藍(lán)萼乙素衍生物、制備方法及其用途的制作方法

專利名稱：藍(lán)萼乙素衍生物、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物，特別涉及含有多肽的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物。本發(fā)明還涉及所述含有多肽的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備方法及其在治療癌 癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香茶菜為唇形科香茶菜屬植物，廣泛分布于河南、湖北、四川、貴州、陜西、山西、河 北等省。全草具有抗菌、消炎等作用，民間用于治療急性黃疽型肝炎、急性膽囊炎、跌打損 傷、毒蛇咬傷、膿疙疹等。其藥理作用未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)鄂西香茶菜粗制劑進(jìn)行了藥理作用的研 究，結(jié)果表明其對(duì)體內(nèi)和體外的艾氏腹水癌腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用。唇形科香茶菜屬植物。在亞洲東部和非洲西部廣為分布，全世界約有150種，我國(guó) 約有90種25個(gè)變種。其中約有30種民間作為藥用，作為清熱解毒、抗癌消炎、健脾、活血、 杭菌藥來(lái)使用。人們對(duì)該屬植物的-菇類(lèi)成分作了研究，已從中提取了百余種藥類(lèi)成分。經(jīng) 藥理篩選發(fā)現(xiàn)許多二萜化合物具有細(xì)胞毒、抗腫瘤、杭炎活性作用。在研究中還發(fā)現(xiàn)該屬植 物除含二萜成分外，還富含三萜，脂肪酸以及少量的黃酮、倍半萜、鏈烴等。藍(lán)萼香茶菜是唇形科香茶菜屬植物，分布在我國(guó)的東北、華北，朝鮮.日本，原蘇 聯(lián)遠(yuǎn)東地區(qū)，吉林省資源尤其豐富。藍(lán)萼香茶菜具有健胃、清熱解毒、活血、抗菌消炎和抗癌 活性，用于胃炎、肝炎初起、感冒發(fā)熱、乳腺炎、關(guān)節(jié)痛等疾病?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)全草對(duì)心血管 有一定的作用，而其中的有效成分對(duì)血小板聚集及癌癥有一定的影響。從上世紀(jì)80年代至 今各國(guó)學(xué)者對(duì)其藥理及化學(xué)等各方面進(jìn)行了研究，以我國(guó)學(xué)者研究的較多。1981年許云龍等人從藍(lán)萼香茶菜中提取出藍(lán)萼甲素(glaucocalyxinA)和藍(lán)萼乙 素(glaucocalyxinB)，從光譜中推斷藍(lán)萼甲素具有香茶菜屬二萜典型的巧一氧_16 —貝殼 杉烯(ent-15-OXO-I6-kaurene)骨架，而藍(lán)萼乙素是藍(lán)萼甲素的14 一乙?；?，把兩者分 別乙酰化，得到相同的乙?；?，從而證實(shí)了兩者的相互關(guān)系。隨后趙全成也從吉林產(chǎn)藍(lán)萼 香茶菜中分得這兩種二萜。1988年劉晨江等從北京地區(qū)產(chǎn)藍(lán)萼香茶菜中分得甲素和乙素外，還分得藍(lán)萼丙素 (glaucocalyxinC)，結(jié)構(gòu)為對(duì)映 _7p，14a, 15a-三羥基-16-貝殼杉 酮。Dongsa kimls, 除了從中分出藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素和藍(lán)萼丙素，還分出了兩種新二萜glaucocalyxinD和 glaucocalyxinE并列出了這五種化合物的結(jié)構(gòu)紅外紫外吸收值、最主要的1H—核磁共振、 13C 一核磁共振化學(xué)位移值及質(zhì)譜數(shù)據(jù)值。金永日等從藍(lán)萼香茶菜根中分得了藍(lán)萼甲素，另外王先榮等從安徽產(chǎn)王棗子〔 Isodonamethystoides(Benth)CyffuetHsuan)中也分得藍(lán)萼甲素。王慧芬等人用反相高效 液相色譜法外標(biāo)法對(duì)不同部位及不同采集期的藍(lán)萼香茶菜中藍(lán)萼甲素的含量進(jìn)行了測(cè)定， 結(jié)果表明葉中藍(lán)萼甲素遠(yuǎn)高于根、莖。不同采集期以7-8月份含量高，9月末含量下降。張 元桐等也采用反相HPLC測(cè)定藍(lán)萼甲素含量，測(cè)得藍(lán)萼甲素含量為1.03%，平均回收率為 99.2%。趙全成從藍(lán)萼香茶菜中分得p—谷留醇和熊果酸。藍(lán)萼香茶菜用乙醇提取后經(jīng)硅膠柱層析和HPLC制備柱層析分離得到4個(gè)化合物齊墩果酸，阿江欖仁酸，毛花獼猴酸B和 熊果酸。代桂明玉等人從藍(lán)萼香茶菜中還分得蘆丁和和胡蘿卜甙。楊學(xué)儉等用日本島津AA-670型原子吸收分光光度計(jì)，以中科院環(huán)化所提供的桃 葉為標(biāo)準(zhǔn)參照物，對(duì)藍(lán)萼香茶菜的根、莖、葉分別進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)藍(lán)尊香茶菜的莖、葉中Fe， Cu, Mn, Se的含量都是較高的，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)證明，這些元素的存在對(duì)防治癌癥及其它 一些疾病是有作用的，提示藍(lán)萼香茶菜在此方面有一定作用。后有人用ICP-AES儀測(cè)定了 河北藍(lán)萼香茶菜不同部位多種元素的含量，發(fā)現(xiàn)其葉中5種宏量元素K，Na, P，Ca, Mg的含 量高于根和莖，8種微量元素Zn，F(xiàn)e, S，Ba, Li，Al，V，Ti的含量也是葉中偏高，首次發(fā)現(xiàn)香 茶菜葉中含有稀土元素Ce，Y，Yb，數(shù)據(jù)提示多年生草本植物藍(lán)萼香茶菜的最佳藥用部分可 能是葉。劉蘭娣等研究了藍(lán)萼香茶菜對(duì)大鼠全心缺血一再灌注時(shí)心肌C-F0S基因表達(dá)的 影響。采用dortl離體全心缺血一再灌注損傷模型，免疫組化法，用相應(yīng)C-fos抗體檢測(cè)心 肌細(xì)胞中C-fos基因表達(dá)情況，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析C-fos基因表達(dá)情況，藍(lán)萼香茶 菜生藥用乙醇回流3次提取，提取液回收乙醇，濃縮后加到0. 5%淀粉糊中，揮去乙醇，濃度 為lKg/L，分為高中低三種不同濃度的香茶菜對(duì)缺血一再灌注全心進(jìn)行預(yù)灌注，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其 能明顯減少凋亡相關(guān)基因C-fos基因的表達(dá)，表明心肌缺血一再灌注損傷輕，心肌受到一 定的保護(hù)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)高濃度藍(lán)萼香茶菜具有一定的心肌細(xì)胞毒性作用。其具有與劑量相關(guān) 的心肌保護(hù)作用，但并非濃度越大越有效。綜上所述，藍(lán)萼香茶菜在我國(guó)資源豐富?；瘜W(xué)研究表明其含有二萜和三萜成分，但 其中以二萜成分藍(lán)萼甲素、乙素、丁素為其主要的活性成分，具有抗血小板聚集的作用。因 其母核為對(duì)映貝殼杉烯型的，相似于冬凌草甲素(oridonin)，故可能具有一定的抗癌作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供能治療癌癥、特別是治療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、 黑色素瘤和骨髓性白血病的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物，該藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物特別對(duì)肺癌 具有靶向作用，從而提供一種即可以治療多種癌癥就可以針對(duì)性的治療肺癌的藥物。本發(fā)明的目的之二在于提供一種制備藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備方法，從而避 免單純的采用有機(jī)合成所帶來(lái)的毒副作用較大的缺陷，并且避免單純的采用原料提純多帶 來(lái)的藥效較低、無(wú)法針對(duì)性治療某一特定癌癥的缺陷。本發(fā)明所公開(kāi)的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物是一種二萜類(lèi)物質(zhì)，具有貝殼杉烷型結(jié) 構(gòu)、羰基、多肽cNGQGEQc和/或羥基，其分子結(jié)構(gòu)的通式如下
7 其中，隊(duì)為-cNGQGEQc、-0H或
，R2 為-cNGQGEQc 或 _0H。 其中，以下四種結(jié)構(gòu)對(duì)治療癌癥、特別是治療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素 瘤和骨髓性白血病具有良好的效果。其中通過(guò)乙酰化反應(yīng)引入多肽cNGQGEQc，來(lái)對(duì)主體二 萜進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而使得修飾后的藍(lán)萼乙素(GLB)，即藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物對(duì)肺癌具有 靶向作用。
所述覽萼乙素(GLB)(C22H30O5)的分子結(jié)構(gòu)如下

