專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體h5n1亞型流感基因工程疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組基因工程疫苗，具體地，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防動(dòng)物H5N1亞型流感的重組基因工程疫苗，更具體地，本發(fā)明所涉及的疫苗以H5N1亞型流感毒株糖蛋白HA作為抗原基因，以El、E3聯(lián)合缺失的復(fù)制缺陷型人腺病毒為載體。本發(fā)明還涉及該疫苗的HEK293細(xì)胞病毒培養(yǎng)物。
背景技術(shù)：
：高致病性H5N1亞型禽流感是危害世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要疾病，可導(dǎo)致感染禽群100%的死亡，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為I類(lèi)烈性傳染病。禽流感的廣泛傳播與流行給世界養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失，H5N1亞型流感病毒感染人并且致人死亡事件的出現(xiàn)，引起了國(guó)際糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和世界各國(guó)政府及人民的高度關(guān)注。用流感疫苗進(jìn)行免疫是預(yù)防和控制H5N1亞型流感發(fā)生的有效途徑之一。H5N1流感病毒疫苗現(xiàn)在仍然廣泛采用以雞胚進(jìn)行生產(chǎn)，這些疫苗雖然有較好的免疫效果，但存在生產(chǎn)成本昂貴、且運(yùn)輸和貯存必須依賴(lài)于低溫〃冷鏈〃，給藥方式單一且在流感大流行時(shí)受到雞胚供應(yīng)的限制等因素的限制。有效免疫接種，消除H5N1亞型流感病毒的傳染源與切斷傳播途徑，有賴(lài)于發(fā)展新一代H5N1亞型的基因工程重組疫苗。聯(lián)合缺失腺病毒早期區(qū)基因El和E3的重組復(fù)制缺陷型腺病毒具有宿主范圍廣，對(duì)外界環(huán)境有一定的抵抗能力，可免疫途徑多樣等優(yōu)點(diǎn)，具有作為基因工程H5N1亞型流感毒疫苗的優(yōu)良載體的潛力。而且，這種El和E3聯(lián)合缺失的重組復(fù)制缺陷型腺病毒還具有一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)由于El和E3區(qū)編碼多種與對(duì)抗機(jī)體免疫防衛(wèi)有關(guān)的蛋白質(zhì)，聯(lián)合缺失這兩個(gè)區(qū)域的重組病毒疫苗可望更有效地剌激免疫應(yīng)答，并成功地克服在新生動(dòng)物中可能存在的來(lái)自于母體的免疫干擾。研究和開(kāi)發(fā)基于復(fù)制缺陷型腺病毒的重組流感病毒疫苗將有望有效預(yù)防、控制H5N1亞型流感的流行并為預(yù)防新的流感大流行提供物質(zhì)儲(chǔ)備。本研究所對(duì)獲得表達(dá)H5N1亞型流感病毒HA基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒進(jìn)行了免疫效力評(píng)估，表明了其應(yīng)用潛力。以腺病毒載體進(jìn)行動(dòng)物疫苗的研究，其優(yōu)勢(shì)在于(1)病毒粒子相對(duì)穩(wěn)定，安全性較好；(2)腺病毒基因組較大(36Kb)，切除致瘤部分〔如El、E3)區(qū)后，可以插入相當(dāng)大的外源基因；(3)病毒感染的宿主細(xì)胞極為廣泛，而且由于它是DNA病毒，不會(huì)受其它RNA信息的干擾。不依賴(lài)宿主細(xì)胞增殖；(4)腺病毒載體很容易將外源基因直接轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中，并使其在細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)成活性蛋白；(5)重組腺病毒的靶細(xì)胞是分裂或者不分裂的細(xì)胞，且含有目的基因的重組腺病毒DNA是游離于細(xì)胞基因組外的(不整合入宿主基因組)，目的蛋白可得到瞬時(shí)的高水平表達(dá)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于預(yù)防動(dòng)物H5N1亞型流感的重組疫苗，這種疫苗的疫苗種毒是以H5N1亞型流感毒株A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)糖蛋白HA作為保護(hù)性抗原的E1、E3聯(lián)合缺失的復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-H5HA-EGFP。