專利名稱：：一種快速鑒定胚胎期小鼠性別的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種鑒定胚胎期小鼠性別的方法，特別是涉及鑒定胚胎期14.5天(E14.5d)至16天(E16d)小鼠性別的方法。
背景技術(shù)：
：小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的理想模型,被廣泛用于醫(yī)學(xué)，生物,農(nóng)業(yè)等科研領(lǐng)域。而小鼠發(fā)育至胚胎期(尚未出生)14.5天左右的時(shí)候正是性腺激素分泌高峰時(shí)期，也是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育高峰期,此時(shí)期是許多科研取材用于與性腺激素調(diào)控相關(guān)的組織器官的研究以及與性腺激素相關(guān)信號(hào)通路的研究等方向的關(guān)鍵時(shí)期。因此，這一時(shí)期胎鼠性別的快速鑒定，對于科學(xué)研究具有重要意義。目前，胎兒性別鑒定的分子生物學(xué)方法主要有核型分析法，PCR法，X-連接酶檢測法等。核型分析方法的準(zhǔn)確率較高，但是鑒別時(shí)間長,需要對細(xì)胞進(jìn)行建系。PCR法簡單，靈敏，但要保證準(zhǔn)確率，通常需要復(fù)合PCR的方法進(jìn)行鑒定，也比較耗時(shí)。X-連接酶檢測法使用的染料對胚胎的存活不利，酶失活時(shí)間也不易確定。許多時(shí)候，科研人員需將胎兒組織冷凍起來，先取部分樣品借助分子生物學(xué)手段對其性別進(jìn)行鑒定，之后才能選擇特定性別的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。也有研究人員，將性腺部位解剖后，通過生殖腺的內(nèi)部早期發(fā)育特點(diǎn)判斷性別，但這樣做需要有長期的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),不適用于所有人。那么，如果可以找到一種簡單、快速而又直觀的方法鑒定這-時(shí)期的胎鼠性別，無疑可以給科學(xué)研究人員提供極大的方便，既可以大大提高實(shí)驗(yàn)效率，保證實(shí)驗(yàn)的精確性，又能節(jié)省人力物力。小鼠乳腺的發(fā)育最早起始于Ell.5天,形似凸透鏡，E16天后，腺芽頂端生長迅速，形成萌芽并進(jìn)一步向真皮層乃至乳脂墊延伸出乳腺導(dǎo)管，并出現(xiàn)分叉。從乳腺組織雛形形成到乳腺導(dǎo)管形成之前的Ell.5E16天這段發(fā)育時(shí)期稱為乳腺發(fā)育早期的乳腺原基(ma咖aryanlagen)時(shí)期(Robinson,2004;Veltmaatetal.2003)。在乳腺原基時(shí)期的E14dE16d,雌性小鼠和雄性小鼠的乳腺原基受雌激素和雄激素的不同刺激，將經(jīng)歷不同的發(fā)育變化。雄性小鼠乳腺原基周圍的間葉組織表達(dá)雄激素受體(AR)，應(yīng)答雄激素而誘導(dǎo)乳腺小芽發(fā)生退化。雌性小鼠乳腺原基周圍的間葉組織沒有活躍的AR表達(dá)而不會(huì)受到影響(Kratochwil&Schwartz1976)?；谶@個(gè)理論，發(fā)明人觀察這一特殊時(shí)期不同性別胎鼠乳腺原基的發(fā)育變化，意外發(fā)現(xiàn)通過觀察乳腺原基的方法可以快速區(qū)分胎鼠E14.5E16天的性別，并通過分子生物學(xué)方法對這一判斷方法的準(zhǔn)確率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，證明此方法簡單可行。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能快速準(zhǔn)確的鑒定胚胎期14.5天至胚胎期16天小鼠性別的方法，為科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究提供方便。