,甚至喪失(YuyingTan,ProteinExpressionandPurification,12:45—52(1998))。如何尋找一個既可以保留或基本保留被修飾酶的活性,又可以增加酶在體內(nèi)的半衰期,降低免疫原性的制備方法,是人們一直在努力尋找的目標(biāo)。另一方面,聚乙二醇(PEG)分子必須通過一個活化基團(tuán)活化,才能與蛋白質(zhì)表面的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng),以共價鍵形式連接到蛋白質(zhì)分子上。但是,由于蛋白質(zhì)分子量巨大,因此其潛在的可以與活性PEG反應(yīng)的基團(tuán)也是數(shù)目眾多。在不同的位點結(jié)合PEG,其產(chǎn)物的穩(wěn)定性,生物學(xué)活性等性質(zhì)都是不同的。Yu-SenWang(AdvancedDrugDeliveryReviews54:547-570(2002))研究重組人干擾素a2a(IFNa2a)的PEG修飾時,就對此問題進(jìn)行了詳細(xì)闡述。當(dāng)用12KDsuccinimidylcarbonatePEG(SC-PEG)修飾時,IFNa2a分子中包括N端氨基,Lys,His等共有14個基團(tuán)可能被修飾,對于單修飾的PEG-IFNa2a,最終分析證明修飾制備所得的PEG-IFNa2a是由14種不同位點結(jié)合有一個PEG分子組成的混合物,而且這14種PEG-IFNa2a的活性是不一致的,其相對生物學(xué)活性最高保留了37%,最低僅保留了6%。同樣的,OlaffiKinstler等(美國專利US5985265,1999年公開)研究重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)的PEG修飾時也發(fā)現(xiàn),當(dāng)采用20KD的SCM-mPEG(N-hydroxysuccinimidylestersofcarboxymethylmethoxypolyethyleneglycol)修飾時,最終制備獲得的單一修飾的PEG-rhG-CSF是由N端,Lys35,Lys41分別結(jié)合有一個PEG分子組成的混合物。進(jìn)一步分析這三種不同的PEG-rhG-CSF分子,發(fā)現(xiàn)N端修飾的PEG-rhG-CSF活性最高,保留了原有活性的68%,Lys35和Lys41修飾產(chǎn)物活性分別為56n/。和2P/。,而且Lys35修飾產(chǎn)物是不穩(wěn)定的,在體外很容易被降解。為了解決PEG修飾rhG-CSF時存在的這些問題,該專利方法提供了一種特別的低pH修飾方法,使PEG能定向結(jié)合于rhG-CSF的N端,從而獲得均一,穩(wěn)定而且高活性的PEG-AG-CSF。但是,這些經(jīng)驗都無法用于精氨酸脫亞氨酶的PEG修飾。這是由于精氨酸脫亞氨酶的結(jié)構(gòu)都比這些蛋白要復(fù)雜的多,其一級結(jié)構(gòu)中有28個伯胺(視不同來源,精氨酸脫亞氨酶的伯胺數(shù)目會略有不同),現(xiàn)有的修飾方法,無法選擇對哪些伯胺基團(tuán)進(jìn)行修飾。因此,無論結(jié)合的PEG數(shù)量的多少,最終的修飾產(chǎn)物總是不均一的。以有28個伯胺的精氨酸脫亞氨酶為例,如果平均修飾有5個PEG分子,則大約有107種組合,如果平均結(jié)合10個PEG分子,則大約有5X10"種組合。即使某些伯胺基團(tuán)由于空間位阻的原因而不能與活性PEG反應(yīng),但是修飾反應(yīng)最終所產(chǎn)生的總產(chǎn)物種類數(shù)目仍然是驚人的。如果采用美國專利5985265中特殊的修飾方法,使PEG定點結(jié)合于精氨酸脫亞氨酶的N端,雖然可以保持相對較高的活性并獲得均一產(chǎn)物,但是N端結(jié)合PEG無法完全屏蔽精氨酸脫亞氨酶的免疫原性位點,仍然無法在臨床研究使用。因此,現(xiàn)有的PEG修飾的精氨酸脫亞氨酶存在很多的弊端l.有些伯胺基團(tuán)處于精氨酸脫亞氨酶活性位點,被修飾后會嚴(yán)重影響生物學(xué)活性,因此臨床使用勢必增加酶的用量,但酶用量的增加又會增加免疫原性;2.由于修飾位點的不確定,因此精氨酸脫亞氨酶具有強免疫原性的位點能否被屏蔽也是不確定的;3.由于修飾產(chǎn)物是由數(shù)量龐大的混合物組成,用現(xiàn)有的分析方法無法確定修飾混合物中具體每種修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和數(shù)量,因5此沒有很好的質(zhì)量控制手段來保證修飾的精氨酸脫亞氨酶混合物的質(zhì)量穩(wěn)定性。這些缺陷帶來的最終結(jié)果是用現(xiàn)有的修飾方法獲得的PEG化精氨酸脫亞氨酶在不同批次之間是有區(qū)別的,人們無法預(yù)測其生物學(xué)活性和免疫原性,也缺乏有效的手段進(jìn)行控制。這些缺陷己經(jīng)從現(xiàn)有的PEG化精氨酸脫亞氨酶臨床試驗中已經(jīng)得到表現(xiàn),如不確定的抗腫瘤藥效,重復(fù)給藥引起的免疫原性以及由此引發(fā)的一些嚴(yán)重的毒副作用,如嚴(yán)重的肝臟損傷,過敏反應(yīng),elevatedlipase(Li-JiuanShen,CurrentOpinioninMolecularTherapeutics8:240-248(2006))。許多研究已經(jīng)證明,增加蛋白質(zhì)或酶的修飾程度能增加修飾物的循環(huán)半衰期,然而增加修飾程度卻會減少蛋白或酶的生物學(xué)活性(RameshrajaP等,Currentaspectinpharmacologyofmodifiedhomoglobins[J]AdvdrugdelivReview.40,185(2000))。