本發(fā)明提供的用于預(yù)防動(dòng)物H5N1亞型流感的重組疫苗，其特征在于以E1、E3聯(lián)合缺失的復(fù)制缺陷型人腺病毒為載體，以整合腺病毒E1基因的HEK293細(xì)胞為包裝細(xì)胞系，在載體El區(qū)攜帶有H5N1亞型流感病毒膜糖蛋白編碼基因HA基因。本發(fā)明提供的用于預(yù)防動(dòng)物H5N1亞型流感的重組疫苗中的E1區(qū)還進(jìn)一步攜帶用于篩選重組病毒的綠色熒光蛋白示蹤基因EGFP。本發(fā)明提供的用于預(yù)防動(dòng)物H5N1亞型流感的重組疫苗中的HA基因是來(lái)自于流感病毒株A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株的免疫原性基因。本發(fā)明的疫苗以人腺病毒為載體。人腺病毒有多個(gè)血清型，本發(fā)明載體采用5型人腺病毒(Ad-5)。使其缺失部分早期基因表達(dá)E1編碼區(qū)和E3編碼區(qū)，利用整合腺病毒E1區(qū)基因序列的HEK293細(xì)胞反式提供E1區(qū)的功能，使得E1區(qū)缺失的腺病毒載體增殖并產(chǎn)生成熟的腺病毒顆粒。將腺病毒骨架質(zhì)粒與重組腺病毒穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞內(nèi)，在HEK293細(xì)胞內(nèi)的重組酶Cre酶的作用，將通過(guò)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)相連接的HA基因及示蹤基因EGFP整合到腺病毒的骨架質(zhì)粒的El區(qū)，并在HEK293細(xì)胞反式補(bǔ)償El區(qū)功能下增殖并包裝產(chǎn)生成熟腺病毒粒子。在本發(fā)明的疫苗中，所述的H5N1亞型流感病毒糖蛋白來(lái)源于流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株HA基因的ORF，或是編碼相同蛋白質(zhì)的與其具有遺傳密碼簡(jiǎn)并性的序列。在本發(fā)明的疫苗中，所述的HA基因及示蹤基因EGFP均處于MCMV啟動(dòng)子和來(lái)自SV40病毒T抗原的mRNA加尾信號(hào)轉(zhuǎn)錄元件的控制之下。rAd-H5HA-EGFP在動(dòng)物細(xì)胞中并不復(fù)制，但能表達(dá)外源基因HA，其基因組在連續(xù)傳代過(guò)程中保持穩(wěn)定。本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)表面糖蛋白HA基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-H5HA-EGFP細(xì)胞培養(yǎng)物已根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2008年5月23日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進(jìn)行了保藏。保藏中心地址為中國(guó)武漢大學(xué)珞瑜山，保藏號(hào)為CCTCC-V200805。本發(fā)明的重組病毒的基本特性a:具有較為典型的腺病毒細(xì)胞病變(圖5A為重組病毒形成的典型細(xì)胞病變；圖5B為重組腺病毒熒光顯微鏡觀察結(jié)果)；b:PCR鑒定表明在連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中，重組腺病毒基因組穩(wěn)定存在(圖5C);c:Westernblotting分析結(jié)果表明表達(dá)的HA蛋白能夠被H5N1亞型流感病毒抗血清特異性識(shí)別，表達(dá)的HA蛋白分子量約為74Ku，與天然HA的分子量相仿(圖5D);d:對(duì)重組病毒進(jìn)行大量增殖與純化后，測(cè)定其感染性滴度，結(jié)果表明該重組病毒經(jīng)過(guò)大量增殖與純化后能夠滿(mǎn)足實(shí)際使用的需求。在rAd-H5HA-EGFP免疫組中，分別以初免108TCID5。(半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量)、107TCID50劑量的rAd-H5HA-EGFP肌肉注射接種7周齡雌性BALB/c小鼠，3周后分別以2X108TCIDs。、2Xl(fTCID5。進(jìn)行加強(qiáng)免疫，同時(shí)設(shè)載體病毒rAd-EGFP對(duì)照組、PBS對(duì)照組。初次免疫后2周、3周及加強(qiáng)免疫3周后采血，利用血凝抑制(HemagglutininInhibition,HI)試驗(yàn)方法測(cè)定血清中的HI抗體(圖6)。在初次免疫后2周即可檢測(cè)到HI抗體，rAd-H5HA-EGFP高劑量(108TCID5。)初次免疫后3周HI抗體約為1:80，加強(qiáng)免4疫(2X108TCID5。)后3周達(dá)1:120，而各對(duì)照組HI抗體檢測(cè)均呈陰性。加強(qiáng)免疫后3周分別用106EID5。