本發(fā)明提供的快速鑒定胚胎期小鼠性別的方法，包括如下歩驟取胚胎期14.516天的胎鼠，置于體視鏡下，觀察胎鼠第4、5對乳腺,乳腺原基呈現(xiàn)為白色圓點(diǎn)的為雄性；3乳腺原基呈現(xiàn)為與皮膚界限模糊的圓暈的為雌性。雄性胎鼠乳腺原基呈現(xiàn)的白色圓點(diǎn)為針尖大小，直徑約為250300um，與周圍皮膚顏色差異顯著。雌性胎鼠的乳腺原基則與周圍皮膚界限不清晰，呈現(xiàn)出模糊的圓暈。在觀察時(shí)體視鏡的放大倍數(shù)以0.8*10倍(8倍)為宜，并且使用外光源輔助觀察。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，是否使用體視鏡以及放大的倍數(shù)對本申請沒有實(shí)質(zhì)的影響。從子宮中取出胚胎，在觀察前應(yīng)當(dāng)用PBS對胎鼠進(jìn)行清洗，以便提高觀察效果。此外，還可以進(jìn)一步分離乳腺原基，觀察乳腺原基的形態(tài)，中間具有透明空腔的為雌性，沒有透明空腔的為雄性。經(jīng)PCR驗(yàn)證表明，本發(fā)明方法通過乳腺原基的外觀判斷胎鼠的性別是可靠的。在胚胎期第1516天，其準(zhǔn)確率可達(dá)到百分之百。本發(fā)明方法為科學(xué)研究人員提供極大的方便，既可以大大提高實(shí)驗(yàn)效率,保證實(shí)驗(yàn)的精確性，又能節(jié)省人力物力。圖1是E15.5天胎鼠腹部體視鏡拍攝外觀圖。E15.5天不同性別胎鼠腹部中線兩側(cè)的第4,第5對乳腺已呈現(xiàn)明顯差異。左邊為雌性胎鼠，箭頭所示為雌性胎鼠乳腺原基(雌性乳腺原基呈圓暈狀，與周圍皮膚顏色差別不明顯)；右邊為雄性胎鼠，箭頭所示為雄性胎鼠乳腺原基(雄性乳腺原基為白色圓點(diǎn)，與周圍皮膚顏色差異顯著)。圖2顯示的是體視鏡下分離得到的不同性別胎鼠的乳腺原基。左....匕為雌性中間有透明空腔，右下為雄性，中間退化成黑色。圖3顯示的是不同性別胎鼠的核型差異。A、B為雌性，染色體總數(shù)為4()，最小染色體數(shù)為2;C、D為雄性，染色體總數(shù)為40，最小染色體數(shù)為1。圖4SryY染色體特異基因的PCR擴(kuò)增鑒定及電泳檢測。泳道1為已知雌性小鼠的對照樣本；2為已知雄性的對照樣本；3和4為待檢母鼠樣本；5和6為待檢公鼠樣本；泳道7為l()()bpMarker。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1一、材料和器具1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正常野生型SPF級(jí)ICR小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，并于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)鼠房中按標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，12小時(shí)光照，自由采食。2、藥品DPBS為Gibco公司產(chǎn)品3、主要儀器設(shè)備1)電泳儀DYY-III2穩(wěn)壓電泳儀，北京六一儀器廠2)體視鏡日本NIKON公司3)超凈工作臺(tái)北京凈化設(shè)備廠4)低溫離心機(jī)E卯endorf公司5)凝膠成像系統(tǒng):ALPHA]:NN()TEC:H公司6)PHS-3C酸度計(jì)上海虹益儀器廠7)自動(dòng)滅菌鍋日本SANYO公司8)37°C恒溫水浴儀美國LIFESCIENCE公司9)9700型:PCR儀:美國PERKINELMER公司10)二氧化碳培養(yǎng)箱美國PERKINELMER公司11)超純水儀美國MILLIPORE公司4、試劑的配制DPBS緩沖液稱取DPBS粉末9.55g，使用超純水溶解，調(diào)節(jié)PH值=7.2，1L容量瓶定容，0.22"m濾膜過濾除菌，pH=7.27.4，4。