一般地,PEG修飾率低對酶活力影響小,但是半衰期短,被屏蔽的抗原決定簇也少,因此對降低免疫原性的作用也??;PEG修飾率高,半衰期更長,修飾蛋白中被屏蔽的抗原決定簇也多,因此對降低免疫原性的作用大,但是對生物學(xué)活性的影響也高。要提高修飾率,降低免疫原性,延長半衰期而不降低被修飾酶的生物學(xué)活性,在目前的技術(shù)條件下始終是一件極其困難的工作。本發(fā)明針對目前存在的這些問題,研究制備了一種高活性,無免疫原性的甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶,來克服現(xiàn)有產(chǎn)品存在的弊端。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷,提供一種mPEG修飾的精氨酸脫亞氨酶及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明一方面公開了一種甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的制備方法,包括下列步驟1.將精氨酸脫亞氨酶安慰性底物與精氨酸脫亞氨酶混合反應(yīng),使精氨酸脫亞氨酶安慰性底物與精氨酸脫亞氨酶的活性位點可逆結(jié)合;2.將結(jié)合了精氨酸脫亞氨酶安慰性底物的精氨酸脫亞氨酶用甲氧基聚乙二醇修飾;3.分離純化甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶并去除安慰性底物。步驟1中,精氨酸脫亞氨酶安慰性底物對精氨酸脫亞氨酶的摩爾比為1:1-50:1,在滿足精氨酸脫亞胺酶活性結(jié)合位點被安慰性底物飽和前提(原則)下,優(yōu)選的比例范圍是3:1-10:1。所述精氨酸脫亞氨酶安慰性底物選自BOC-精氨酸或FMOC-精氨酸。精氨酸脫亞氨酶安慰性底物與精氨酸脫亞氨酶混合反應(yīng)可在各種常規(guī)的甲氧基聚乙二醇修飾精氨酸脫亞氨酶用的緩沖體系中進(jìn)行,如100mMBicine,pH8.0。步驟2中,將精氨酸脫亞氨酶安慰性底物的精氨酸脫亞氨酶用甲氧基聚乙二醇修飾可采用已知的各種常規(guī)的甲氧基聚乙二醇修飾精氨酸脫亞氨酶的條件進(jìn)行。步驟3中,甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的純化可采用巳知的甲氧基聚乙二醇修飾精氨酸脫亞氨酶純化方式進(jìn)行,這樣可以獲得高活力的甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶。由于安慰性底物與酶之間是可逆性結(jié)合的,因此在吸附性層析純化過程中,修飾后的酶會與填料結(jié)合,但是未結(jié)合安慰性底物直接流出,與酶結(jié)合的安慰性底物在沖洗過程中動態(tài)解離而被去除。進(jìn)一步的,步驟3的分離純化步驟,包括將步驟2的產(chǎn)物通過結(jié)合有抗精氨酸脫亞氨酶抗體的親和層析柱去除暴露有免疫原性位點的聚乙二醇化精氨酸脫亞氨酶。分離純化步驟中增加該步驟可以獲得沒有免疫原性的甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶。如本發(fā)明實例列舉的,親和層析柱可以為CNBrSepharose4B親和層析柱??咕彼崦搧啺泵缚贵w優(yōu)選抗精氨酸脫亞氨酶多抗。結(jié)合有抗精氨酸脫亞氨酶抗體的親和層析柱中,抗精氨酸脫亞氨酶抗體與親和層析柱的混合比例較佳的為5土0.5mg抗體:lml填料。本發(fā)明第二方面,公開了由上述方法獲得的甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶。本發(fā)明獲得的聚乙二醇化精氨酸脫亞氨酶的基本保留了原有活性,更進(jìn)一步的,還可以沒有免疫原性。其中,所述的精氨酸脫亞氨酶是精氨酸支原體、人型支原體或關(guān)節(jié)炎型支原體的精氨酸脫亞氨酶。甲氧基聚乙二醇通過連接基團(tuán)與所述精氨酸脫亞胺酶的伯胺共價相連。所述的連接基團(tuán)是琥珀酰亞胺基團(tuán),包括琥珀酸琥珀酰亞胺酯、丙酸琥珀酰亞胺酯、羧甲酸琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺、N-羥基琥珀酰亞胺或其組合。所述的甲氧基聚乙二醇重均分子量范圍在5,000到60,000之間。所述的甲氧基聚乙二醇是線性的,也可以是分枝型的。所述的精氨酸脫亞胺酶與3個到10個聚乙二醇分子共價連接,優(yōu)選的是5-8個甲氧基聚乙二醇分子共價連接。本發(fā)明的第三方面,公開了一種藥物組合物,它通常含有安全有效量的本發(fā)明PEG-ADI以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)緩沖液、氨基酸、糖類、注射用水及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式,例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造。本發(fā)明的化合物可與磷酸鹽緩沖液或任何本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的適當(dāng)溶液相混合。根據(jù)需要,所述的PEG-ADI制劑可以固體(冷凍干燥)或液體劑型施用。本發(fā)明第四方面,還公開了上述mPEG修飾的精氨酸脫亞氨酶在制備治療癌癥藥物上的應(yīng)用。所述治療癌癥藥物可以是治療肉瘤、肝細(xì)胞瘤或黑色素瘤等癌癥的藥物。本發(fā)明中,術(shù)語"聚乙二醇"或"PEG"是指環(huán)氧乙垸和水的直鏈或支鏈形式縮聚物的混合物,由一般分子式HO(OCH2CH2)nOH來代表,在此n至少為4。