專利名稱：用于治療黑色素瘤的雄黃的制作方法
用于治療黑色素瘤的雄黃
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雄黃的用途，尤其涉及在皮膚疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用。背景技術(shù)：
黑色素瘤是目前惡性腫瘤中發(fā)病率增長(zhǎng)最快的一種，年增長(zhǎng)率約3% 5%。盡管 對(duì)III期患者來(lái)說(shuō)高劑量IFN-a作為輔助治療能夠降低25% 30%相對(duì)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，并已 有2個(gè)臨床試驗(yàn)證實(shí)這部分患者可得到生存獲益；也盡管對(duì)IV期轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者來(lái) 說(shuō)，高劑量IL-2客觀反應(yīng)率可達(dá)到15%，并有6. 6 %的CR率，且獲CR的患者可持續(xù)CR數(shù) 年之久，但總體來(lái)說(shuō)，目前仍然沒(méi)有找到治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤最為有效的方法。雄黃最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，辛溫有毒，歸肝、大腸經(jīng)，其成分為二硫化二砷，具有 解毒、殺蟲、燥濕、祛痰、截瘧等作用，多作為外用藥治療癰瘡腫毒、蟲蛇咬傷、蟲積腹痛、疥 癬禿瘡?，F(xiàn)代研究表明，雄黃具有抗腫瘤作用，其機(jī)制為抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì) 胞凋亡、抑制核酸合成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，作為血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制荊，雄黃有直接細(xì)胞毒 作用等。雄黃對(duì)于K562，NB4等白血病細(xì)胞具有抑制作用，同時(shí)也能誘導(dǎo)實(shí)體腫瘤細(xì)胞 的凋亡，如肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1，肝癌細(xì)胞系BEL-7402，卵巢癌細(xì)胞株(OVCAR、GC、JAM、 CI80-13S)，其抗癌譜十分廣闊。而同時(shí)雄黃的毒副作用通常也是在臨床上十分關(guān)注的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種雄黃的新用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是雄黃在制備治療皮膚腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用。所述的皮膚腫瘤疾病是黑色素瘤疾病。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明對(duì)雄黃發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。(2)本發(fā)明的雄黃藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著很好的藥用前景。(3)雄黃對(duì)于細(xì)胞的周期沒(méi)有明顯的影響，而是從細(xì)胞凋亡的方面，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞 凋亡而達(dá)到損傷黑色素瘤細(xì)胞的作用，從而治療黑色素瘤皮膚疾病。
圖1雄黃對(duì)細(xì)胞存活率的影響。
圖2時(shí)效曲線。
圖3生長(zhǎng)曲線。
圖4:A375正常組染色結(jié)果(400 X)
圖5:A375給藥組染色結(jié)果(400 X)
圖6:L02正常組染色結(jié)果(400 X)
圖7 :L02給藥組染色結(jié)果(400 X)圖8 :MKN45正常組染色結(jié)果(400 X)
圖9 :MKN45給藥組染色結(jié)果(400 X)圖10 雄黃對(duì)三株細(xì)胞凋亡的影響，數(shù)據(jù)顯示經(jīng)藥物作用一定時(shí)間以后，不同的 細(xì)胞的凋亡程度不同，而對(duì)于正常細(xì)胞，其凋亡指數(shù)< 5%，可以認(rèn)為沒(méi)有發(fā)生細(xì)胞凋亡。圖11 雄黃對(duì)三株細(xì)胞周期的影響，數(shù)據(jù)顯示經(jīng)藥物作用一定時(shí)間以后，細(xì)胞周 期發(fā)生了不同的改變，但是總的來(lái)說(shuō)，其周期改變的程度并不明顯，由此推斷雄黃在細(xì)胞周 期改變的方面并沒(méi)有顯著的作用。圖12 雄黃對(duì)三株細(xì)胞上清LDH的影響，雄黃作用后36小時(shí)，細(xì)胞上清的LDH相 對(duì)與未加藥組有不同程度的上升，其中MKN-45的升高程度最為明顯，而細(xì)胞凋亡或壞死而 造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損害或完全裂解導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放外泄到培養(yǎng)液里，其中就包括 活性穩(wěn)定的乳酸脫氫酶，所以結(jié)果顯示雄黃對(duì)于MKN-45的損傷相對(duì)較深，而A375相對(duì)于正 常細(xì)胞基本沒(méi)有顯著的差異。