萼乙素(GLB)衍生物。所述的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備方法，具體包含以下步驟步驟1 粉碎取香茶菜藥材(地上部分)粉碎至20目 50目。步驟2 提取步驟2. 1 將步驟1所得的粉碎物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 6至1 10 混合，加熱，在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時(shí)，提取、過(guò)濾，得到提取液和剩余物。步驟2. 2 將步驟2. 1所得的剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 6至 1 10混合，加熱，在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時(shí)，提取、過(guò)濾，得到提取液和剩 余物，重復(fù)該步驟1 3次。步驟2. 3 合并步驟2. 1和2. 2所得的提取液。步驟3 溶劑處理步驟3. 1 將步驟2所得的提取液加熱，在55°C 65°C溫度條件下減壓濃縮，回收 乙醇并得到粘稠的初級(jí)濃縮物。步驟3.2 將步驟3. 1所得的初級(jí)濃縮物與水按照體積比1 8 1 10混合， 在室溫條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌10分鐘，隨后靜置6 12小時(shí)，棄去上清液 得到下層固體。步驟3. 3 將步驟3. 2所得的固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4 1 6 混合，在25°C 35°C溫度條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌溶解，靜置1 3小時(shí)，過(guò) 濾得到濾液和不溶物。步驟3. 4 將步驟3. 3所得的不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4 1 6 混合，在25°C 35°C溫度條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌溶解，靜置1 3小時(shí)，過(guò) 濾得到濾液和不溶物，重復(fù)該步驟1 3次。步驟3. 5 合并步驟3. 3和3. 4所得的濾液。步驟3. 6 將步驟3. 5所得的濾液加熱，在35°C 45°C溫度條件下減壓濃縮，回收 乙酸乙酯(A. R.)，得到固體濃縮物。步驟4:過(guò)柱步驟4. 1 將步驟3所得的固體濃縮物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 4 1 6混合溶解，得到溶液。步驟4. 2 將步驟4. 1所得的溶液緩慢加到樹(shù)脂柱中，觀察樹(shù)脂的顏色，在樹(shù)脂柱有2/3變色時(shí)，停止加樣，并采用200ml 400ml的95%乙醇(A. R.)沖洗該樹(shù)脂柱，收集所 有流出液，所述樹(shù)脂柱的填充物為強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂并用氫氧化鈉飽和至PH值中性。步驟4. 3 將步驟4. 2所得流出液加熱，并在55°C 65°C溫度條件下減壓回流，直 至溶劑干，得到固體殘留物。步驟5:重結(jié)晶步驟5. 1 將上述殘留物與30°C的 40°C的極性溶劑按照體積比1 4 1 6 混合，得到初級(jí)溶液，加熱，在30°C的 40°C溫度條件下減壓濃縮，在-5°C _8°C溫度條件 下靜置析晶，過(guò)濾得到黃色針狀結(jié)晶。所述極性溶劑為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的
混合溶液。步驟5. 2:將步驟5.1所得的結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4 1 6混合， 在-5°C _8°C溫度條件下反復(fù)重結(jié)晶2 4次，得到濃縮物。所述極性溶劑為按照體積比1 1 1 4混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的 混合溶液。步驟6:分離提純步驟6. 1 將步驟5所得的濃縮物加入20ml乙酸乙酯(A. R.)溶解，加入200-300 目硅膠，混合均勻，室溫?fù)]發(fā)干燥，除去溶劑乙酸乙酯(A. R.)。所述硅膠的加入量為所述濃縮物重量的3倍。步驟6. 2 濕法填裝一根層析硅膠柱，所述硅膠用量為步驟5所得的濃縮物重量的 20倍，柱子徑高比為1 12，并采用2BV氯仿(A.R.)反復(fù)沖洗硅膠柱。步驟6. 3 將步驟6. 1所得的混有硅膠的濃縮物加入到步驟6. 2所得的硅膠柱中， 采用2BV氯仿(A. R.)沖洗且流速為1. 5BV/小時(shí)。步驟6. 4 采用3BV氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液沖洗所述硅膠柱，并采 用TLC薄層分析方法檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)餾分藍(lán)萼乙素(GLB)，在檢驗(yàn)到相應(yīng)餾分的時(shí)候，收集含有藍(lán) 萼乙素(GLB)主成分的餾分。所述的3BV的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.)和丙酮 (A.R.)的體積比為20 1。步驟6. 5 將步驟6. 4所得的餾分合并，在30°C 40°C溫度條件下減壓濃縮，回收 溶劑，將所得的濃縮物用氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液重結(jié)晶，等白色針狀晶體藍(lán) 萼乙素(GLB)。所述氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為 8 1 12 1。所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的 體積比為1 1 1 4。步驟7 合成步驟7. 1 將步驟6所得的藍(lán)萼乙素(GLB)和多肽(cNGQGEQc)按照每8 17g藍(lán) 萼乙素(GLB)、0. 7 2. 3g多肽(cNGQGEQc)和80 150ml無(wú)水極性溶劑的比例混合得到 混合液，所述無(wú)水極性溶劑為甲醇(A. R.)、乙醇(A. R.)、二氯甲烷(A. R.)中的一種。步驟7. 2 將步驟7. 1所得的混合溶液加熱，在60°C 80°C溫度條件下攪拌冷凝
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回流6 10小時(shí)，趁熱抽濾，室溫下靜置，析出晶體，過(guò)濾，分離出晶體，得到藍(lán)萼乙素(GLB) 衍生物。步驟8 合成步驟8. 1 將步驟6所得的藍(lán)萼乙素(GLB)按照每8 17g藍(lán)萼乙素(GLB)，每 70 130ml乙醇溶液的比例混合，將藍(lán)萼乙素(GLB)溶解在乙醇溶液中，在室溫下向其中滴 加lmol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)PH= 13，持續(xù)攪拌5分鐘，再減壓濃縮，除去乙醇溶液，得 到濃縮物。步驟8. 2 將步驟8. 1所得的濃縮物加入乙酸乙酯，在室溫下進(jìn)行萃取，得到乙酸 乙酯萃取層，共萃取2次，得到萃取物。每次萃取中所述乙酸乙酯的使用量為步驟8. 1中氫氧化鈉溶液的使用量的2倍量 (體積比)。步驟8. 3 將步驟8. 2所得的萃取物與30 °C 40 °C的極性溶劑按照體積比 1 4 1 6混合，得到初級(jí)溶液。將得到的初級(jí)溶液加熱，在30°C 40°C溫度條件下減壓濃縮，在_5°C _8°C溫度 條件下靜置析晶，過(guò)濾得到結(jié)晶。所述極性溶劑混合為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿和丙酮的混合溶液。步驟8. 4 將步驟8. 3所得的結(jié)晶與極性溶劑混合，反復(fù)重結(jié)晶2 4次，得到晶 體。所述極性溶劑混合為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿和丙酮的混合溶液。步驟8. 5 將步驟8. 4所得的晶體按照每8 17g所得晶體、0. 7 2. 3g多肽 (cNGQGEQc)和80 150ml無(wú)水極性溶劑的比例混合，得到混合溶液。所述無(wú)水極性溶劑為甲醇、乙醇、二氯甲烷中的一種。步驟8. 6 將步驟8. 5所得混合溶液加熱，在60°C 80°C溫度條件下攪拌冷凝回 流6 10小時(shí)，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶，過(guò)濾，分離出晶體，得到藍(lán)萼乙素(GLB)衍生 物。經(jīng)高效液相色譜、LC_MS、NMR分析確認(rèn)所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍(lán)萼乙素 (GLB)衍生物。本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了所述含有多肽cNGQGEQc的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物在治療癌癥 中的應(yīng)用，特別是在治療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病中的應(yīng)用。 由于該藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物是以藍(lán)萼乙素(GLB)為基礎(chǔ)并采用多肽cNGQGEQc通過(guò)乙酰 化反應(yīng)對(duì)藍(lán)萼乙素(GLB)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾所得到，其對(duì)于肺癌具有良好的靶向作用。本發(fā)明所公開(kāi)的前述任一結(jié)構(gòu)的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物可以采用藥劑學(xué)上的常 規(guī)藥物載體制成任何一種劑型，包括但不限于片劑、膠囊劑、軟膠劑、噴霧劑、凝膠劑、凝膠 吸入劑、口服劑、混懸劑、沖劑、貼劑、軟膏、丸劑、散劑、注射劑、輸液劑、凍干注射劑、脂質(zhì)體 注射劑、靶向給藥注射劑、栓劑、緩釋制劑或控釋制劑。優(yōu)選為凍干注射劑。


圖1是本發(fā)明的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的分子結(jié)構(gòu)通式。圖2是本發(fā)明的藍(lán)萼乙素(GLB)的分子結(jié)構(gòu)式。