同源病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株(簡(jiǎn)稱(chēng)SW/FJ/1/01)和異源病毒A/Chicken/HuNan/77/2005(H5N1)(簡(jiǎn)稱(chēng)CK/HuN/77/05)進(jìn)行攻毒，攻毒后每天監(jiān)測(cè)小鼠的體重變化，并于攻毒后4天和6天隨機(jī)剖殺每組中的3只小鼠，采集腦、脾、肺、腎進(jìn)行臟器病毒滴定。結(jié)果SW/FJ/1/01病毒攻擊后所有的免疫小鼠在第4天和6天各臟器均無(wú)病毒復(fù)制，且小鼠體重正常增長(zhǎng)；而對(duì)照組小鼠在攻毒后均能夠在肺臟中檢測(cè)到病毒，且出現(xiàn)體重下降。CK/HuN/77/05病毒攻擊后第4天和6天，所有的免疫小鼠肺臟中檢測(cè)到的病毒含量相比對(duì)照組顯著下降，小鼠體重均增重，無(wú)死亡；而對(duì)照組小鼠在攻毒后4天能從脾、肺、腎中檢測(cè)到病毒，6天后在肺中仍可檢測(cè)到病毒，且小鼠體重減輕顯著，對(duì)照組小鼠均出現(xiàn)死亡，死亡率分別為80%(4/5)及100%(5/5)。表明rAd-H5HA-EGFP以108TCID5。初免、2X108TCID5。加強(qiáng)免疫后能夠使免疫小鼠完全抵御同源和異源H5N1亞型流感病毒的攻擊；以107TCID5。初免、2X107TCID5。加強(qiáng)免疫，小鼠能夠完全抵御同源病毒的攻擊，對(duì)異源病毒的攻擊也能夠提供良好的免疫保護(hù)效果。關(guān)于序列表的說(shuō)明序列1是HA序列；序列2是穿梭質(zhì)粒pDC315-H5HA-EGFP序列。圖1為EGFP序列；圖2A為本發(fā)明表達(dá)H5N1亞型流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)HA基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建流程；圖2B顯示pDC315-H5HA-EGFP的PCR鑒定，其中M是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1顯示以質(zhì)粒pDC315-H5HA-EGFP為模板的PCR產(chǎn)物，2顯示水對(duì)照；圖2C顯示pDC315-H5HA-EGFP的雙酶切鑒定，其中M是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1是利用Sail和Smal的雙酶切:pDC315-H5HA-EGFP/SalI+Smal，2是利用Nhel和Smal的雙酶切:pDC315-H5HA-EGFP/Nhel+Smal;圖3為腺病毒骨架載體質(zhì)粒pBHGloxAE1，E3Cre的圖譜；圖4為El，E3聯(lián)合缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒rAchH5HA-EGFP結(jié)構(gòu)特征，重組復(fù)制缺陷型病毒rAd-H5HA-EGFP缺失部分El編碼區(qū)和E3編碼區(qū)，El和E3區(qū)基因產(chǎn)物對(duì)于病毒對(duì)抗機(jī)體免疫至關(guān)重要。連接有Kozak翻譯調(diào)控序列的全長(zhǎng)HA糖蛋白基因及由IRES序列鏈接的EGFP基因均處于MCMV啟動(dòng)子和SV40polyA信號(hào)的控制之下，插入缺失的E1區(qū)中；圖5是重組腺病毒構(gòu)建、篩選及鑒定有關(guān)結(jié)果；圖5A顯示重組病毒出毒時(shí)的典型細(xì)胞病變(100X);圖5B顯示重組病毒熒光顯微鏡觀察(100X);圖5C顯示重組腺病毒的PCR鑒定結(jié)果，其中M是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1表示以重組病毒rAd-H5HA-EGFP的DNA為模板的PCR產(chǎn)物，2表示以HEK293細(xì)胞的DNA為模板PCR產(chǎn)物；圖5D顯示重組病毒rAd-H5HA-EGFP的Westernblot分析，其中M是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(170、130、95、72、55、43、34Ku)，1是rAd-EGFP感染的HEK293;2是rAd-H5HA-EGFP感染的HEK293。圖6為rAd-H5HA-EGFP肌肉注射免疫接種BALB/c小鼠后，采用HI試驗(yàn)方法測(cè)定血清中的HI抗體的結(jié)果；圖7A顯示SW/FJ/1/01病毒攻毒后小鼠的體重變化；圖7B顯示CK/HuN/77/05攻毒后小鼠的體重變化；圖8顯示Ck/HuN/77/05攻毒后小鼠的存活率。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1:構(gòu)建本發(fā)明表達(dá)流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)HA基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒A.