圖13 雄黃對(duì)三株細(xì)胞上清AKP的影響，雄黃作用后36小時(shí)，細(xì)胞上清的AKP相 對(duì)與未加藥組有不同程度的上升，其中MKN-45的升高程度最為明顯，提示藥物可能對(duì)于 MKN-45細(xì)胞的促增生和分化作用比較強(qiáng)。圖14 細(xì)胞中總LDH含量測(cè)定結(jié)果，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的總LDH含量無(wú)顯著變化。圖15 細(xì)胞中總AKP的含量測(cè)定結(jié)果。與對(duì)照組相比，上述三株細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組的 AKP都有不同程度的降低，推斷雄黃對(duì)上述三株細(xì)胞均有一定程度的損傷。圖16 雄黃對(duì)L02的DNA ladder檢測(cè)結(jié)果。圖17雄黃對(duì)KMN-45和A375的DNA ladder檢測(cè)結(jié)果，正常細(xì)胞的對(duì)照組與實(shí)驗(yàn) 組無(wú)顯著差異，都無(wú)明顯的DNA ladder。與對(duì)照組相比，MKN-45, A375的實(shí)驗(yàn)組都有DNA ladder。圖18 :GSH的測(cè)定結(jié)果，由圖可知，雄黃作用24小時(shí)后，四株細(xì)胞的GSH水平都有 不同的增高，也都呈劑量依賴性的增高，H印G2，L02尤其明顯。圖19 :R0S的測(cè)定結(jié)果，由圖可知，雄黃作用24小時(shí)后，四株細(xì)胞的R0S水平都有 不同程度的降低，也都呈劑量依賴性。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1雄黃致腫瘤細(xì)胞凋亡的作用實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法1.測(cè)定雄黃母液的砷濃度2.測(cè)定半數(shù)抑制濃度(IC5Q)值3.測(cè)定時(shí)效曲線4測(cè)定生長(zhǎng)曲線5.通過(guò)HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)受試藥物雄黃
受試細(xì)胞:A375,MKN45，8898，HepG2, L02A375(人黑色素瘤細(xì)胞株)；MKN45 (人胃癌細(xì)胞株)；8898 (人胰腺癌細(xì)胞株)， H印G2 (人肝癌細(xì)胞株)，L02 (正常人肝細(xì)胞)。一.實(shí)驗(yàn)材料1.主要儀器Bio-Rad 公司酶標(biāo)儀(550 型)；倒置光學(xué)顯微鏡；96、24、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板；2.主要試劑MTT四甲基偶氮唑藍(lán)；RPMI-1640 培養(yǎng)基；二.實(shí)驗(yàn)方法1.測(cè)定雄黃母液的濃度經(jīng)原子吸收光譜法測(cè)定砷濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由華東理工大學(xué)化學(xué)分析測(cè)試中心提 {共。2.測(cè)定雄黃藥品的半數(shù)抑制濃度(IC5(I)值濃度設(shè)定10 u g/ml ；5 u g/ml ；2. 5 u g/ml ；1. 25 u g/ml ；0 共 5 個(gè)濃度細(xì)胞給藥培養(yǎng)；取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞懸液lOOiiL、濃度1 X 105/mL，于37°C，5% C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4小時(shí)后取出細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔加入不同稀釋濃度的藥物100 yL;空白對(duì) 照組加培養(yǎng)液100P L。每組濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置37°C，5% C02及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h。細(xì)胞活性測(cè)定；實(shí)驗(yàn)終止前4小時(shí)取出細(xì)胞培養(yǎng)板，先以倒置顯微鏡下觀察，后在每孔中加入MTT 工作液20iiL，終濃度5g/L。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入lOOylDMSO，振蕩lOmin。待MTT還原 產(chǎn)物完全溶解，在酶標(biāo)儀上選擇以492nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630nm為參考波長(zhǎng)測(cè)定光密度值(0D 值)。計(jì)算細(xì)胞的存活率，并以不同時(shí)間點(diǎn)和細(xì)胞的存活率作圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。細(xì)胞存活率=[試驗(yàn)組0D平均值]/ [空白對(duì)照組0D平均值]X 100 %3.