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圖3是本發(fā)明實(shí)施例八的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的分子結(jié)構(gòu)式。圖4是本發(fā)明的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物制備過(guò)程中的中間產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)式。圖5a 5c是本發(fā)明實(shí)施例九的三種藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的分子結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明的權(quán)利要求和發(fā)明內(nèi)容所公開(kāi)的內(nèi)容，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下所 述。實(shí)施例一藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備以下所制備過(guò)程中所采用的各化學(xué)試劑如無(wú)特別標(biāo)注，則為分析純。采用香茶菜藥材(地上部分)作為原料，提純藍(lán)萼乙素(GLB)，并采用多肽 cNGQGEQc修飾其結(jié)構(gòu)，制備藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備方法，具體包含以下步驟步驟1 粉碎取香茶菜藥材(地上部分)粉碎至20目 50目。步驟2 提取步驟2. 1 將步驟1所得的粉碎物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 6至1 10 混合，加熱，在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時(shí)，提取、過(guò)濾，得到提取液和剩余物。步驟2. 2 將步驟2. 1所得的剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 6至 1 10混合，加熱，在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時(shí)，提取、過(guò)濾，得到提取液和剩 余物，重復(fù)該步驟1 3次。步驟2. 3 合并步驟2. 1和2. 2所得的提取液。步驟3 溶劑處理步驟3. 1 將步驟2所得的提取液加熱，在55°C 65°C溫度條件下減壓濃縮，回收 乙醇并得到粘稠的初級(jí)濃縮物。步驟3.2 將步驟3. 1所得的初級(jí)濃縮物與水按照體積比1 8 1 10混合， 在室溫條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌10分鐘，隨后靜置6 12小時(shí)，棄去上清液 得到下層固體。步驟3. 3 將步驟3. 2所得的固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4 1 6 混合，在25°C 35°C溫度條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌溶解，靜置1 3小時(shí)，過(guò) 濾得到濾液和不溶物。步驟3. 4 將步驟3. 3所得的不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4 1 6 混合，在25°C 35°C溫度條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌溶解，靜置1 3小時(shí)，過(guò) 濾得到濾液和不溶物，重復(fù)該步驟1 3次。步驟3. 5 合并步驟3. 3和3. 4所得的濾液。步驟3. 6 將步驟3. 5所得的濾液加熱，在35°C 45°C溫度條件下減壓濃縮，回收 乙酸乙酯(A. R.)，得到固體濃縮物。步驟4:過(guò)柱步驟4. 1 將步驟3所得的固體濃縮物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 4 1 6混合溶解，得到溶液。步驟4. 2 將步驟4. 1所得的溶液緩慢加到樹(shù)脂柱中，觀察樹(shù)脂的顏色，在樹(shù)脂柱有2/3變色時(shí)，停止加樣，并采用200ml 400ml的95%乙醇(A. R.)沖洗該樹(shù)脂柱，收集所 有流出液，所述樹(shù)脂柱的填充物為強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂并用氫氧化鈉飽和至PH值中性。所述樹(shù)脂柱采用7號(hào)樹(shù)脂柱，柱徑比1 12。步驟4. 3 將步驟4. 2所得流出液加熱，并在55°C 65°C溫度條件下減壓回流，直 至溶劑干，得到固體殘留物。步驟5:重結(jié)晶步驟5. 1 將上述殘留物與30°C的 40°C的極性溶劑按照體積比1 4 1 6 混合，得到初級(jí)溶液，加熱，在30°C的 40°C溫度條件下減壓濃縮，在-5°C _8°C溫度條件 下靜置析晶，過(guò)濾得到黃色針狀結(jié)晶。所述極性溶劑為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的
混合溶液。步驟5. 2:將步驟5.1所得的結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4 1 6混合， 在-5°C _8°C溫度條件下反復(fù)重結(jié)晶2 4次，得到藍(lán)萼乙素(GLB)。所述極性溶劑為按照體積比1 1 1 4混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的 混合溶液。步驟6:分離提純步驟6. 1 將步驟5所得的濃縮物加入20ml乙酸乙酯(A. R.)溶解，加入200-300 目硅膠，混合均勻，室溫?fù)]發(fā)干燥，除去溶劑乙酸乙酯(A. R.)。所述硅膠的加入量為所述濃縮物重量的3倍。步驟6. 2 濕法填裝一根層析硅膠柱，所述硅膠用量為步驟5所得的濃縮物重量的 20倍，柱子徑高比為1 12，并采用2BV氯仿(A.R.)反復(fù)沖洗硅膠柱。步驟6. 3 將步驟6. 1所得的混有硅膠的濃縮物加入到步驟6. 2所得的硅膠柱中， 采用2BV氯仿(A. R.)沖洗且流速為1. 5BV/小時(shí)。步驟6. 4 采用3BV氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液沖洗所述硅膠柱，并采 用TLC薄層分析方法檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)餾分藍(lán)萼乙素(GLB)，在檢驗(yàn)到相應(yīng)餾分的時(shí)候，收集含有藍(lán) 萼乙素(GLB)主成分的餾分。所述的3BV的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.)和丙酮 (A.R.)的體積比為20 1。步驟6. 5 將步驟6. 4所得的餾分合并，在30°C 40°C溫度條件下減壓濃縮，回收 溶劑，將所得的濃縮物用氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液重結(jié)晶，等白色針狀晶體藍(lán) 萼乙素(GLB)。所述氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為 8 1 12 1。所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的 體積比為1 1 1 4。步驟7:合成步驟7. 1 將步驟6所得的藍(lán)萼乙素(GLB)和多肽(cNGQGEQc)按照每8 17g藍(lán) 萼乙素(GLB)、0. 7 2. 3g多肽(cNGQGEQc)和80 150ml無(wú)水極性溶劑的比例混合得到 混合液，所述無(wú)水極性溶劑為甲醇(A. R.)、乙醇(A. R.)、二氯甲烷(A. R.)中的一種。
步驟7. 2 將步驟7. 1所得的混合溶液加熱，在60°C 80°C溫度條件下攪拌冷凝 回流6 10小時(shí)，趁熱抽濾，室溫下靜置，析出晶體，過(guò)濾，分離出晶體，得到藍(lán)萼乙素(GLB) 衍生物。步驟8:合成步驟8. 1 將步驟6所得的藍(lán)萼乙素(GLB)按照每8 17g藍(lán)萼乙素(GLB)，每70 130ml乙醇(A.R.)溶液的比例混合，將藍(lán)萼乙素(GLB)溶解在乙醇(A. R.)溶液中，在室溫 下向其中滴加lmol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)PH = 13，持續(xù)攪拌5分鐘，再減壓濃縮，除去乙 醇(A.R.)溶液，得到濃縮物。步驟8. 2 將步驟8. 1所得的濃縮物加入乙酸乙酯(A. R.)，在室溫下進(jìn)行萃取，得 到乙酸乙酯萃取層，共萃取2次，得到萃取物。每次萃取中所述乙酸乙酯(A. R.)的使用量為步驟8. 1中氫氧化鈉溶液的使用量 的2倍量(體積比)。步驟8. 3 將步驟8. 2所得的萃取物與30 °C 40 °C的極性溶劑按照體積比 1 4 1 6混合，得到初級(jí)溶液。將得到的初級(jí)溶液加熱，在30°C 40°C溫度條件下減壓濃縮，在_5°C _8°C溫度 條件下靜置析晶，過(guò)濾得到結(jié)晶。所述極性溶劑混合為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.) 的混合溶液。步驟8. 4 將步驟8. 3所得的結(jié)晶與極性溶劑混合，反復(fù)重結(jié)晶2 4次，得到晶 體。所述極性溶劑混合為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.) 的混合溶液。步驟8. 5 將步驟8. 4所得的晶體按照每8 17g所得晶體、0. 7 2. 3g多肽 (cNGQGEQc)和80 150ml無(wú)水極性溶劑的比例混合，得到混合溶液。所述無(wú)水極性溶劑為甲醇、乙醇、二氯甲烷中的一種。步驟8. 6 將步驟8. 5所得混合溶液加熱，在60°C 80°C溫度條件下攪拌冷凝回 流6 10小時(shí)，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶，過(guò)濾，分離出晶體，得到藍(lán)萼乙素(GLB)衍生 物。經(jīng)高效液相色譜、LC_MS、NMR分析確認(rèn)所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍(lán)萼乙素 (GLB)衍生物。實(shí)施例二藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備采用以下技術(shù)參數(shù)改進(jìn)實(shí)施例一的制備方法所述步驟2. 1中，是將所述粉碎物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 6.5混合， 加熱，在82°C溫度條件下回流1. 8小時(shí)，再提取過(guò)濾。所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 9.5混合， 加熱，在88°C溫度條件下回流1. 2小時(shí)，再提取過(guò)濾，重復(fù)該步驟1次。所述步驟3. 1中，是將所述提取液加熱，在57°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟3. 2中，是將所述初級(jí)濃縮物與水按照體積比1 8. 5混合，在室溫條件 下攪拌并隨后靜置11小時(shí)才分離上清液和固體。