用"聚乙二醇"或"PEG"連同其后面的數(shù)字后綴一同來表示它的大約平均分子量。例如,PEG2,q是指平均分子量大約為20,000的聚乙二醇。術(shù)語"甲氧基聚乙二醇"或"mPEG"是指通過環(huán)氧乙烷與甲氧根離子聚合產(chǎn)生的聚乙二醇術(shù)語"免疫原性"是指能剌激機體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞的特性。術(shù)語"安慰性底物"是指能與酶的活性中心結(jié)合,但是不能作為酶的底物的一類化合物。術(shù)語"修飾"是指用高分子化合物于蛋白質(zhì)上某些基團(tuán)通過共價鍵連接的過程。術(shù)語"生物學(xué)活性"是指在生物體內(nèi)或活細(xì)胞內(nèi)具有的某種生理功能。術(shù)語"半衰期"是指藥物從體內(nèi)消除一半所需的時間,也是血藥濃度下降一半所需要的時間,用"/2表示。術(shù)語"黑色素瘤"可以是一種從皮膚或其他器官(包括口腔、食道、肛門、陰道、小腦膜(leptomeningers)、結(jié)膜或眼睛)的黑色素細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)展而來的惡性或良性腫瘤。術(shù)語"肝細(xì)胞瘤"可以是肝的一種惡性或良性腫瘤,包括例如肝細(xì)胞性癌。在本發(fā)明的公開中,以下的縮寫可能被應(yīng)用ADI,精氨酸脫亞胺酶;rADI,重組精氨酸脫亞胺酶;raADI,重組精氨酸支原體來源精氨酸脫亞胺酶;PEG,聚乙二醇;mPEG,甲氧基聚乙二醇;mPEG-rADI,甲氧基聚乙二醇修飾重組精氨酸脫亞胺酶;BOC-Arg,叔丁氧羰基精氨酸Fmoc-Arg,芴甲氧羰基精氨酸;SS,琥珀酸琥珀酰亞胺酯;SSA,琥珀酰亞胺基琥珀酰胺;SPA,丙酸琥珀酰亞胺酯NHS,N-羥基琥珀酰亞胺;PB,磷酸緩沖液;PBS,磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明的第一個創(chuàng)新是在修飾反應(yīng)體系中加入特定的精氨酸脫亞氨酶的安慰性底物,特異性保護(hù)ADI酶活性中心不被破壞,以提高修飾后的mPEG-ADI的活性。PEG修飾導(dǎo)致蛋白活性的下降,主要是因為PEG對蛋白活性位點中賴氨酸側(cè)鏈游離NH2基團(tuán)修飾引起。本發(fā)明的研究者通過大量的研究發(fā)現(xiàn),在PEG修飾反應(yīng)過程中添加ADI的安慰性底物,如BOC-Arg(A^-(feW陽Butoxycarbonyl)-L-arginine,分子式HN=C(NH2)NH(CH2)3CH(COOH)NHC(0)OC(CH3)3),F(xiàn)moc-Arg(A^-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-arginine,分子式C21H24N404)等,這些安慰性底物可以與ADI的催化活性位點可逆性地結(jié)合,因此在PEG修飾時由于空間位阻的作用,避免了位于活性位點的賴氨酸被PEG結(jié)合(如圖1所示),從而達(dá)到保護(hù)活性位點的作用,并且使得在同樣數(shù)量mPEG結(jié)合到rADI的情況下,與不加安慰性底物相比,修飾獲得的酶活力大大提高。這種保護(hù)性修飾方法通過三步反應(yīng)來完成第一步,rADI與可逆性保護(hù)試劑BOC-Arg結(jié)合;第二步,添加活性PEG進(jìn)行PEG修飾反應(yīng);第三步,分離獲得修飾產(chǎn)物。根據(jù)實例2提供的方法,比較了在不同修飾程度下采用本專利方法的優(yōu)越性。由表I的結(jié)果可看出,當(dāng)修飾率低時,添加安慰性底物對酶活力保留的影響較小。而當(dāng)raADhSPA-PEG2,比例為1:30(摩爾比)時未添加保護(hù)試劑的修飾產(chǎn)物酶活力保留40%,而添加保護(hù)試劑的選擇性修飾產(chǎn)物的酶活性保留提高到近80%。表1添加安慰性底物對SPA-PEGM(K)()修飾ADI活性的影響raADI:SPA-PEG2Q,比例相對ADI酶活性(%)保護(hù)試劑(-)保護(hù)試劑(+)1:588.391.0h1565.184.31:3045.778.5采用本發(fā)明上述方法修飾獲得的PEG-ADI還是不均一的,ADI分子上通常會連接數(shù)量不等的PEG分子,因此,始終還有部分PEG-ADI暴露有較多的抗原決定簇從而在重復(fù)給藥后產(chǎn)生免疫原性。本發(fā)明的另一個創(chuàng)新是采用特殊的分離純化方法,制備出免疫學(xué)上更均一的PEG-ADI。這種方法通過如下方式來實現(xiàn)的。首先是制備抗ADI的抗體。將ADI樣品免疫小鼠,如Balb/c鼠,然后用提取免疫后的鼠血清,經(jīng)蛋白A親和層析柱分離獲得抗ADI的鼠抗體。然后將抗ADI的鼠抗體用化學(xué)方法結(jié)合于層析載體,如溴化氰活化的瓊脂糖樹脂(CNBr-Sepharose),將修飾獲得的PEG-ADI混合物流經(jīng)該抗體柱,PEG-ADI混合物中那些還暴露有與抗體結(jié)合位點,也就是具有免疫原性的PEG-ADI被特異性結(jié)合而從混合物中除去,從而獲得免疫學(xué)上均一的PEG-ADI制品。類似的,也可以免疫兔,羊甚至黑猩猩等動物,來獲得相應(yīng)的抗ADI抗體,用來上述用途。本發(fā)明的化合物的治療有效量是能有效地抑制腫瘤生長的量。通常,治療以小劑量開始,然后逐漸增加劑量直至達(dá)到完全分解機體內(nèi)的精氨酸。通常,本發(fā)明的化合物的治療劑量可以是從約1到30U/kg,每周一次到大約每兩周一次。