測(cè)定時(shí)效曲線時(shí)間點(diǎn)設(shè)定Oh，6h，12h，24h，36，48h細(xì)胞給藥培養(yǎng)；取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞懸液100 y L、濃度隨測(cè)定時(shí)間的增加而降低， 于371，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4小時(shí)后取出細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔加入兩倍IC5(1值濃度的藥 物(L02除外，加入lOug/ml濃度的藥物)，空白對(duì)照組加培養(yǎng)液100yL。每組濃度設(shè)3個(gè) 復(fù)孔。置37°C，5 % C02及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞活性測(cè)定；實(shí)驗(yàn)終止前4小時(shí)取出細(xì)胞培養(yǎng)板，先以倒置顯微鏡下觀察，后在每孔中加入MTT
Heraeous公司二氧化碳培養(yǎng)箱； 無(wú)菌操作臺(tái) 磁力攪拌機(jī)
二甲基亞砜(DMS0，分析純)； 蘇木素伊紅溶液工作液20 u L，終濃度5g/L。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入100 u 1DMS0,振蕩lOmin。待MTT還原 產(chǎn)物完全溶解，在酶標(biāo)儀上選擇以492nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630nm為參考波長(zhǎng)測(cè)定光密度值(0D 值)。計(jì)算細(xì)胞的存活率，并以不同時(shí)間點(diǎn)和細(xì)胞的存活率作圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。細(xì)胞存活率=[試驗(yàn)組0D平均值]/ [空白對(duì)照組0D平均值]X 100 %4.測(cè)定生長(zhǎng)曲線時(shí)間點(diǎn)設(shè)定ld，2d，3d，4d，5d細(xì)胞給藥培養(yǎng)取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞懸液1000 y L、濃度隨測(cè)定時(shí)間的增加而降低， 于371，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4小時(shí)后取出細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔加入兩倍IC5(1值濃度的藥 物(L02除外，加入10ug/ml的藥物)1000 u L ；空白對(duì)照組加培養(yǎng)液1000 u L。每組濃度設(shè) 3個(gè)復(fù)孔。置37°C，5% C02及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)終止前4小時(shí)取出細(xì)胞培養(yǎng)板，先以倒置顯微鏡下觀察，后在每孔中加入MTT 工作液200 u L，終濃度5g/L。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1000 u 1DMS0,振蕩lOmin。待MTT還 原產(chǎn)物完全溶解，轉(zhuǎn)移至96孔板，在酶標(biāo)儀上選擇以492nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630nm為參考波長(zhǎng) 測(cè)定光密度值(0D值)。計(jì)算細(xì)胞的存活率，并以時(shí)間點(diǎn)和細(xì)胞的存活率作圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三 次。細(xì)胞存活率=[試驗(yàn)組0D平均值]/[空白對(duì)照組0D平均值]X 100%5.通過(guò)蘇木素伊紅(HE)染色觀察A375，L02, MKN45細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞給藥培養(yǎng)取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞懸液1500 y L、濃度隨測(cè)定時(shí)間的增加而降低， 于371，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4小時(shí)后取出細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔加入兩倍IC5(1值濃度的藥 物(L02除外，加入10ug/ml濃度的藥物)1500 u L ；空白對(duì)照組加培養(yǎng)液1500 u L。每組濃 度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置37°C，5% C02及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)36小時(shí)。固定液(4%多聚甲醛)的配置稱取40g多聚甲醛，置燒杯中，加入800ml 0. lmol/L磷酸緩沖液(PBS)，加熱至 60°C左右，磁力攪拌使粉末完全溶解，滴加少許lmol/L NaOH才能使溶液清亮，最后補(bǔ)足 0. lmol/L的PBS于1000ml，充分混勻，備用。樣品處理用4%多聚甲醛固定15min，接著用蒸餾水洗滌2min，再換用新鮮的蒸餾水，再洗 滌 2min。HE 染色對(duì)于上述處理好的樣品，蘇木素染色液8min，接著用自來(lái)水中沖洗去多余的染色 液lOmin，蒸餾水再洗滌5s，95%乙醇5秒，伊紅染色液A染色5min，接著伊紅染色液B再染 色5min。顯微鏡下觀察結(jié)果。三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(參見圖1至圖9)1.雄黃母液的濃度測(cè)定結(jié)果砷濃度177. 0ug/ml (以后IC5(1等所涉及的濃度未提及即為砷濃度)