所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5. 5混合，在 27°C溫度條件下攪拌溶解，靜置1. 5小時(shí)再過(guò)濾。所述步驟3. 4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4. 5混合， 在33°C溫度條件下攪拌溶解，靜置2. 5小時(shí)再過(guò)濾，重復(fù)該步驟3次。所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在37°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟4. 1中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 4. 5混
合溶解。所述步驟4. 2中，采用的樹(shù)脂柱為填充物為強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂、并用氫氧化鈉飽 和至pH值中性的樹(shù)脂柱。所述步驟4. 2中，當(dāng)所述樹(shù)脂柱有2/3變色時(shí)，停止加樣，并采用240ml的95%乙 醇(A. R.)沖洗所述樹(shù)脂柱。所述步驟4. 3中，是將所述流出液加熱，并在57°C溫度條件下減壓回流。所述步驟5.1和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1.2混合的氯仿 (A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟5. 1中，是將所述殘留物與31 °C的極性溶劑按照體積比1 5.5混合。所述步驟5. 1中，是將所述初級(jí)溶液加熱，在31°C溫度條件下減壓濃縮，在_7°C溫 度條件下靜置析晶。所述步驟5. 2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4.5混合，在_61溫度 條件下反復(fù)重結(jié)晶4次。所述步驟6. 5中，是在32°C溫度條件下減壓濃縮，減壓濃縮過(guò)程中所述氯仿 (A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為11.5 1。所述步驟6. 5中，所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.) 和丙酮(A.R.)的體積比為1 2。所述步驟7. 1中，是按照每10g藍(lán)萼乙素(GLB)、0. 9g多肽(cNGQGEQc)和90ml無(wú) 水極性溶劑的比例混合。所述步驟7. 1中，所述無(wú)水極性溶劑為甲醇(A. R.)。所述步驟7. 2中，是將所述混合溶液加熱，在64°C溫度條件下攪拌冷凝回流9. 5小 時(shí)，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶。所述步驟8. 1中，是將步驟6所得的藍(lán)萼乙素(GLB)按照每10g藍(lán)萼乙素(GLB)， 每80ml乙醇(A. R.)溶液的比例混合。所述步驟8. 3中，是將步驟8. 2所得的萃取物與32°C的極性溶劑按照體積比 1 4. 5混合，得到初級(jí)溶液。將得到的初級(jí)溶液加熱，在32°C溫度條件下減壓濃縮，在-5. 5°C溫度條件下靜置 析晶，過(guò)濾得到結(jié)晶。所述極性溶劑混合為按照體積比1 1. 2混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混
合溶液。所述步驟8. 4中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1. 2混合的氯仿(A. R.)和 丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟8. 5中，是將步驟8. 4所得的晶體按照每10g所得晶體、0. 9g多肽(cNGQGEQc)和90ml無(wú)水極性溶劑的比例混合。所述步驟8. 6中，是將步驟8. 5所得混合溶液加熱，在64°C溫度條件下攪拌冷凝回 流9. 5小時(shí)。經(jīng)高效液相色譜、LC_MS、NMR分析確認(rèn)所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍(lán)萼乙素 (GLB)衍生物。實(shí)施例三藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備采用以下技術(shù)參數(shù)改進(jìn)實(shí)施例一的制備方法所述步驟2. 1中，是將所述粉碎物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 7.5混合， 加熱，在84°C溫度條件下回流1. 6小時(shí)，再提取過(guò)濾。所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 8.5混合， 加熱，在86°C溫度條件下回流1. 4小時(shí)，再提取過(guò)濾，重復(fù)該步驟1次。所述步驟3. 1中，是將所述提取液加熱，在59°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟3. 2中，是將所述初級(jí)濃縮物與水按照體積比1 8. 5混合，在室溫條件 下攪拌并隨后靜置10小時(shí)才分離上清液和固體。所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5. 5混合，在 29°C溫度條件下攪拌溶解，靜置1. 5小時(shí)再過(guò)濾。所述步驟3. 4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4. 5混合， 在31°c溫度條件下攪拌溶解，靜置2. 5小時(shí)再過(guò)濾，重復(fù)該步驟3次。所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在39°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟4. 1中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 4. 5混
合溶解。所述步驟4. 2中，采用的樹(shù)脂柱為填充物為強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂、并用氫氧化鈉飽 和至pH值中性的樹(shù)脂柱。所述步驟4. 2中，當(dāng)所述樹(shù)脂柱有2/3變色時(shí)，停止加樣，并采用280ml的95%乙 醇(A. R.)沖洗所述樹(shù)脂柱。所述步驟4. 3中，是將所述流出液加熱，并在59°C溫度條件下減壓回流。所述步驟5.1和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1.4混合的氯仿 (A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟5. 1中，是將所述殘留物與33°C的極性溶劑按照體積比1 5. 5混合。所述步驟5. 1中，是將所述初級(jí)溶液加熱，在33°C溫度條件下減壓濃縮，在_7°C溫 度條件下靜置析晶。所述步驟5. 2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4.5混合，在_71溫度 條件下反復(fù)重結(jié)晶4次。所述步驟6. 5中，是在34°C溫度條件下減壓濃縮，減壓濃縮過(guò)程中所述氯仿 (A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為10.5 1。所述步驟6. 5中，所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.) 和丙酮(A.R.)的體積比為1 2。所述步驟7. 1中，是按照每12g藍(lán)萼乙素(GLB)、1. 3g多肽(cNGQGEQc)和105ml 無(wú)水極性溶劑的比例混合。
所述步驟7. 1中，所述無(wú)水極性溶劑為乙醇(A. R.)。所述步驟7. 2中，是將所述混合溶液加熱，在68°C溫度條件下攪拌冷凝回流8. 5小 時(shí)，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶。所述步驟8. 1中，是將步驟6所得的藍(lán)萼乙素(GLB)按照每12g藍(lán)萼乙素(GLB)， 每90ml乙醇(A. R.)溶液的比例混合。所述步驟8. 3中，是將步驟8. 2所得的萃取物與34°C的極性溶劑按照體積比 1 5. 5混合，得到初級(jí)溶液。將得到的初級(jí)溶液加熱，在34°C溫度條件下減壓濃縮，在_6°C溫度條件下靜置析 晶，過(guò)濾得到結(jié)晶。所述極性溶劑混合為按照體積比1 1. 4混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混
合溶液。所述步驟8. 4中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1.4混合的氯仿(A.R.)和 丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟8. 5中，是將步驟8. 4所得的晶體按照每12g所得晶體、1. 3g多肽 (cNGQGEQc)和105ml無(wú)水極性溶劑的比例混合。所述步驟8. 6中，是將步驟8. 5所得混合溶液加熱，在68°C溫度條件下攪拌冷凝回 流8. 5小時(shí)。經(jīng)高效液相色譜、LC_MS、NMR分析確認(rèn)所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍(lán)萼乙素 (GLB)衍生物。實(shí)施例四藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備采用以下技術(shù)參數(shù)改進(jìn)實(shí)施例一的制備方法所述步驟2. 1中，是將所述粉碎物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 8.5混合， 加熱，在86°C溫度條件下回流1. 4小時(shí)，再提取過(guò)濾。所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 7.5混合， 加熱，在84°C溫度條件下回流1. 6小時(shí)，再提取過(guò)濾，重復(fù)該步驟3次。所述步驟3.1中，是將所述提取液加熱，在ere溫度條件下減壓濃縮。所述步驟3. 2中，是將所述初級(jí)濃縮物與水按照體積比1 9. 5混合，在室溫條件 下攪拌并隨后靜置8小時(shí)才分離上清液和固體。所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4. 5混合，在 31°C溫度條件下攪拌溶解，靜置2. 5小時(shí)再過(guò)濾。所述步驟3. 4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5. 5混合， 在29°C溫度條件下攪拌溶解，靜置1. 5小時(shí)再過(guò)濾，重復(fù)該步驟1次。所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在41°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟4. 1中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 5. 5混