此外,本發(fā)明的PEG-ADI還可與其他治療劑聯(lián)合使用,如化學(xué)抗腫瘤治療劑以達(dá)到更好的抗腫瘤治療效果。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于通過在修飾反應(yīng)中添加安慰性底物來保護(hù)活性位點,修飾獲得的PEG-ADI與現(xiàn)有的修飾型PEG-ADI相比,在相同的修飾率下,具有更高的生物學(xué)活性。其次,通過特異性的親和層析去除有免疫原性的PEG-ADI,最終制備的PEG-ADI在活性高,免疫學(xué)上更均一,在體內(nèi)沒有免疫原性,從而在臨床中更為安全有效。圖l:保護(hù)反應(yīng)示意圖圖2:重組aADI(raADI)RP-HPLC圖圖3:正常鼠免疫原滴度試驗結(jié)果圖4:H22移植瘤模型藥效試驗具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1:重組ADI的生產(chǎn)許多研究已經(jīng)表明,多種支原體來源的ADI,雖然序列上有一定差異,但是其酶學(xué)特性是相同的。如精氨酸支原體(ATCC23243)(SEQIDNO:l)、人形支原體(ATCC23114)(SEQIDNO:2〉、關(guān)節(jié)炎支原體(ATCC23192)(SEQIDNO:3)來源的ADI,氨基酸序列同源性超過96%。文獻(xiàn)研究(Clark,MikeA,美國專利NO.6183738)已經(jīng)證明從比活性、Km、Vmax,和最適pH等方面證明這些酶是生化不可區(qū)分的。因此這些不同來源的ADI都適用于本發(fā)明。本發(fā)明以下的實例中以精氨酸支原體來源的ADI(簡稱aADI)做舉例說明。aADI基因來源于精氨酸型支原體,由于支原體的部分密碼子不能被大腸桿菌有效識別和翻譯,所以我們采用了全合成的方式,在不改變氨基酸結(jié)構(gòu)的前提下以大腸桿菌偏愛的密碼子來設(shè)計并合成aADI的全基因(見SEQIDNO:4)。參照S.Misawa在J.Biotechnology,36:145-155(1994)文獻(xiàn)方法構(gòu)建aADI表達(dá)株,并復(fù)性和純化。具體方法簡述如下aADI重組菌經(jīng)高密度發(fā)酵,離心,收集菌體,高壓勻漿破碎菌體,離心收集包涵體。lg包涵體溶解在15ml的增溶液(6M鹽酸胍,5mMEDTA,lOmMTris,pH8.5)中,室溫攪拌2小時。加入75(3-巰基乙醇繼續(xù)攪拌30min。然后將增溶液用1800ml的復(fù)性液(lOmMPB,pH7.2)緩慢稀釋,15'C攪拌復(fù)性48小時。復(fù)性液用蒸餾水稀釋兩倍,上樣于以流動相AUOmMPB,pH7.2)預(yù)平衡好的DEAESepharoseFastFlowXK50/20陰離子交換柱。用含0.5mol/LNaCl的流動相A以50ml/min的速度洗脫,收集目標(biāo)峰。DEAE柱洗脫的目標(biāo)峰中加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為1.0mol/L,上樣于以流動相A(lOmMPB,l.Omol/L硫酸銨pH7.2)預(yù)平衡好的PhenylSpharoseHPXK26/20疏水層析柱。以lOmMPB,pH7.2為流動相B,以10倍柱體積內(nèi)硫酸銨由l.Omol/L降至0.1mol/L的線性梯度洗脫,收集目標(biāo)峰。純化后的重組aADI(raADI)經(jīng)RP-HPLC證明純度達(dá)到98%(見附圖2)。每克包涵體最終獲得約10毫克蛋白。分子篩層析分析的結(jié)果表明,mADI為二聚體活性狀態(tài)(約90KD)。實施例2.ADI酶活性測定ADI以精氨酸(Arg)為底物,產(chǎn)物胍氨酸能與血尿氮試劑(BUN)在IOO'C高溫下反應(yīng)顯紅色。反應(yīng)體系中加入終濃度10mMArg,5ngADI,補充20mMPB(pH7.2)至500ul,37'C準(zhǔn)確反應(yīng)30min后,取50ul反應(yīng)液加入血尿氮試劑(BUN)中,混勻,沸水浴lOmin,最后測OD54o,以胍氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線??瞻讓φ諡椴患覣DI的血尿氮試劑(BUN)。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上換算反應(yīng)底物胍氨酸的含量(timol)。酶活力單位的定義1個酶活力單位(U)定義為37°C,1分鐘內(nèi)催化lumol精氨酸完全轉(zhuǎn)化為lfxmol胍氨酸的酶活力。用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量,計算ADI酶的比活力。最后測得純化后的raADI的比活力約為33U/mg。實施例3:raADI的PEG修飾修飾實驗分兩組進(jìn)行反應(yīng)(1):在100毫升1毫克/毫升的raADI溶液(緩沖體系為100mMBicine,pH8.0)中,按1:30摩爾比加入PEG試劑(mPEG2G。M-SPA,,Nektar)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時。修飾后的產(chǎn)物PEG-raADI用Phenyl-SepharoseHP純化,收集相應(yīng)目標(biāo)峰,最后用G25脫鹽柱除去(NH4)2S04。最終制備所得產(chǎn)物命名為mPEG2,o-raADI。