獲得免疫原取A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)(購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感實(shí)驗(yàn)室)在SPF雞胚(購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)增殖48小時(shí)后收獲尿囊液，加入Trizol試劑(GibcoBRL)提取RNA，用通用引物unil2(序列為5'-AGCAAAAGCAGG-3')逆轉(zhuǎn)錄獲得流感病毒HA基因cDNA。B.制備、收集和驗(yàn)證重組腺病毒rAd-H5HA-EGFP以在以上A中獲得的cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HA基因，所用引物上游引物HAF:5'CCCGTCGACATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGC3';下游引物HAR:5'TCCCCCGGGTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAACG3';PCR反應(yīng)條件為:95。C預(yù)變性5分鐘，然后94°C1分鐘，56t:退火1分鐘，72t:延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)。首先將HA基因PCR產(chǎn)物及真核載體pIRES2-EGFP均用Sail和Smal酶切，回收相應(yīng)片斷，HA基因(序列1)定向克隆到pIRES2-EGFP(購(gòu)自BDBiosciencesClontech，EGFP序列見(jiàn)圖1)中獲得重組質(zhì)粒pHA-IRES-EGFP;再用Notl酶切重組質(zhì)粒pHA-IRES-EGFP，用DNA聚合酶I(Klenow)大片段進(jìn)行補(bǔ)平后，再用Nhel酶切，得到線性化片段HA-IRES-EGFP(長(zhǎng)度約為3.lkb);用Accl酶切腺病毒穿梭載體pDC315(購(gòu)自Microbixbiosystem，加拿大)，并用DNA聚合酶I(Klenow)大片段補(bǔ)平，再用Nhel酶切得到線性化的pDC315質(zhì)粒片段；將HA-IRES-EGFP片段定向克隆到穿梭質(zhì)粒PDC315中得到重組穿梭質(zhì)粒pDC315-H5HA-EGFP(質(zhì)粒序列見(jiàn)序列2)，構(gòu)建過(guò)程如圖2A，以PCR鑒定及酶切圖譜分析確認(rèn)其插入有正向單拷貝外源基因，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2B及圖2C。隨后，此重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架載體質(zhì)粒pBHGloxAEl，E3Cre(Microbixbiosystem,加拿大，該質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖3)—起共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞(ATCCNO:CRL-1573TM)，因重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-H5HA-EGFP含有腺病毒左側(cè)的反向末端重復(fù)序列(LITR)、腺病毒包裝信號(hào)(uO等順式作用元件以及目的基因HA及由IRES連接的示蹤基因EGFP和腺病毒基因組的左端一段序列；骨架質(zhì)粒pBHGloxAEl，E3Cre與重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-H5HA-EGFP的3'端略微重疊，然后繼續(xù)向右，包含有大部分的腺病毒基因組序列。兩者共轉(zhuǎn)染入可以表達(dá)腺病毒E1區(qū)的HEK293細(xì)胞并發(fā)生同源重組，后經(jīng)多輪篩選、噬斑純化、熒光顯微鏡觀察及目的基因鑒定等一系列鑒定后獲得復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-H5HA-EGFP(重組腺病毒構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖4)。以細(xì)胞病變(CPE)和熒光顯微鏡觀察以及對(duì)該重組腺病毒進(jìn)行了PCR鑒定，結(jié)果如圖5A、圖5B及圖5C。利用構(gòu)建好的腺病毒穿梭質(zhì)粒與腺病毒的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后7-8天后在HEK293細(xì)胞上形成腺病毒病變細(xì)胞腫脹，變圓。接種HEK293細(xì)胞后至出現(xiàn)腺病毒感染所形成的典型細(xì)胞病變出現(xiàn)葡萄串樣變化，病變細(xì)胞呈條帶狀(圖5A)。