合溶解。所述步驟4. 2中，采用的樹(shù)脂柱為填充物為強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂、并用氫氧化鈉飽 和至pH值中性的樹(shù)脂柱。所述步驟4. 2中，當(dāng)所述樹(shù)脂柱有2/3變色時(shí)，停止加樣，并采用320ml的95%乙 醇(A. R.)沖洗所述樹(shù)脂柱。
所述步驟4.3中，是將所述流出液加熱，并在61°C溫度條件下減壓回流。所述步驟5. 1和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1. 6混合的氯仿 (A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟5. 1中，是將所述殘留物與37°C的極性溶劑按照體積比1 4. 5混合。所述步驟5. 1中，是將所述初級(jí)溶液加熱，在37°C溫度條件下減壓濃縮，在-6°C溫 度條件下靜置析晶。所述步驟5. 2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 5.5混合，在_61溫度 條件下反復(fù)重結(jié)晶2次。所述步驟6. 5中，是在36 °C溫度條件下減壓濃縮，減壓濃縮過(guò)程中所述氯仿 (八.見(jiàn))和丙酮(11 .)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為9.5 1。所述步驟6. 5中，所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.) 和丙酮(A.R.)的體積比為1 3。所述步驟7. 1中，是按照每14g藍(lán)萼乙素(GLB)、1. 7g多肽(cNGQGEQc)和125ml 無(wú)水極性溶劑的比例混合。 所述步驟7. 1中，所述無(wú)水極性溶劑為乙醇(A. R.)。所述步驟7. 2中，是將所述混合溶液加熱，在72°C溫度條件下攪拌冷凝回流7. 5小 時(shí)，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶。所述步驟8. 1中，是將步驟6所得的藍(lán)萼乙素(GLB)按照每14g藍(lán)萼乙素(GLB)， 每110ml乙醇(A. R.)溶液的比例混合。所述步驟8. 3中，是將步驟8. 2所得的萃取物與36°C的極性溶劑按照體積比 1 4. 5混合，得到初級(jí)溶液。將得到的初級(jí)溶液加熱，在36°C溫度條件下減壓濃縮，在_7°C溫度條件下靜置析 晶，過(guò)濾得到結(jié)晶。所述極性溶劑混合為按照體積比1 1. 6混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混
合溶液。所述步驟8. 4中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1. 6混合的氯仿(A. R.)和 丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟8. 5中，是將步驟8. 4所得的晶體按照每14g所得晶體、1.7g多肽 (cNGQGEQc)和125ml無(wú)水極性溶劑的比例混合。所述步驟8. 6中，是將步驟8. 5所得混合溶液加熱，在72°C溫度條件下攪拌冷凝回 流7. 5小時(shí)。經(jīng)高效液相色譜、LC_MS、NMR分析確認(rèn)所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍(lán)萼乙素 (GLB)衍生物。實(shí)施例五藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備采用以下技術(shù)參數(shù)改進(jìn)實(shí)施例一的制備方法所述步驟2. 1中，是將所述粉碎物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 9.5混合， 加熱，在88°C溫度條件下回流1. 2小時(shí)，再提取過(guò)濾。所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 6.5混合， 加熱，在82°C溫度條件下回流1. 8小時(shí)，再提取過(guò)濾，重復(fù)該步驟3次。
所述步驟3. 1中，是將所述提取液加熱，在63°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟3. 2中，是將所述初級(jí)濃縮物與水按照體積比1 9. 5混合，在室溫條件 下攪拌并隨后靜置7小時(shí)才分離上清液和固體。所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4. 5混合，在 33°C溫度條件下攪拌溶解，靜置2. 5小時(shí)再過(guò)濾。所述步驟3. 4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5. 5混合， 在27°C溫度條件下攪拌溶解，靜置1. 5小時(shí)再過(guò)濾，重復(fù)該步驟1次。所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在43°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟4. 1中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 5. 5混
合溶解。所述步驟4. 2中，采用的樹(shù)脂柱為填充物為強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂、并用氫氧化鈉飽 和至pH值中性的樹(shù)脂柱。所述步驟4. 2中，當(dāng)所述樹(shù)脂柱有2/3變色時(shí)，停止加樣，并采用360ml的95%乙 醇(A. R.)沖洗所述樹(shù)脂柱。所述步驟4.3中，是將所述流出液加熱，并在63°C溫度條件下減壓回流。所述步驟5.1和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1.8混合的氯仿 (A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟5. 1中，是將所述殘留物與39°C的極性溶劑按照體積比1 4. 5混合。所述步驟5. 1中，是將所述初級(jí)溶液加熱，在39°C溫度條件下減壓濃縮，在-6°C溫 度條件下靜置析晶。所述步驟5. 2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 5.5混合，在_71溫度 條件下反復(fù)重結(jié)晶2次。所述步驟6. 5中，是在38°C溫度條件下減壓濃縮，減壓濃縮過(guò)程中所述氯仿 (A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為8. 5 1。所述步驟6. 5中，所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.) 和丙酮(A.R.)的體積比為1 3。所述步驟7. 1中，是按照每16g藍(lán)萼乙素(GLB)、2. lg多肽(cNGQGEQc)和140ml 無(wú)水極性溶劑的比例混合。 所述步驟7. 1中，所述無(wú)水極性溶劑為甲醇(A. R.)。所述步驟7. 2中，是將所述混合溶液加熱，在76°C溫度條件下攪拌冷凝回流6. 5小 時(shí)，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶。所述步驟8. 1中，是將步驟6所得的藍(lán)萼乙素(GLB)按照每16g藍(lán)萼乙素(GLB)， 每120ml乙醇(A. R.)溶液的比例混合。所述步驟8. 3中，是將步驟8. 2所得的萃取物與38°C的極性溶劑按照體積比 1 5. 5混合，得到初級(jí)溶液。將得到的初級(jí)溶液加熱，在38°C溫度條件下減壓濃縮，在-7. 5°C溫度條件下靜置 析晶，過(guò)濾得到結(jié)晶。所述極性溶劑混合為按照體積比1 1. 8混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混
合溶液。
19
所述步驟8. 4中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1.8混合的氯仿(A. R.)和 丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟8. 5中，是將步驟8. 4所得的晶體按照每16g所得晶體、2. lg多肽 (cNGQGEQc)和140ml無(wú)水極性溶劑的比例混合。所述步驟8. 6中，是將步驟8. 5所得混合溶液加熱，在76°C溫度條件下攪拌冷凝回 流6. 5小時(shí)。經(jīng)高效液相色譜、LC_MS、NMR分析確認(rèn)所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍(lán)萼乙素 (GLB)衍生物。實(shí)施例六藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備(優(yōu)選實(shí)施例)采用以下技術(shù)參數(shù)改進(jìn)實(shí)施例一的制備方法所述步驟2. 1中，是將所述粉碎物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 8混合，加 熱，在85°C溫度條件下回流1. 5小時(shí)，再提取過(guò)濾。所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 8混合，加 熱，在85°C溫度條件下回流1. 5小時(shí)，再提取過(guò)濾，重復(fù)該步驟2次。所述步驟3. 1中，是將所述提取液加熱，在60°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟3. 2中，是將所述初級(jí)濃縮物與水按照體積比1 9混合，在室溫條件下 攪拌并隨后靜置9小時(shí)才分離上清液和固體。所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5混合，在30°C 溫度條件下攪拌溶解，靜置2小時(shí)再過(guò)濾。所述步驟3. 