6
2.測(cè)定雄黃藥品的半數(shù)抑制濃度(IC5(I)值L02, > 10ug/ml (約 50ug/ml 左右)；H印G2，6. 89ug/ml ；MKN45，9.37ug/ml ；8898，9. 06ug/ml ；A375,3.78ug/ml3.時(shí)效曲線測(cè)定結(jié)果結(jié)論對(duì)于五株給藥細(xì)胞，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用都呈時(shí)間依賴型，其中36h時(shí)藥 物對(duì)細(xì)胞的抑制作用較顯著。4.生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)論對(duì)于五株給藥細(xì)胞，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用基本呈時(shí)間依賴型。對(duì)于L02，藥物對(duì)細(xì)胞抑制作用的第四天產(chǎn)生反射性下調(diào)。對(duì)于H印G2，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用在3-5天無(wú)明顯差異。對(duì)于MKN45，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用在3-5天無(wú)明顯差異。對(duì)于8898，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用在3-4天無(wú)明顯差異。對(duì)于A375，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用呈顯著的時(shí)間依賴型。5.蘇木素伊紅(HE)染色結(jié)果5. 1A375 組A375正常組染色結(jié)果細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)界限分明，較正常；A375給藥組染色結(jié)果細(xì) 胞皺縮，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)界限不明顯，并且周圍伴有較多微粒，但是胞膜尚完整。5. 2L02 組L02正常組與給藥組染色結(jié)果細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)界限分明，較正常，顯示藥物對(duì)于 L02細(xì)胞損傷較不明顯。5. 3MKN45 組MKN45正常組染色結(jié)果細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)界限分明，較正常；MKN45給藥組染色結(jié)果 細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)界限不明顯，細(xì)胞皺縮但是胞膜較完整。四.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Instatversion 2. 04 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，*p < 0. 05，**p < 0. 01，***p < 0. 001。實(shí)施例2雄黃致腫瘤細(xì)胞凋亡的作用實(shí)驗(yàn)(二)實(shí)驗(yàn)方法1.流式細(xì)胞術(shù)2.測(cè)定細(xì)胞上清中LDH，AKP的含量3.測(cè)定細(xì)胞中總LDH，AKP的含量4.細(xì)胞凋亡DNA ladder檢測(cè)受試藥物雄黃受試細(xì)胞A375，MKN45,L02一、實(shí)驗(yàn)材料1主要儀器Bio-Rad公司酶標(biāo)儀(550型)；Heraeous公司二氧化碳培養(yǎng)箱；倒置光學(xué)顯微鏡； 無(wú)菌操作臺(tái)；96、24、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板；半自動(dòng)生化分析儀
2主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基；碘化丙錠(propidium iodide, PI)；乳酸脫氫酶試劑盒(北 京北化康泰臨床試劑有限公司)；GENMED乳酸脫氫酶(LDH)總活性比色法定量檢測(cè)試劑盒 (上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)；堿性磷酸酶(AKP)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研 究所第一分所)；凱基細(xì)胞凋亡DNA Ladder檢測(cè)試劑盒(凱基生物科技有限公司)。二、實(shí)驗(yàn)方法1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡1. 1 1X106個(gè)細(xì)胞用雄黃處理36h。