反應(yīng)(2):除了先在raADI溶液中加入10毫克/毫升的BOC-Arg(對應(yīng)BOC-Arg:raADI的摩爾比為5:1),純化修飾產(chǎn)物可在洗脫前的平衡階段適當(dāng)增加平衡時間,利用安慰性底物與酶之間的可逆性結(jié)合與解離特性,則能方便的去除之,其他條件與反應(yīng)(l)完全一致,最終制備所得產(chǎn)物命名為P-mPEG20000-raADI(protectedmPEG20000-raADI)。反應(yīng)(3):除了BOC-Arg:raADI的摩爾比為l:1夕卜,其余同反應(yīng)2。反應(yīng)(4):除了安慰性底物采用Fmoc-Arg,且Fmoc-Arg:raADI的摩爾比為50:1夕卜,其余同反應(yīng)2。精氨酸脫亞胺酶的修飾程度的測定參照A.Abuchowski等在J.Biol.Chem,252,3582-3586(1977)描述的方法進(jìn)行,即用三硝基苯磺酸(TNBS)方法滴定游離氨基,通過比較PEG修飾前后游離氨基變化,確定修飾程度。酶活性檢測方法與實施例1一致。檢測結(jié)果見表2表2反應(yīng)PEG平均修飾數(shù)目比活性(U/mg)相對raADI酶活性(%)1mPEG2oooo-raADI8.215.145.72P-mPEG20000-raADIA8.525.978.5P-mPEG調(diào)o-raADIB8.324.273.34P-mPEG讓o-raADIC8.223.771.8實施例4:ADI鼠多克隆抗體的制備將純化的raADI溶于無菌的生理鹽水中,然后與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化制成免疫抗原溶液,采用皮下多點注射方法進(jìn)行免疫處理,按100yg/raADI(次.只)的劑量免疫6周齡Balb/c小鼠20只,隨后每次間隔2周再加強免疫2次(100ug/raADI與弗氏不完全佐劑),35-40天后摘小鼠眼球取血,靜止后離心收集血清,即得ADI小鼠多克隆抗體,血清樣品-7(TC低溫保存?zhèn)溆谩嵤├?:親和層析制備免疫學(xué)均一的P-PEG400(K)-raADI含抗raADI的多克隆抗體的腹水1500g離心10分鐘去除細(xì)胞。上樣于用平衡緩沖液(20mMPB,pH7.0)預(yù)先平衡好的HiTraprProteinAFF5ml柱,再用平衡緩沖液平衡5個柱體積,然后換用0.05M檸檬酸鈉(PH4.0)的洗脫緩沖液洗脫,收集目標(biāo)峰。含raADI多克隆抗體的組分按每毫升50ixL的比例加入lM的磷酸鈉(pH8.0)以中和pH。將純化的raADI多克隆抗體與以50mM磷酸鹽緩沖液,pH8.0預(yù)處理過的CNBrSepharose4B親和層析填料按5mgprotein:lml填料的比例混合,4。C過夜,以5倍體積的50mMTris-Cl,pH8.5的緩沖液洗脫未結(jié)合的蛋白。制備得到結(jié)合有raADI多克隆抗體的CNBr-Sepharose4B親和層析柱。將實施例3反應(yīng)的P-PEG2oo(X)-raADI的樣品于PBS中透析平衡除鹽后,緩慢上樣至預(yù)先用PBS充分平衡的結(jié)合有PEG-raADI多克隆抗體的CNBr-Sepharose4B親和層析柱上,收集流穿峰,用截留分子量為10000MWCO的AmiconUltm-4超濾管濃縮,比活性及酶活性檢測結(jié)果見表3。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例6:正常鼠免疫原性試驗選取10只6周齡Balb/C小鼠,分成3組,每組5只。分別肌注10U的mPEG2GOoo-raADI,P-mPEG2DOo()-raADI,取反應(yīng)2的產(chǎn)物,未經(jīng)親和層析純化的P-mPEG2W)WrraADI(命名為P-mPEG2,()-raADI-W),每周注射一次,共給藥五周。分別在注射前、注射后第三周、第五周時在小鼠尾靜脈取血檢測抗ADI抗體的滴度,抗體滴度檢測采用ELISA法,96孔板包被ADI蛋白,二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠多抗。結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明經(jīng)親和層析純化的P-mPEG2。,-raADI比未經(jīng)親和層析純化的P-mPEG2,o-raADI免疫原性有所降低,而未經(jīng)安慰性底物結(jié)合的mPEG2(KKX)-raADI免疫原性最高。實施例7:H22移植瘤模型藥效試驗為驗證P-PEG2G(X)Q-raADI抑制肝細(xì)胞性肝癌的作用,隨機選取30只6周齡Balb/C小鼠制備荷瘤鼠模型,每只鼠于背部皮下注射5X10S個小鼠肝癌細(xì)胞H22,荷瘤后讓瘤體生長到大約直徑0.5cm,分成4組,分別為P-PEG2,o-raADI治療組、raADI治療組、生理鹽水組,并以10只正常的Balb/C小鼠為對照組。分別肌注10IUP-PEG2(xK)o-raADI,10IUraADI,生理鹽水0.02ral/次'只。每周給藥一次,共給藥二周,停藥后小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)觀察二周。與raADI治療組和生理鹽水對照組比較,P-PEG2o,-raADI對H22荷瘤小鼠生存率明顯提高,至觀察期結(jié)束,荷瘤小鼠100%存活,在統(tǒng)計學(xué)上均有顯著差異(圖4)。