4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5混合，在 30°C溫度條件下攪拌溶解，靜置2小時(shí)再過(guò)濾，重復(fù)該步驟2次。所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在40°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟4. 1中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 5混合溶解。所述步驟4. 2中，采用的樹(shù)脂柱為填充物為強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂、并用氫氧化鈉飽 和至pH值中性的樹(shù)脂柱。所述步驟4. 2中，當(dāng)所述樹(shù)脂柱有2/3變色時(shí)，停止加樣，并采用300ml的95%乙 醇(A. R.)沖洗所述樹(shù)脂柱。所述步驟4.3中，是將所述流出液加熱，并在60°C溫度條件下減壓回流。所述步驟5. 1和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1. 5混合的氯仿 (A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟5.1中，是將所述殘留物與35°C的極性溶劑按照體積比1 5混合。所述步驟5. 1中，是將所述初級(jí)溶液加熱，在35°C溫度條件下減壓濃縮，在-6. 5°C 溫度條件下靜置析晶。所述步驟5. 2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 5混合，在_6.5°C溫度 條件下反復(fù)重結(jié)晶3次。所述步驟6. 5中，是在35°C溫度條件下減壓濃縮，減壓濃縮過(guò)程中所述氯仿 (A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為10 1。所述步驟6. 5中，所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.)和丙酮(A.R.)的體積比為1 2.5。所述步驟7. 1中，是按照每13g藍(lán)萼乙素(GLB)、1. 5g多肽(cNGQGEQc)和115ml 無(wú)水極性溶劑的比例混合。所述步驟7. 1中，所述無(wú)水極性溶劑為二氯甲烷(A. R.)。所述步驟7. 2中，是將所述混合溶液加熱，在70°C溫度條件下攪拌冷凝回流8小 時(shí)，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶。經(jīng)高效液相色譜、LC_MS、NMR分析確認(rèn)所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍(lán)萼乙素 (GLB)衍生物。實(shí)施例七藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備(優(yōu)選實(shí)施例)采用以下技術(shù)參數(shù)改進(jìn)實(shí)施例一的制備方法所述步驟2. 1中，是將所述粉碎物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 8混合，加 熱，在85°C溫度條件下回流1. 5小時(shí)，再提取過(guò)濾。所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95 %乙醇(A. R.)按照體積比1 8混合，加 熱，在85°C溫度條件下回流1. 5小時(shí)，再提取過(guò)濾，重復(fù)該步驟2次。所述步驟3. 1中，是將所述提取液加熱，在60°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟3. 2中，是將所述初級(jí)濃縮物與水按照體積比1 9混合，在室溫條件下 攪拌并隨后靜置9小時(shí)才分離上清液和固體。所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5混合，在30°C 溫度條件下攪拌溶解，靜置2小時(shí)再過(guò)濾。所述步驟3. 4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 5混合，在 30°C溫度條件下攪拌溶解，靜置2小時(shí)再過(guò)濾，重復(fù)該步驟2次。所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在40°C溫度條件下減壓濃縮。所述步驟4. 1中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 5混合溶解。所述步驟4. 2中，采用的樹(shù)脂柱為填充物為強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂、并用氫氧化鈉飽 和至pH值中性的樹(shù)脂柱。所述步驟4. 2中，當(dāng)所述樹(shù)脂柱有2/3變色時(shí)，停止加樣，并采用300ml的95%乙 醇(A. R.)沖洗所述樹(shù)脂柱。所述步驟4.3中，是將所述流出液加熱，并在60°C溫度條件下減壓回流。所述步驟5.1和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1.5混合的氯仿 (A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟5.1中，是將所述殘留物與35°C的極性溶劑按照體積比1 5混合。所述步驟5. 1中，是將所述初級(jí)溶液加熱，在35°C溫度條件下減壓濃縮，在-6. 5°C 溫度條件下靜置析晶。所述步驟5. 2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 5混合，在_6.5°C溫度 條件下反復(fù)重結(jié)晶3次。所述步驟6. 5中，是在35°C溫度條件下減壓濃縮，減壓濃縮過(guò)程中所述氯仿 (A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為10 1。所述步驟6. 5中，所述的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合溶液中，氯仿(A. R.)
21和丙酮(A.R.)的體積比為1 2.5。所述步驟8. 1中，是將步驟6所得的藍(lán)萼乙素(GLB)按照每13g藍(lán)萼乙素(GLB)， 每100ml乙醇(A. R.)溶液的比例混合。所述步驟8.3中，是將步驟8.2所得的萃取物與35°C的極性溶劑按照體積比1 5 混合，得到初級(jí)溶液。將得到的初級(jí)溶液加熱，在35°C溫度條件下減壓濃縮，在-6. 5°C溫度條件下靜置 析晶，過(guò)濾得到結(jié)晶。所述極性溶劑混合為按照體積比1 1. 5混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混
合溶液。所述步驟8. 4中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1. 5混合的氯仿(A. R.)和 丙酮(A. R.)的混合溶液。所述步驟8. 5中，是將步驟8. 4所得的晶體按照每13g所得晶體、1. 5g多肽 (cNGQGEQc)和115ml無(wú)水極性溶劑的比例混合。所述步驟8. 6中，是將步驟8. 5所得混合溶液加熱，在70°C溫度條件下攪拌冷凝回 流8小時(shí)。經(jīng)高效液相色譜、LC_MS、NMR分析確認(rèn)所得晶體為含有多肽cNGQGEQc的藍(lán)萼乙素 (GLB)衍生物。實(shí)施例八采用優(yōu)選實(shí)施例六的制備方法制備的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物，其分子結(jié)構(gòu)式如 下 其中，所述的-cNGQGEQc是通過(guò)原藍(lán)萼乙素(GLB)上的羥基與多肽cNGQGEQc的乙 酰化反應(yīng)從而引入的。該結(jié)構(gòu)的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物對(duì)治療癌癥、特別是治療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋 巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病具有良好的效果。其中通過(guò)乙?；磻?yīng)引入多肽cNGQGEQc， 來(lái)對(duì)主體二萜進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而使得修飾后的藍(lán)萼乙素(GLB)，即藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物 對(duì)肺癌具有靶向作用。實(shí)施例九采用優(yōu)選實(shí)施例七的制備方法制備的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物，其分子結(jié)構(gòu)通式如