1. 2消化、收集細(xì)胞(lOOOrpm，5min)，用PBS緩沖液洗細(xì)胞2次，離心收集 (lOOOrpm,5min)。1. 3加入預(yù)冷的70%乙醇lml，4°C固定細(xì)胞4 8h。1. 4離心(1500rpm，5min)，去固定液，用PBS緩沖液洗細(xì)胞1次，離心收集 (1500rpm,5min)。1. 5 加入 RNase 終濃度 10 ii g/ml，37°C，反應(yīng) 30min。1.6用終濃度為50iig/ml的碘化丙錠(propidium iodide, PI)染色，4°C避光 lOrnin。1. 7使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CELLQUEST軟件分析數(shù)據(jù)并作圖，亞二倍 體峰被定量，作為測(cè)定凋亡的標(biāo)準(zhǔn)。2.測(cè)定細(xì)胞上清中LDH，AKP的含量2. 1測(cè)定細(xì)胞上清中LDH的含量2. 1. 1將上述三株細(xì)胞培養(yǎng)于010cm平皿中，用雄黃處理36小時(shí)后，取上清。2. 1. 2將R I用10mLR II溶解，配成工作液，穩(wěn)定10分鐘后使用。2. 1. 3測(cè)定條件波長(zhǎng)340nm，光徑1. 0cm，反應(yīng)溫度37°C。2. 1. 4取2. 5mL工作液于干凈比色杯中，保溫37°C以空氣調(diào)儀器吸光度為零。2. 1. 5加0. 10mL樣本于此比色杯中，混勻，保溫30秒，開始讀數(shù)每30秒讀一次數(shù)， 直至2分鐘，計(jì)算每分鐘吸光度變化值A(chǔ)A。2. 1.6 計(jì)算消光系數(shù)NADH在340nm的毫摩爾消光系數(shù)為6. 3。2. 2測(cè)定細(xì)胞上清中AKP的含量2. 2.1操作步驟 充分混勻，37 °C水浴15分鐘 立即混勻，520nm，0. 5cm或1cm光徑比色，空白管調(diào)零，測(cè)各管吸光度。2. 2. 2計(jì)算公式
堿性磷酸酶(金氏單位/100ml)= 3.測(cè)定細(xì)胞中總LDH，AKP的含量3. 1將上述三株細(xì)胞培養(yǎng)于010cm平皿中，用雄黃處理36小時(shí)后，用1 %的 TrizonX-100 裂解細(xì)胞，4°C 30min。3. 2細(xì)胞中總LDH的含量3. 2. 1在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記背景對(duì)照和樣品。3. 2. 2分別移取195 u LGENMED緩沖液(Reagent A)到相應(yīng)孔中。3. 2. 3分別加入5uL GENMED陰性液(Reagent D)或待測(cè)樣品。3. 2. 4 分別加入 25 u L GENMED 反應(yīng)液(Reagent B)。3. 2. 5輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板。3. 2. 6 在 25°C溫度下孵育 5min。3. 2. 7 分別加入 25 u L GENMED 底色液(Reagent C)。3. 2. 8輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板。3. 2. 9即刻放入酶標(biāo)儀檢測(cè)，包括(Omin初始讀數(shù)和lmin讀數(shù))。3. 2. 10活性計(jì)算[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X0.25] +
3. 3細(xì)胞中總AKP的含量3. 3.1操作步驟 充分混勻，37 °C水浴15分鐘 立即混勻，520nm，0. 5cm或1cm光徑比色，空白管調(diào)零，測(cè)各管吸光度。3. 3. 2計(jì)算公式 4細(xì)胞凋亡DNA ladder檢測(cè)(凱基細(xì)胞凋亡DNA Ladder檢測(cè)試劑盒)4. 1離心收集細(xì)胞(1500Xg，5min)于1. 5ml微量離心管中。4. 2 用 PBS 洗滌細(xì)胞二次(1500Xg，5min)，棄上清。4. 3沉淀的細(xì)胞中加入100 u LLysis Buffer,渦旋振蕩器上劇烈混合10秒，離心 (1000Xg,5min)移上清于另一個(gè)微量離心管中。4. 4沉淀再加入100 ii L Lysis Buffer重復(fù)上步，合并兩次的上清液。4. 5在上述合并的上清液中加入20ii LSolutionA再加入20ii LEnzyme A55°C反應(yīng) 1小時(shí)。4. 6 加入 20u LEnzymeB37°C 1 小時(shí)。4. 7加入130 u LPrecipitant和950 u L冷乙醇混勻置_20°C 1小時(shí)以上或過(guò)夜。4. 8 4°C 12000-14000rpm 離心 15min_30min 小心棄去上清，收集沉淀的 DNA。4. 9 加入 0. 5 ii L70%7令乙醇，洗 DNA 沉淀，再 12000_14000rpm 離心 20min4. 10棄上清，DNA沉淀于室溫干燥lOmin后，加入10_15iiL TE Buffer，充分?jǐn)嚢?溶解DNA。4. 11取上述10-15 u L樣品加入2-3 u L Loading Buffer,瓊脂糖凝膠電泳(凝膠 和電泳緩沖液TBE均加入0. 5mL的溴化乙啶)。4. 12電泳1小時(shí)，紫外燈下觀察并拍照。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡結(jié)果(參見圖10，圖11)雄黃對(duì)于正常細(xì)胞沒(méi)有明顯的誘導(dǎo)凋亡的作用，而對(duì)于MKN-45和A375有不同程 度的誘導(dǎo)凋亡的作用。2.細(xì)胞上清中LDH，AKP的含量的測(cè)定結(jié)果(參見圖12，圖13)3.細(xì)胞中總LDH，AKP的含量測(cè)定結(jié)果(參見圖14，圖15)4.細(xì)胞凋亡DNA ladder檢測(cè)(參見圖16，圖17)。實(shí)施例3