病毒增殖后期細(xì)胞變圓，葡萄串樣聚集，形態(tài)正常細(xì)胞零星分布(圖5A)，熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)強(qiáng)烈熒光信號(hào)(圖5B)。利用PCR方法檢測(cè)到目的基因的存在(圖5C)。具體操作如下按常規(guī)方法培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，將重組病毒rAd-H5HA-EGFP以感染復(fù)數(shù)m.o.i=5病毒量感染HEK293細(xì)胞，待所述細(xì)胞病變達(dá)80-90%時(shí)收獲；按WizardSVGenomicDNAPurificationSystem說(shuō)明書(shū)(Promega，美國(guó))進(jìn)行重組病毒DNA的提取，將重組病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物置于潔凈的Wizard敷微量管中，室溫下13000g離心3分鐘，以使得基因組DNA與微量管結(jié)合，將微量管與收集管分離，棄去收集管中的液體后，并向微量管中加入650iiL的Wizard⑧SV洗液，13000g離心1分鐘，總共洗四次。13000g離心2分鐘后，將微量管置于一潔凈收集管中，加入250iiL室溫?zé)o核酸酶(Nuclease-free)的水(為了提高DNA的產(chǎn)量可以將水溫升至65°C)。將微量管置于洗脫管中，13000g離心1分鐘。再次加入250iiL不含核酸酶的水，室溫溫育2分鐘，13000g離心1分鐘棄微量管，洗脫液總體積近500iiL。所得DNA保存于-2(TC或-7(TC備用，作重組病毒的PCR鑒定。在重組病毒的PCR鑒定中，以所獲得的DNA為模板，使用與擴(kuò)增HA基因過(guò)程中相同的引物及PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，以此來(lái)驗(yàn)證HA基因是否已重組到腺病毒的基因組中。C.重組病毒的基本特性按照B中所述方法制備DNA。分別選取第4、9及14代rAchH5HA-EGFP重組病毒基因組DNA為模板進(jìn)行HA基因的的PCR擴(kuò)增與測(cè)序，結(jié)果表明重組病毒在連續(xù)傳代過(guò)程中遺傳性狀穩(wěn)定(圖略)。Westrnblotting分析重組病毒rAd-H5HA-EGFP的表達(dá)分別接種重組病毒rAd-H5HA-EGFP、載體病毒rAd-EGFP于HEK293細(xì)胞，病變80%左右時(shí)收獲感染細(xì)胞，加入等體積的2XSDS電泳上樣緩沖液(100mmol/LTris-HCl，pH=6.8、200mmol/L二硫蘇糖醇、4XSDS、0.2X溴酚藍(lán)、20X甘油)裂解細(xì)胞，置于沸水中煮沸10分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性后在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳和電轉(zhuǎn)移，將分離的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5X脫脂奶/PBS(5X脫脂乳，溶于0.lmol/L的PBS，pH7.4)溶液將硝酸纖維素膜4t:封閉過(guò)夜，后用PBS洗滌3次，加入用封閉液配制的1:100倍稀釋的H5N1亞型流感病毒多克隆抗血清，37t:作用1小時(shí)，再用充分體積的PBS漂洗3次，用Tris-HCl緩沖液(150mmo1/L，NaCl，50mmol/LTris-HCl，pH7.5)洗滌一次10分鐘。加入IRDyeTM700DX標(biāo)記兔抗雞IgG(Rochland，美國(guó))(用含5X脫脂乳的Tris-HCl緩沖液作l:3000稀釋)，37。C搖床孵育1小時(shí)。用PBST于搖床洗膜洗滌3次，每次洗滌10分鐘。吸凈洗滌液后。采用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR，美國(guó))拍攝照片。Western-blotting分析結(jié)果證實(shí)HA蛋白能夠獲得有效表達(dá)，并具有天然蛋白的生物學(xué)活性(圖5D)。實(shí)施例2rAd-H5HA-EGFP的增殖與純化HEK293細(xì)胞長(zhǎng)至80%_90%飽和時(shí)，以感染復(fù)數(shù)m.o.i=510接種重組病毒rAd-H5HA-EGFP。3_4天后，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到7090%時(shí)，收集細(xì)胞液于離心管中，以3500g離心15分鐘收獲細(xì)胞，轉(zhuǎn)移上清至一無(wú)菌燒杯中保存?zhèn)溆?