酰化反應(yīng)從而引入的。其中，以下三種結(jié)構(gòu)對(duì)治療癌癥、特別是治療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素 瘤和骨髓性白血病具有良好的效果。其中通過(guò)乙酰化反應(yīng)引入多肽cNGQGEQc，來(lái)對(duì)主體二 萜進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而使得修飾后的藍(lán)萼乙素(GLB)，即藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物對(duì)肺癌具有 靶向作用。 采用藥劑學(xué)上的常規(guī)藥物載體，并采用藥劑學(xué)上的常規(guī)制備方法，將采用優(yōu)選實(shí) 施例六和/或優(yōu)選實(shí)施例七的制備方法制備的、具有實(shí)施例八和/或?qū)嵤├诺姆肿咏Y(jié)構(gòu) 的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物中的一種或多種，制備成藥劑學(xué)上的常規(guī)劑型，包括但不限于片 齊U、膠囊劑、軟膠劑、噴霧劑、凝膠劑、凝膠吸入劑、口服劑、混懸劑、沖劑、貼劑、軟膏、丸齊U、 散劑、注射劑、輸液劑、凍干注射劑、脂質(zhì)體注射劑、靶向給藥注射劑、栓劑、緩釋制劑或控釋 制劑。其中優(yōu)選制備劑型為凍干注射劑。實(shí)施例十一藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的應(yīng)用根據(jù)實(shí)施例一至六中任意制備方法制備所得的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物，用于癌癥 的治療，特別是用于治療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病。其中由于 所得的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物，是通過(guò)乙酰化反應(yīng)引入多肽cNGQGEQc，來(lái)對(duì)主體二萜進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的，從而使得修飾后的藍(lán)萼乙素(GLB)，即藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物對(duì)肺癌具有靶向 作用，尤其適用是肺癌的治療。實(shí)施例十二藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物治療肺癌的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)采用根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例六的制備方法制備的、具有實(shí)施例七的分子結(jié)構(gòu)的藍(lán)萼乙素 (GLB)衍生物的混合物(以下簡(jiǎn)稱GH-02)進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，考察GH-02對(duì)肺癌A549細(xì)胞的影響。1.實(shí)驗(yàn)材料1. 1藥品與試劑四氮唑蘭(MTT)1. 2儀器二氧化碳孵化箱，顯微鏡，酶標(biāo)儀1.3 動(dòng)物無(wú)1. 4瘤株肺癌A549細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所羅建民老師惠贈(zèng)2.實(shí)驗(yàn)方法2. 1A549 細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37°C、5% C02孵化箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2. 2細(xì)胞傳代取出已長(zhǎng)滿細(xì)胞的25cm2培養(yǎng)瓶，倒去培養(yǎng)液，先注入胰蛋白酶消化液1ml，輕輕搖 晃后棄去。再加入胰蛋白酶消化液2ml，將其浸潤(rùn)細(xì)胞后，放入C02孵化箱中消化2-3min。 注入5ml培養(yǎng)液，用滴管吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶基面。取2只無(wú)菌的培養(yǎng) 瓶，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)液均勻份入培養(yǎng)瓶中，分別加入10ml新鮮培養(yǎng)液后培養(yǎng)。2. 3細(xì)胞凍存先制成含細(xì)胞50萬(wàn)/ml的細(xì)胞懸液，后加10 % DMS0,裝入凍存管中火封，放置 于-20°C冰箱內(nèi)3h后取出，置于-60°C冰箱內(nèi)過(guò)夜，取出后裝入固定架后投入液氮中保存。2. 4細(xì)胞復(fù)蘇取出凍存管后，迅速投入37°C的溫水化凍，吸出細(xì)胞液，離心1000rpm，10min，棄 上清液，除去DMS0，換入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液，稀釋細(xì)胞數(shù)為20-50萬(wàn)/ml分種于培養(yǎng) 瓶中，置于C02孵化箱中培養(yǎng)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1GH-02 對(duì) A549 細(xì)胞的影響(X士S，n = 4) 注表示與空白對(duì)照組比較，P < 0. 05?！ū硎九c空白對(duì)照組比較，P < 0. 01。 A表示與陽(yáng)性對(duì)照(阿霉素)比較，P<0.01?！硎九cPV助溶劑比較，P< 0.05?！硎九cPVP助溶劑比較，P < 0. 01。4.結(jié)論GH-02小劑量有一定的抑瘤作用，而高劑量組則有明顯的抗腫瘤作用，與模型組相 比差異有顯著性，而與陽(yáng)性對(duì)照組相比則差異無(wú)顯著性。GH-02抗腫瘤作用雖然稍遜于陽(yáng)性 對(duì)照阿霉素，但仍顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤作用。實(shí)施例十三藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物對(duì)小鼠Lewis肺癌影響的動(dòng)物模型試驗(yàn)采用根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例六的制備方法制備的、具有實(shí)施例七的分子結(jié)構(gòu)的藍(lán)萼乙素 (GLB)衍生物的混合物(以下簡(jiǎn)稱GH-02)進(jìn)行動(dòng)物模型試驗(yàn)，考察GH-02對(duì)小鼠Lewis肺
癌的影響。1.實(shí)驗(yàn)材料，1. 1藥品與試劑GH_02(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99. 8% )，試驗(yàn)時(shí)用生理鹽水稀釋。1. 2儀器顯微鏡，酶標(biāo)儀1. 3動(dòng)物C57純系小鼠64只，體重為(20 士 2) 9，雌雄兼用，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)室溫度為22 — 25°C，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，飲水量不限。1. 4瘤株LewiS肺癌實(shí)體型由復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所羅建民老師惠贈(zèng)2.實(shí)驗(yàn)方法模型組(生理鹽水10mL/kg)，陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺25mg/ml)，GH-02 (25mg/ml) 分為腹腔注射組、靜脈注射組，每組8只動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法接種，接種后次日按擬定劑 量ip給藥，每天1次，連續(xù)10d。腹水性腫瘤以生命延長(zhǎng)率為療效指標(biāo)，停藥后繼續(xù)觀察 60d，死亡動(dòng)物以實(shí)際存活時(shí)間計(jì)算。實(shí)體型腫瘤以瘤質(zhì)量抑制率作為療效指標(biāo)，于停藥次 日將腫瘤剖出精確稱質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用抑瘤率x士s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表2GH-02對(duì)小鼠Lewis肺癌的影響。4.結(jié)論GH-02有明顯的抑瘤作用和抗腫瘤作用，與模型組相比差異有顯著性，而與陽(yáng)性對(duì) 照組相比則差異無(wú)顯著性。GH-02抗腫瘤作用強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照，顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤作用。腹 腔注射和靜脈注射都有明顯的抑瘤作用和抗腫瘤作用。上述內(nèi)容為本發(fā)明的具體實(shí)施例的例舉，對(duì)于其中未詳盡描述的試劑、設(shè)備、操作 方法等，應(yīng)當(dāng)理解為采取本領(lǐng)域已有的普通及常規(guī)試劑、設(shè)備、操作方法等來(lái)予以實(shí)施。同時(shí)本發(fā)明上述實(shí)施例僅為說(shuō)明本發(fā)明技術(shù)方案之用，僅為本發(fā)明技術(shù)方案的列 舉，并不用于限制本發(fā)明的技術(shù)方案及其保護(hù)范圍。采用等同技術(shù)手段、等同試劑等對(duì)本發(fā) 明權(quán)利要求書(shū)及說(shuō)明書(shū)所公開(kāi)的技術(shù)方案的改進(jìn)應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是沒(méi)有超出本發(fā)明權(quán)利要求書(shū) 及說(shuō)明書(shū)所公開(kāi)的范圍。
權(quán)利要求
一種藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物，其特征在于，是一種二萜類(lèi)物質(zhì)，具有貝殼杉烷型結(jié)構(gòu)、羰基、多肽cNGQGEQc和/或羥基，其分子結(jié)構(gòu)的通式如下其中，R1為-cNGQGEQc、-OH或R2為-cNGQGEQc或-OH。F2009100485533C0000011.tif,F2009100485533C0000012.tif
2.如權(quán)利要求1所述的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物，其特征在于，分子結(jié)構(gòu)如下