表4的結(jié)果說明P-PEG2QWK)-raADI對H22移植瘤的生長具有顯著的抑制效應(yīng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍?!?10>杭州基偉生物技術(shù)有限公司〈120〉甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶及其制備與應(yīng)用<130>PCNJW090942<160>4<170>Patentlnversion3.1〈210〉1<211>409<212>PRT<213〉Mycoplasmaarthritidis<400>1MetSerValPheAspSerLysPhe15lieGlyGluLeuGluThrValLeu20LysGlylieHisValTyrSerGlu1015ValHisGluProGlyLysGlulie2530AspTyrlieThrProAlaArgLeuAspGluLeuLeuPheSerAlalie354045UuGluSerHisAspAlaArgLysGluHisLysGluPheValAlaGlu505560LeuLysLysArgGlylieAsnValValGluLeuValAspLeulieVal65707580GluThrTyrAspLeuAlaSerLysGluAlaLysGluLysLeuLeuGlu859095GluPheLeuAspAspSerAlaProValLeuSerAspGluHisArgAla100105110AlaValLysLysPheLeuGinSerGinLysSerThrArgSerLeuVal115120125GluTyrMetlieAlaGlylieThrLysHisAspLeuLyslieGluSer15AspLeuGluLeulie145AspProPheAla135ValAspProMet150ValGlyAsnGlySer165GinArgGluThrTyrLysVaJArg180LysLeuValAsn140ProAsnLeuTyrPheThrArg155160ValThrlieHisTyrMetArg170175PheSerArgPheValPheSerAsnHisPro195SerlieGluGlyLeu185ProTrpTyrTyrGlyLeu210LeuValValGlyVal225LeuAlaLysAsnThr200AspValPheGly215GluArgThrAspSer230LysAlaAsnLyslie245ValAlalieAsnValProLysTrp260MetLeuAspLyslieTyr220LeuGinThrlie235CysGluPheLysVal190AspProAlaGlu205AsnAsnAspThrGlu250Asn丄euMetHisTrpLeuThr275ValPheLysPheAsnAsp290AlaProGinProVal305SerlielieGlyAsp280TrpAspTyrAsp295AsnGlyLeuProThr265LysPheLeuTyrThrLeu240Arglie255LeuAspThr270SerProlieAla285AsnGlyGlyAspAsp310LysProThrLeuLys325AsplieGluArgAlaSerGinlie340ValAlaProGlyLeuVal300LeuGluAspLeuLeuLys315320lieProlieAlaGlyAlaGly330335ThrHisPheAspGlyThrAsnTyrLeuLysThrlie360AlaGlu345VallieGlyTyrAla355AsnAlaAlaLeuGluAlaAlaGlylieThrValLeuProPheAla365ValGly350ArgAsnGlu1370375380ArgGlyAsnGinLeuSerLeuGlyMetGlyAsnAlaArgCysMetSer385390395400MetProLeuSerArgLysAspValLys405〈210>2<211>409〈212>PRT〈213〉Mycoplasmahorainis〈400〉2SerValPheAspSerLysMet1lieAspLeuMet65GluGlyTyrGlu50LysGlulie35SerLeu20Thr5GluThrValProAlaArgHisAspAlaAspArgGlyThrTyrAspThrPheLeuAlaValPheMet130Arg115MetGlu100AlaLeu85Glulie70AlaArg55AsnSerThrValPheLeuLeuSerGlylieThr135PheAsnGlylie10LeuValHisGlu25LeuAspGluLeu40LysGluHisGinValValGluLeu75LysAlaAlaLys90ProVeilLeuThr105SerLysProThr120LysTyrGluLeuHisProLeuSer60ThrGluGluHisGly140ValTyrSerGlu15GlyArgGlulie30PheSerAlalie45PheValLyslieAspLeuValAla80GluPhelieGlu95MaAsnLysLys110GluMetValGlu125ValGluSerGluAsnGluLeulieValAspProMetProAsnLeuTyrPheThrArgAsp145150ProPheAlaSerValGlyAsnGly165lieValArgArgArgGluThrLeu180LeuValLysThr155ValThrlieHisPhe170AlaArgPheValHisProLys195MetProlieGluGlyGly210ValValGlyValSer225AlaLysAsnliePhe185TrpTyrTyrAsp160MetArgTyr175PheArgAsn190AlaMetLysProTrpTyrTyrAsdPro200205ValPhelieTyrAsnAsnGluThrLeuAsp215ArgThrAspLys245AlalieAsnValProLysTrpThrVal260LeuAspLysAsnLysPheLeuTyrSerAsn265PheLeuAsp235ValGlu250LeuMetAsn220ThrlieThrGlu230AlaAsnLysGluValGluPheLysArgLeuLeu240lieVal255ThrTrpLeuThrMetLeuAspLysAsnLys275280PheLysPheTrpAspTyrAspLeuValAspVal290ProGinProGinLeu305lielieAsnLysAsp295AsnGlyLeuPro310ProValLeulieHisLeuAsp270ProlieAlaAsn285GlyGlyAlaGluGlu325lieAlaArgGluThrGluMetGlu340LysProGlyLeuVallieGlyTyrAspThr345lieleuAsp315Prolie330AsnPheAsn300LysLeuLeuGlyAspAlaSer320GlyAlaGlyAla335AsnTyrGlyLeuAlalieLysProGlyLeuVal355360AlaAlaLeuLysAlaAlaGlylieThrThr350AsnGluLysArg365LeuProPheHisThrAsnAlaAlaLeuLysAlaAlaGlylieThrVal370375380GlyAsnGinLeuSerLeuGlyMetGlyAsnAlaArgCysMetSerMet385390ProLeuSerArgLysAspVal405〈210>3<211>410<212>PRT<213>Mycoplasmaarginini〈400〉3SerValPheAspSerLys395400LysTrpMet1lieAspLeuLeu65GluGlyTyrGlu50LysGlulie35SerLeu20Thr5GluSerValProAlaArgHisAspAlaAlaAsnAspThrTyrAspGluPheLeuValValGluAsp145Asplie130HisArg115MetGlu100AsnLeu85Asplie70AlaArg55AsnPheLysLeuVal25LeuAsp40LysGluValValSerGinGluSerGluPheLeuLysMetAlaGlyGluLeulielie135AspProVal105AlaLys120ThrLysProMetVal150ProPheAlaSerValGlyAsnGlyGlylie10HisGluGluLeuHisLysGluLeu75AlaLys90LeuSerLysThrTyrAspProAsn155ValThrHisValTyrProGlyLeuPhe45GinPhe60lieAsp30SerSerGlu15GlulieAlalieValAlaGluLeuAspLysLeuGluGluSerArg125LeuGly140LeuTyrHis110GluValAla80lieGlu95LysValLeuVallieGluAlaPhelieHisTyrThrArg160MetArgTyrLysVa]Arg180AsnHisProLysLeulie195SerlieGluGly165GinArgGluThr170LeuPheSerArg185ProTrpTyrTyrLysLeu210LeuValValGlyVal225LeuAlaLysAsnAsnThr200GlyAspValPhelie215GluArgThrAsp175PheValPheSer190AspProSerLeu205AsnAsnAspThrSer230ValAlaAsnLysTyr220GinThrVallie245ValAlalieAsnValProLysTrp260MetLeuAspLysLeu235CysGluPheLysTrpLeuThr275AsnAspValPheLysPhe290GluProGinProVal305SerlielieAsnGlu250ThrAsnLeuMetHis265LysPheLeuTyrThrLeu240Arglie255AspThrAsp280TrpAspTyrAspLeu295AsnGlyLeuProLeu270ProlieAlaSer285AsnGlyGlyAlaGlu310LysProValLeuVal300GluGlyLeuLys325GlulieGluArgLeu315ProlieAlaGlyAlaSerGinMet340TyrLeuAlalieArgProGlyValVallieGlyTyr355360AsnAlaAlaLeuGluAlaGlu345Vallie330ThrHisPheAspLeuGin320GluGly335GlyThrAsn350ArgAsnGluLysThrAsnAlaAlaLeuGluAlaAlaGlylie370375HisGlyAsnGinLeuSerLeuGlyMetGly385390MetProLeuSerArgLysAspValLysTrpSer365ValUuProPheAsn395Lys380AlaArgCysMetSer400405410〈210〉4〈211〉1233<212〉DNA〈213〉Mycoplasmaarthritidis〈400〉4atgtctgtatttg3C3gt^atttaaaggaattcacgttt60gaatcagttctsgttcacgaaccaggacgcg犯3ttg3Ct3tattac3ccagctagacta120gatg犯ttattattctcagcagccacgatgctag犯aaga180ttcgtagcagaaacgacatcaatgttgttgaatt犯ttg8tttagttgct240atttagcatcacaagaagctatttttagaa300g3CtC3g^Ccagttctatcagaaga^caca犯gtagttgtaaga^acttcttaaaagct360c犯gaa犯tt3gtagaaatc3tg3tggC3gggatcacaa3420ggtatcg犯gC3gatcaxigaattaatcgttgacccaatgccaaacctatacttcacacgt480gacccatttgcatcagtaggtaatggtgtaacaatccact3C3tgCgtt已caaagttaga540caacgtgaaacattattctcaagatttgtaLttctcaaettcaccctaaact600ccatgatactacgacccttcactaaaattatc犯tcg肪ggtgg卿cgtatttatctac660cattagtagttggtgtttctgaaagaactgacttacaaacagttacttta720tta_gcta^a>acattgttgc"tgtg犯ttca犯cgtattgttgc犯tt犯c780gttccaaaatga3c犯ax:tta^tgcactt3ga_c3catg3Ct犯C已3tgtt840aaattcctatactc3ccaatcgctaacgacgtatttei犯ttctgagattatgacttagta■咖ggtggagC6Lg£l£lCCeLC£Laccagttgaa犯cggattacctctagaaggattattacaa960tcaatcattaacaaaaaaccagtttt犯ttcctatcgcaggtg卿gtgc1020cttcgatggttagcaattagaccaggtgtt1080gt犯ttggttaacgctgctctagaagctgc1140gttcttccattccacggtaaccaattatcattaggtatgggtsacgctcgttgtatgtca1200atgcctttattgtt犯gtg3tag12332權(quán)利要求1.一種甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的制備方法,包括下列步驟a、將精氨酸脫亞氨酶安慰性底物與精氨酸脫亞氨酶混合反應(yīng),使精氨酸脫亞氨酶安慰性底物與精氨酸脫亞氨酶的活性位點結(jié)合;b、將結(jié)合了精氨酸脫亞氨酶安慰性底物的精氨酸脫亞氨酶用甲氧基聚乙二醇修飾;c、分離純化甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶。2.如權(quán)利要求l所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的制備方法,其特征在于,步驟a中,精氨酸脫亞氨酶安慰性底物對精氨酸脫亞氨酶的摩爾比為1:1-50:1。3.如權(quán)利要求2所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的制備方法,其特征在于,.所述精氨酸脫亞氨酶安慰性底物對精氨酸脫亞氨酶的摩爾比為3:1-10:1。4.如權(quán)利要求1所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的制備方法,其特征在于,所述精氨酸脫亞氨酶安慰性底物選自B0C-精氨酸或FM0C-精氨酸。5.如權(quán)利要求1-4任一權(quán)利要求所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的制備方法,其特征在于,所述步驟c的分離純化步驟,包括將步驟b的產(chǎn)物通過抗精氨酸脫亞氨酶抗體親和層析柱去除暴露有免疫原性位點的聚乙二醇化精氨酸脫亞氨酶。6.—種甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶,由權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的制備方法制得。7.如權(quán)利要求6所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶,其特征在于,所述的精氨酸脫亞氨酶為精氨酸支原體、人型支原體或關(guān)節(jié)炎型支原體的精氨酸脫亞氨酶。8.如權(quán)利要求6所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶,其特征在于,所述甲氧基聚乙二醇通過連接基團(tuán)與所述精氨酸脫亞胺酶的伯胺共價相連。9.一種藥物組合物,它含有安全有效量的權(quán)利要求6-8中任一權(quán)利要求所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。10.權(quán)利要求6-8中任一權(quán)利要求所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶在制備治療癌癥藥物上的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了用甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明通過在修飾反應(yīng)中添加安慰性底物來保護(hù)活性位點,修飾獲得的PEG-ADI與現(xiàn)有的修飾型EG-ADI相比,在相同的修飾率下,具有更高的生物學(xué)活性。其次,通過特異性的親和層析去除有免疫原性的PEG-ADI,最終制備的PEG-ADI在活性高,免疫學(xué)上更均一,在體內(nèi)沒有免疫原性,從而在臨床中更為安全有效。文檔編號A61K47/48GK101591649SQ20091005464公開日2009年12月2日申請日期2009年7月10日優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日發(fā)明者凌建群,梁偉峰,溫曉芳,王葉飛,王玉嬌,敏范,裘霽宛申請人:杭州基偉生物技術(shù)有限公司
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