，并?0ml上清重懸細(xì)胞沉淀經(jīng)過(guò)-80°C/25°C(水浴的最高水溫不得超過(guò)25°C)凍融水浴破碎細(xì)胞沉淀3次，再次3500g離心15分鐘去除細(xì)胞碎片，分離上清并將其與所保留的上清混合，重組病毒的純化過(guò)程按SartoriusAG公司腺病毒純化試劑盒AdenoPACK100RT說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將所得的重組病毒小量分裝并凍存于-8(TC。實(shí)施例3rAd-H5HA-EGFP感染性滴度的測(cè)定(TCID5。)取用培養(yǎng)基(Dulbecco'sModifiedEagleMedia,簡(jiǎn)稱(chēng)DMEM)+10%FBS(胎牛血清)預(yù)培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞的1個(gè)T75細(xì)胞瓶，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%，收集細(xì)胞并用胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。用5%FBS的DMEM制備細(xì)胞懸液，每板需要llmL濃度為1X105/mL的細(xì)胞懸液。按每孔100iiL(即約lXl(^個(gè)細(xì)胞)加入一塊96孔板(如果加做一組重復(fù)試驗(yàn)，另加一塊96孔板)。無(wú)菌操作進(jìn)行腺病毒樣品稀釋取10L高濃度重組腺病毒液連續(xù)10倍倍比稀釋?zhuān)♂屢河?%FBS的DMEM。另做一組重復(fù)試驗(yàn)，再按上述步驟進(jìn)行第2組稀釋。檢測(cè)過(guò)程采用北京本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的快速腺病毒感染性滴度(TCID5。)檢測(cè)試劑盒，操作及檢測(cè)結(jié)果的計(jì)算按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。檢測(cè)結(jié)果表明經(jīng)純化及濃縮后的病毒效價(jià)(TCID5。)為2.26X1010/mL。實(shí)施例4BALB/c小鼠免疫效力實(shí)驗(yàn)將6周齡的雌性BALB/c小鼠(n=100)(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)飼養(yǎng)于潔凈負(fù)壓隔離器內(nèi)，飼養(yǎng)觀察1周后用于動(dòng)物試驗(yàn)，攻毒實(shí)驗(yàn)在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。以純化的重組病毒采用肌肉注射途徑進(jìn)行免疫接種，單次免疫方案僅在第0天一次接種重組病毒，而初次/加強(qiáng)免疫方案分別在第0，21天進(jìn)行免疫接種。實(shí)驗(yàn)組接種小鼠與對(duì)照組小鼠均在接種后42天后(具體免疫與攻毒方案見(jiàn)表1)，以106EID5。(半數(shù)雞胚感染量)劑量的同源病毒SW/FJ/1/01(購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感實(shí)驗(yàn)室)和異源病毒Ck/HuN/77/05(購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感實(shí)驗(yàn)室)通過(guò)滴鼻感染途徑進(jìn)行攻擊，在14天的觀察期內(nèi)，每天監(jiān)測(cè)小鼠的體重變化(見(jiàn)圖7A及圖7B)，同時(shí)在攻毒后的第4天及第6天分別剖殺各試驗(yàn)組的3只小鼠，采集腦、脾、肺、腎進(jìn)行病毒含量滴定，結(jié)果見(jiàn)表2，異源病毒攻擊后各組小鼠的存活率見(jiàn)圖8，同源病毒攻擊后免疫組和對(duì)照組均未出現(xiàn)小鼠死亡。表lrAd-H5HA-EGFP小鼠免疫與攻毒方案免疫原免疫日期及劑量攻毒日期及劑量組別小鼠只數(shù)攻毒毒株Od,108TCID5。;21d,42d,106EID50Gl14SW/FJ/1/012xl08TCID50G214CK/HuN/77/05rAd-H5HA-EGFP0d，107TCID50;21d，42d,106EID50G314SW/FJ/1/012xl07TCID50G414CK/HuN/77/05rAd5-EGFPOd,108TCID5。