C儲(chǔ)藏備用。二、實(shí)驗(yàn)方法1、胎鼠的獲得和日齡的確定將8周齡ICR雌性發(fā)情小鼠于下午4點(diǎn)左右放入種公鼠籠子中進(jìn)行交配，隔日早上8點(diǎn)檢查陰栓，確定是否受孕。以見栓日為第0.5天，14天后早上取得的胎鼠計(jì)為胚胎期14.5天；如此計(jì)算，晚....匕取得的胎鼠計(jì)為胚胎期15天；次日早....匕取得的胎鼠計(jì)為胚胎期15.5天；次日晚上取得的胎鼠計(jì)為胚胎期16天。2、不同日齡乳腺原基的分離將圍產(chǎn)期指定日期(以胚胎期15.5天為例)的雌性母鼠脫頸處死，70%酒精消毒腹部。用已滅菌的手術(shù)剪刀、鑷子小心剪開腹部皮膚，小心將子宮剪下，迅速放入盛有DPBS的培養(yǎng)皿中，用彎頭鑷小心將子宮壁撕破，取出胎兒，并將其轉(zhuǎn)移至另一盛有DPBS的培養(yǎng)皿中，反復(fù)清洗3遍至液清為止。體視鏡下，用外光源照射胎鼠腹部,根據(jù)乳腺原基的顏色和大小等外部特點(diǎn)區(qū)別雌雄，如圖1所示胎鼠腹部中線兩側(cè)的第4，第5對乳腺已呈現(xiàn)明顯差異。左邊為雌性胎鼠，箭頭所示為雌性胎鼠乳腺原基(雌性乳腺原基呈圓暈狀，與周圍皮膚顏色差別不明顯)；右邊為雄性胎鼠，箭頭所示為雄性胎鼠乳腺原基(雄性乳腺原基為白色圓點(diǎn)，與周圍皮膚顏色差異顯著)。分裝兩個(gè)培養(yǎng)皿中。在體視鏡下去除胎鼠頭部及四肢，用眼科鑷和游絲鑷沿胎鼠體軀兩側(cè)壁分別剝離腹部皮膚,用游絲鑷剝離乳腺原基，對乳腺原基進(jìn)行觀察(如圖2)。取剩余組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和提基因組DNA。3、核型分析(1)將不同性別的胎鼠組織樣品(經(jīng)外觀判定性別，分離乳腺原基后的組織樣品)，取-一部分經(jīng)胰酶消化后，進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)到細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)即可。(2)去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入含有0.lug/ml秋水仙素的(DMEM+10%FBS)溶液10ml，放入C02培養(yǎng)箱12小時(shí)。(3)取出培養(yǎng)瓶觀察細(xì)胞分裂相，多則優(yōu)，倒出含秋水仙素的培養(yǎng)液于15ml離心管中，加入胰酶，將分裂中期的細(xì)胞消化下來，再加入剛剛放于15ml離心管的含秋水仙素的培養(yǎng)液終止胰酶活性，然后再全部移入15ml離心管中，1200rpm，離心4min。(4)去上清液，加入0.075M的KC1低滲溶液處理30min,低滲液應(yīng)先在37。C水浴中預(yù)熱半小時(shí)，低滲處理的細(xì)胞在離心管中也放入37"C水浴中預(yù)熱。加低滲液時(shí)還要注意，第lml應(yīng)逐滴加入，而且邊滴邊振搖。(5)低滲處理30min后，繼續(xù)加入1ml4。C下預(yù)冷的固定液(乙酸甲醇=1:3)并按住瓶口立即倒置兩次預(yù)固定。離心，l(X)()rpra，l()rain。(6)去上清液，往離心管中加10ml冷的固定液，第lml同樣逐滴加入，邊滴邊搖勻，固定30min(即靜置30min)，離心，1000rpm，10min。(7)二次固定，步驟同(6)，固定時(shí)間變?yōu)?5min,離心，1000rpm，10min，去上清。[,](8)三次固定，重復(fù)(7)步驟。(9)去上清后，視細(xì)胞沉淀量的多少加入適量固定液重懸(100-500iU)。