測(cè)定雄黃致細(xì)胞中ROS，GSH水平的變化情況受試藥物雄黃受試細(xì)胞A375，HepG2,MKN45, L02實(shí)驗(yàn)材料熒光酶標(biāo)儀；Thermos公司二氧化碳培養(yǎng)箱；倒置光學(xué)顯微鏡；無(wú)菌操作臺(tái)；96、24、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板；半自動(dòng)生化分析儀CDCFH 探針(Sigma 公司)谷胱甘肽試劑盒(南京建成)實(shí)驗(yàn)方法1谷胱甘肽的測(cè)定1. 1上清液制備取待測(cè)樣本0. 5ml，加試劑一應(yīng)用液2ml混勻，3500 4000轉(zhuǎn)/ 分離心10分鐘，取上清液1ml進(jìn)行顯色反應(yīng)。1.2顯色反應(yīng) 混勻，靜置5分鐘，420nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零比色測(cè)定各管0D值。2細(xì)胞內(nèi)氧化活性水平原位的測(cè)定2. 1細(xì)胞用不同濃度的雄黃處理24小時(shí)；2. 2用PBS輕輕淋洗兩次；2. 3 加入含 10 ii M CDCFH,培養(yǎng) 3 小時(shí)；2.4輕輕吸棄上清，加入卩85;2. 5用熒光酶標(biāo)儀(ex :480nm, em :538nm)測(cè)定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì) 胞內(nèi)的氧自由基水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
谷胱甘肽(GSH)的測(cè)定結(jié)果和四株細(xì)胞的R0S(參見圖18，圖19)。實(shí)施例4平行實(shí)驗(yàn)1材料與方法1. 1 動(dòng)物C57BL/6小鼠，18只，雄性，SPF級(jí)，4 6周齡，體重16 18g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上 海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1. 2主要試劑和主要儀器設(shè)備生理鹽水，蒸餾水，雄黃，酒精，天平、眼科剪、眼科彎鑷、lml無(wú)菌注射器并帶6號(hào) 針頭若干支1. 3實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果方法由B16細(xì)胞接種產(chǎn)生的移植性黑色素瘤C57BL/6小鼠18只，隨機(jī)分3組，每組 6只，每鼠分別以0. lmL的純酒精(純酒組)，雄黃(雄黃組，雄黃lmg，用蒸餾水進(jìn)行20倍 左右的稀釋)，以及酒精與雄黃混懸液(雄酒組，雄黃lmg)，局部瘤內(nèi)注射，每周注射2次。 每10d觀察各組腫瘤大小，并于30d殺鼠剝離腫瘤稱重。結(jié)果雄黃組6鼠中有1鼠，于第3 次注射后20h死亡。雄酒組中有3鼠，于第2次注射后死亡。接種30d后，純酒組、雄黃組、 雄酒組的瘤重分別為(2. 08士 1.63)、(0.13士0. 10)、(2. 49士 1. 32) g，雄黃組與其它各組間 均有顯著差別(P < 0. 05)。結(jié)論很低劑量(lmg)雄黃溶液瘤內(nèi)注射治療移植性黑色素瘤小 鼠，可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，有臨床應(yīng)用的潛力。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
雄黃在制備治療皮膚腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，雄黃在制備治療黑色素瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及雄黃在制備治療皮膚腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用，所述的皮膚腫瘤疾病是黑色素瘤疾病。本發(fā)明對(duì)雄黃發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明的雄黃藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著很好的藥用前景。雄黃對(duì)于細(xì)胞的周期沒(méi)有明顯的影響，而是從細(xì)胞凋亡的方面，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而達(dá)到損傷黑色素瘤細(xì)胞的作用，從而治療黑色素瘤皮膚疾病。
文檔編號(hào)A61K33/36GK101884647SQ20091005137
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者劉建文, 吳國(guó)華, 章莉, 陳思宇, 陳明蒼, 馬勇 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院