3.—種如權(quán)利要求1 2所述的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備方法，其特征在于，包含 以下步驟步驟1 粉碎取香茶菜藥材(地上部分)粉碎至20目 50目；步驟2 提取步驟2. 1 將步驟1所得的粉碎物與95%乙醇混合，加熱回流，提取過(guò)濾，得到提取液和 剩余物；步驟2. 2 將步驟2. 1所得的剩余物與95%乙醇混合，加熱回流，提取過(guò)濾，得到提取液 和剩余物，重復(fù)該步驟1 3次；步驟2. 3 合并步驟2. 1和2. 2所得的提取液；步驟3 溶劑處理步驟3. 1 將步驟2所得的提取液加熱減壓濃縮，回收乙醇并得到粘稠的初級(jí)濃縮物；步驟3. 2 將步驟3. 1所得的初級(jí)濃縮物與水混合，攪拌隨后靜置，棄去上清液得到下 層固體；步驟3. 3 將步驟3. 2所得的固體與乙酸乙酯混合，攪拌溶解并靜置，過(guò)濾得到濾液和 不溶物；步驟3. 4 將步驟3. 3所得的不溶物與乙酸乙酯混合，攪拌溶解并靜置，過(guò)濾得到濾液 和不溶物，重復(fù)該步驟1 3次；步驟3. 5 合并步驟3. 3和3. 4所得的濾液；步驟3.6 將步驟3. 5所得的濾液加熱，減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到固體濃縮物；步 驟4:過(guò)柱步驟4. 1 將步驟3所得的固體濃縮物與95%乙醇混合溶解，得到溶液； 步驟4. 2 將步驟4. 1所得的溶液緩慢加到樹(shù)脂柱中，觀察樹(shù)脂的顏色，采用95%乙醇 沖洗該樹(shù)脂柱，收集所有流出液，步驟4. 3:將步驟4. 2所得流出液減壓加熱回流，直至溶劑干，得到固體殘留物；步驟 5 重結(jié)晶步驟5. 1 將上述殘留物與極性溶劑混合，得到初級(jí)溶液，加熱并減壓濃縮，靜置析晶， 過(guò)濾得到黃色針狀結(jié)晶； 步驟5. 2 將步驟5. 1所得的結(jié)晶與極性溶劑混合，反復(fù)重結(jié)晶2 4次，得到濃縮物； 步驟6:分離提純步驟6. 1 將步驟5所得的濃縮物加入乙酸乙酯溶解，加入200-300目硅膠，混合均勻， 室溫?fù)]發(fā)干燥，除去溶劑乙酸乙酯；步驟6. 2 濕法填裝一根層析硅膠柱，并采用氯仿反復(fù)沖洗硅膠柱； 步驟6. 3 將步驟6. 1所得的混有硅膠的濃縮物加入到步驟6. 2所得的硅膠柱中，采用 氯仿沖洗；步驟6. 4 采用氯仿和丙酮的混合溶液沖洗所述硅膠柱，并采用TLC薄層分析方法檢驗(yàn) 目標(biāo)餾分藍(lán)萼乙素(GLB)，在檢驗(yàn)到相應(yīng)餾分的時(shí)候，收集含有藍(lán)萼乙素(GLB)主成分的餾 分；步驟6. 5 將步驟6. 4所得的餾分合并，減壓濃縮，回收溶劑，將所得的濃縮物用氯仿和 丙酮的混合溶液重結(jié)晶，得到白色針狀晶體藍(lán)萼乙素(GLB)； 步驟7 合成步驟7. 1 將步驟6所得的藍(lán)萼乙素(GLB)和多肽(cNGQGEQc)和無(wú)水極性溶劑混合得 到混合液；步驟7. 2 將步驟7. 1所得的混合溶液加熱，攪拌冷凝回流，趁熱抽濾，靜置，析出晶體， 過(guò)濾，分離出晶體，得到藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物； 步驟8 合成步驟8. 1 將步驟6所得的藍(lán)萼乙素(GLB)溶解在乙醇溶液中，在室溫下向其中滴加氫 氧化鈉溶液，減壓濃縮，除去乙醇溶液，得到濃縮物；步驟8. 2 將步驟8. 1所得的濃縮物加入乙酸乙酯，在室溫下進(jìn)行萃取，得到乙酸乙酯 萃取層，共萃取2次，得到萃取物；步驟8. 3 將步驟8. 2所得的萃取物與極性溶劑混合，得到初級(jí)溶液，加熱并減壓濃縮， 靜置析晶，過(guò)濾得到結(jié)晶；步驟8. 4 將步驟8. 3所得的結(jié)晶與極性溶劑混合，反復(fù)重結(jié)晶2 4次，得到晶體； 步驟8. 5 將步驟8. 4所得的晶體和多肽(cNGQGEQc)和無(wú)水極性溶劑混合得到混合液；步驟8. 6 將步驟8. 5所得的混合溶液加熱，攪拌冷凝回流，趁熱抽濾，靜置，析出晶體， 過(guò)濾，分離出晶體，得到藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物。
4.如權(quán)利要求3所述的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟2. 1中，是將所述粉碎物與95%乙醇按照體積比1 6至1 10混合，加熱，在80°C 90°C溫 度條件下回流1 2小時(shí)，再提取過(guò)濾；所述步驟2. 2中，是將所述剩余物與95%乙醇按照體積比1 6至1 10混合，加熱， 在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時(shí)，再提取過(guò)濾。
5.如權(quán)利要求4所述的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟3.1 中，是將所述提取液加熱，在55°C 65°C溫度條件下減壓濃縮；所述步驟3. 2中，是將所述初級(jí)濃縮物與水按照體積比1 8 1 10混合，在室溫 條件下攪拌并隨后靜置6 12小時(shí)才分離上清液和固體；所述步驟3. 3中，是將所述固體與乙酸乙酯按照體積比1 4 1 6混合，在25°C 35°C溫度條件下攪拌溶解，靜置1 3小時(shí)再過(guò)濾；所述步驟3.4中，是將所述不溶物與乙酸乙酯按照體積比1 4 1 6混合，在 25°C 35 °C溫度條件下攪拌溶解，靜置1 3小時(shí)再過(guò)濾；所述步驟3. 6中，是將所述濾液加熱，在35°C 45°C溫度條件下減壓濃縮。
6.如權(quán)利要求5所述的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟4.1 中，是將所述固體濃縮物與95%乙醇按照體積比1 4 1 6混合溶解；所述步驟4. 2中，采用的樹(shù)脂柱為填充物為強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂、并用氫氧化鈉飽和至 PH值中性的樹(shù)脂柱；所述步驟4. 2中，當(dāng)所述樹(shù)脂柱有2/3變色時(shí)，停止加樣，并采用200ml 400ml的95% 乙醇沖洗所述樹(shù)脂柱；所述步驟4. 3中，是將所述流出液加熱，并在55°C 65°C溫度條件下減壓回流。
7.如權(quán)利要求6所述的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟5.1 和5. 2中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿和丙酮的混合溶液； 所述步驟5. 1中，是將所述殘留物與30°C 40°C的極性溶劑按照體積比1 4 1 6混 合；所述步驟5. 1中，是將所述初級(jí)溶液加熱，在30°C 40°C溫度條件下減壓濃縮， 在-5°C _8°C溫度條件下靜置析晶；所述步驟5.2中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4 1 6混合， 在-5°C _8°C溫度條件下反復(fù)重結(jié)晶2 4次。
8.如權(quán)利要求7所述的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備方法，其特征在于，所述的步驟 6. 1中，是將所述的濃縮物加入20ml乙酸乙酯溶解，而所述硅膠的加入量為所述濃縮物重 量的3倍；所述步驟6. 2中，所述硅膠用量為步驟5所得的濃縮物重量的20倍，柱子徑高比為 1 12，所述氯仿的用量為2BV(2倍柱體積)；所述步驟6. 3中，所述氯仿的用量為2BV且流速為1. 5BV/小時(shí)； 所述步驟6. 4中，是采用3BV的氯仿和丙酮的混合溶液沖洗所述硅膠柱； 所述的3BV的氯仿和丙酮的混合溶液中，氯仿和丙酮的體積比為20 1 ； 所述步驟6. 5中，所得餾分是在30°C 40°C溫度條件下減壓濃縮，濃縮過(guò)程中氯仿和 丙酮的混合溶液的用量與所述餾分的體積比為8 1 12 1;所述氯仿和丙酮的混合溶液中，氯仿和丙酮的體積比為1 1 1 4。
9.如權(quán)利要求8所述的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟7.1 中，是按照每8 17g藍(lán)萼乙素(GLB)、0. 7 2. 3g多肽(cNGQGEQc)和80 150ml無(wú)水極 性溶劑的比例混合；所述步驟7. 1中，所述無(wú)水極性溶劑為甲醇、乙醇、二氯甲烷中的一種； 所述步驟7. 2中，是將所述混合溶液加熱，在60°C 80°C溫度條件下攪拌冷凝回流 6 10小時(shí)，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶；所述步驟8. 1中，是按照每8 17g藍(lán)萼乙素(GLB)，每70 130ml乙醇溶液的比例混 合，并在室溫下向其中滴加lmol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)PH = 13，持續(xù)攪拌5分鐘，再減壓 濃縮，除去乙醇溶液，得到濃縮物；所述步驟8. 2中，每次萃取中所述乙酸乙酯的使用量為步驟8. 1中氫氧化鈉溶液的使 用量的2倍量(體積比)；所述步驟8. 3和8. 4中，所述極性溶劑混合為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿 和丙酮的混合溶液；所述步驟8. 3中，是將所述萃取物與30°C 40°C的極性溶劑按照體積比1 4 1 6 混合；所述步驟8. 3中，是將所述初級(jí)溶液加熱，在30°C 40°C溫度條件下減壓濃縮， 在-5°C _8°C溫度條件下靜置析晶；所述步驟8.4中，是將所述結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4 1 6混合， 在-5°C _8°C溫度條件下反復(fù)重結(jié)晶2 4次，得到晶體。所述步驟8. 5中，是按照每8 17g步驟8. 4所得晶體、0. 7 2. 3g多肽(cNGQGEQc) 和80 150ml無(wú)水極性溶劑的比例混合；所述步驟8. 5中，所述無(wú)水極性溶劑為甲醇、乙醇、二氯甲烷中的一種； 所述步驟8. 6中，是將所述混合溶液加熱，在60°C 80°C溫度條件下攪拌冷凝回流 6 10小時(shí)，趁熱抽濾，室溫下靜置析晶。
10.如權(quán)利要求1 3所述的藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物在治療癌癥中的應(yīng)用，特別是在治 療肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物、制備方法及其用途。所述藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物以藍(lán)萼乙素(GLB)為主體，是二萜類(lèi)物質(zhì)，具有貝殼杉烷型結(jié)構(gòu)、羰基、多肽cNGQGEQc和/或羥基。本發(fā)明采用香茶菜藥材(地上部分)作為原料，進(jìn)行粉碎、提取、溶液處理、過(guò)柱、重結(jié)晶等得到藍(lán)萼乙素(GLB)，再和多肽cNGQGEQc進(jìn)行進(jìn)一步的乙酰化反應(yīng)，得到所述藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物。所述藍(lán)萼乙素(GLB)衍生物具有較高的抗癌活性，對(duì)于肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病多種腫瘤細(xì)胞均有顯著的抑制，尤其對(duì)于肺癌具有靶向作用，可以針對(duì)性地治療肺癌。
文檔編號(hào)A61K38/08GK101851272SQ20091004855
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者李云森, 檀愛(ài)民, 程萍, 陳子珺, 雷啟福 申請(qǐng)人:蘇州金昊藥業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司