(10)重懸細(xì)胞使之均勻后即可滴片，玻片要求潔凈濕冷，(從-201:冰箱中取出，再用口吹干玻片上的霜變成水使玻片透明可見即可)。滴加細(xì)胞懸液一滴一玻片。(11)吉姆薩染液染片lOmin，蒸餾水沖洗，顯微鏡下觀察染色體形態(tài)。4、SryY染色體特異基因的PCR鑒定(1)SryY基因的DNA引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI上已報(bào)道的小鼠Sry基因序列，使用DNAMAN設(shè)計(jì)引物上游5-CTGGAAATCTACTGTGGTCTG-3下游5-ACCAAGACCAGAGTTTCCAG-3(2)樣品的基因組DNA的提取取已知性別的成年鼠尾各一個(gè)樣品作為對照；將不同性別的胎鼠組織樣品(經(jīng)外觀判定性別，分離乳腺原基后的組織樣品)，另取一部分作為檢測對象，提基因組DNA:1)剪取少量胚胎組織，盡可能剪碎；2)加入600u1組織提取緩沖液；3)加入20iilRNase(10mg/ml)，混勻，置37。C培養(yǎng)箱lh;4)加入20u1(2()mg/ral)蛋白酶K溶液，混勻，置37。C水浴過夜，其間時(shí)不時(shí)取出顛倒混勻；5)用等體積的苯酚抽提兩遍；6)用等體積的酚仿異戊醇(25:24:i)抽提一遍(離心完畢后，先用移液器深入管底吸走大部分的酚相，只留5()ii1左右，然后再離心5rain，用剪過頭的200y1的Tip頭自上而下吸取水相，盡量避免攜帶酚相)；7)加入2倍體積的冰預(yù)冷乙醇，顛倒混勻，DNA便以絮狀形式出現(xiàn)，用力搖動(dòng)使絮狀DNA成團(tuán)。8)用滅菌牙簽或Tip頭將沉淀挑出。7()%的乙醇洗兩遍，抽干，溶于3()()111滅菌雙蒸水(務(wù)必充分溶解，可在55t:水浴中溶解)；9)取1li1電泳點(diǎn)樣，檢査DNA的提取效果。(3)鏈?zhǔn)骄酆厦笖U(kuò)增反應(yīng)(PCR)欲擴(kuò)增片斷長度196bp，反應(yīng)體系2.5mMdNTP2u1Buffer2.5ii1引物各l"lTaq酶1U1基因組lii1H:2()至25U1反應(yīng)條件94°C5min;94。C30sec，56°C30sec，72°C30sec，32個(gè)循環(huán);72。C7min;4。C保存。(3)凝膠電泳檢測2%瓊脂糖凝膠。5、用以上方法分別對E14d、E14.5d、E15d、E15.5d、E16d的判定結(jié)果準(zhǔn)確率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)表1雌性鑒定統(tǒng)計(jì)表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2雄性鑒定統(tǒng)計(jì)表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、胚胎期乳腺外觀的直接鑒定將胚胎從子宮中小心分離出來后，PBS小心清洗三遍，在體視鏡外光源下0.8*10倍放大,可以明顯觀察到雌性小鼠與雄性小鼠第4，5對乳腺(腹股溝)所處的位置，乳腺原基從外觀上看已經(jīng)呈現(xiàn)明顯的差異——雄性小鼠乳腺呈現(xiàn)針尖大的白色圓點(diǎn)，顏色與周圍皮膚明顯差異；而雌性小鼠乳腺原基呈現(xiàn)與皮膚界限不是特別清晰的圓暈。如圖1。2、乳腺原基的分離基于E14dE16d這一特殊時(shí)期，雄性胎鼠來源的乳腺原基會(huì)受雄激素誘導(dǎo)而發(fā)生退化這一理論,我們發(fā)現(xiàn)分離后的乳腺原基也明顯呈現(xiàn)顯著差異。雌性胎鼠的乳腺原基呈泡狀，中間有-個(gè)透明的腔(如圖2左上)；雄性胎鼠的乳腺原基中間發(fā)黑，沒有透明的腔，原基的直徑也小于雌性胎鼠的乳腺原基(如圖2右下)。3、核型分析鑒定方法首先看染色體總數(shù)是否為40條(2n=40)，之后確定最小染色體數(shù)，若為奇數(shù)條，則為雄性(如圖3C,D);若為2條或偶數(shù)條，則為雌性(如圖3A,B)。4、PCR鑒定根據(jù)乳腺原基的外觀直接判斷胎鼠性別的胎鼠組織樣品，提基因組后，經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳檢測結(jié)果表明待檢公鼠的兩個(gè)泳道均有明亮的電泳條帶(如圖4泳道5和6),與己知公鼠對照(泳道2)相一致；待檢母鼠的兩個(gè)泳道(泳道3和4)均沒有電泳條帶出現(xiàn)，亦與已知母鼠對照(泳道l)相一致。5、統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明E14E16天，雄性胎兒性別判定的準(zhǔn)確率可達(dá)100%;而對于雌性胎兒性別判斷，E14天準(zhǔn)確率為70%左右；E14.5天準(zhǔn)確率升高到85%以上;E1516天準(zhǔn)確率可達(dá)100%。E16天以后，由于皮膚上的毛孔逐漸發(fā)育變大,再加上原基會(huì)向乳脂墊延伸，所以此方法不再適用。以上結(jié)果表明，通過乳腺發(fā)育早期的乳腺原基外觀形態(tài)是可以準(zhǔn)確、快速鑒定E14.516天胎鼠性別的有效方法。序列表〈110〉北京濟(jì)普霖生物技術(shù)有限公司〈120〉一種快速鑒定胚胎期小鼠性別的方法〈130>KHP08113408.5〈160〉2〈17()〉Patent]:nversion3.5〈210>1〈211>21〈212>DNA〈213>人工序列〈400〉1ctggaaat.ctactgtggtctg21〈210〉2〈211>2()〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>28accaagaccagagttt.ccag20權(quán)利要求一種快速鑒定胚胎期小鼠性別的方法，其包括如下步驟取胚胎期14.5～16天的胎鼠，置于體視鏡下，觀察胎鼠第4、5對乳腺，乳腺原基呈現(xiàn)為白色圓點(diǎn)的為雄性；乳腺原基呈現(xiàn)為與皮膚界限模糊的圓暈的為雌性。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于,觀察時(shí)體視鏡的放大倍數(shù)為8倍，并輔以外光源。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，雄性胎鼠乳腺原基呈現(xiàn)的白色圓點(diǎn)的直徑為250300um。4.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于，在觀察前還包括用PBS對胎鼠進(jìn)行清洗。5.如權(quán)利要求14任一項(xiàng)所述的方法,其還包括進(jìn)一步分離乳腺原基，觀察乳腺原基，中間具有透明空腔的為雌性,沒有透明空腔的為雄性。全文摘要本發(fā)明提供了一種快速鑒定胚胎期小鼠性別的方法，其包括如下步驟取胚胎期14.5～16天的胎鼠，置于體視鏡下，觀察胎鼠第4、5對乳腺，乳腺原基呈現(xiàn)為白色圓點(diǎn)的為雄性；乳腺原基呈現(xiàn)為與皮膚界限模糊的圓暈的為雌性。經(jīng)PCR驗(yàn)證表明，本發(fā)明方法通過乳腺原基的外觀判斷胎鼠的性別是可靠的。特別是在胚胎期第15～16天，其準(zhǔn)確率可達(dá)到百分之百。本發(fā)明方法為科學(xué)研究人員提供極大的方便，既可以大大提高實(shí)驗(yàn)效率，保證實(shí)驗(yàn)的精確性，又能節(jié)省人力物力。文檔編號(hào)A61B10/00GK101756714SQ20081024659公開日2010年6月30日申請日期2008年12月25日優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日發(fā)明者宋嘉哲,李寧申請人:北京濟(jì)普霖生物技術(shù)有限公司