;21d,42d,106EID50G511SW/FJ/1/012xl08TCID50G611CK/HuN/77/05PBS0d,50nL;21d,50pL42d,106EID50G711SW/FJ/1/01G811CK/HuN/77/059<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>SEQUENCELISTING〈110〉中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所〈120〉一種重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體H5N1亞型流感基因工程疫苗〈130>IB087246(趙-醫(yī)K睞規(guī)奴媒嫩堪^裕l&彬s)〈160>2〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>1779〈212>DNA〈213〉腺病毒〈400〉1ggggttc朋tttgccaaaatggag皿皿tegtgcttcttcttgcaategt60cagtcttgtt3朋ggtgatcagatttgcactgtteccat■Cg3C3g3gC3120ggttg3C3C33teatgg朋3ag皿cgttectgttecacatgccc皿gac3tectgg皿皿180g3C3C3C朋Cggg朋gctctgcgatctegatggagtg皿gccccteattttgag卿ttg240tegtgtegctggatggctcctcggaaaccc皿tgtgtgacg皿ttcatc3atgteccgga300atggtcttec3tegtgg卿aggccagtcc3gCC朋tg3Cctctgttecc360caacgactatg朋g朋ctgaaacacctettg3gcag皿teaaccattttg420gatcatccccaaaagttcttggtccaatcatgaagcctcatc郷ggtgagctcagcatg■tccataccaggggaggtcctcctttttcagg皿tgtggtetggcttetca540tgcatacccaggagctec皿c皿g皿gatcttttggtect600gtgggggElttcaccatccte3tg3tgCggCaagctctetcaaaacccaac660cacctetatttccgttggaacatcaacactttggteccaaa皿tegctec720tegatcc朋3gteaacgggc朋agtgg皿g皿tggagttcttctggacaattttaaagcc780g朋tgatgctatcaacttcg卿gt皿tgggctccagaat3tgcatec皿840朋ttgtc朋g朋3gggg3Ctcagcaattetttgg皿tetggteactgc朋■caccaagtgttgggggcgataaactctegtatgccattcc960ccctctcacc3tCgggg皿tgccccaaate皿cagattegtccttgcgac1020agggctcagaaategccctc朋3g3gagat皿g皿g皿皿皿g3gaggactetttggagc1080tetegcaggctttetegaggg郷atggraggg皿tggtegatggttggt1140ccategcaatgagc郷ggagtggatecgcgaatccactc1200卿tggElgtCtcaactcgatatgaacactc皿tttgaggc1260cgttggaagggag皿tegag3g皿gatgga1320ggacggattcctegatgtctggactteteatgctgaaattctggttctca1380gag朋ctctegactttcatgactcaaatgtcaagaacctttecgac朋ggtccgactaca1440gcttegggat朋tgc朋agg賜ctgggt皿cggttgtttcgagttctetc1500t朋tg朋tgtatgg咖gtgteaga朋cgg皿cgtetgactecccgcagt1560agc朋gacte朋C3g3g3gg朋ateagtgggaacttecca1620aatectgtcaragtggcgagttccctegcactggcaatcatggtegctgg1680tctetctttetggatgtgctccaatggatcgttacaatgcttteaatttg1740t朋gttC3g3aaacacccttgtttctect1779〈210>2〈211>69780096]〈212〉DNA0097]〈213〉A(chǔ)rtificial0098]〈400〉20099]ttcatcaateateteccttettttggattg0100]tgtgacgtggcgcggggcgtggg雄gggg0101]atgttgc皿gtgtggcgg皿0102]tgtgcgccggtgtecac3gg0103]3皿tttgggCgteaccgagt皿gatttggc0104]gtga皿tctgtgttectcat0105]actttgaccgtttecgtggagactcgccca0106]gggtc腿gttggcgttttettettetegt0107]actttccaatgggttttgccC3gtecate30108]ccattggagccaagtecactgagtc皿teg0109]gggggtgagtcaatgggttt0110]teggggtgagtcattgggtttttccagcca0111]attgacgtcaatgggctettg皿acteatg0112]3gctgatteatggg咖gteccgttctcga0113]C3gCC皿皿Cgteacaccgccccggttttc0114]3ttggCtg3gctgcgttctecgtgggtete0115]gtcttcggtctgaccaccgt3g皿CgC3g30116]cagatctcgagctcaagcttcgaattctgc0117]tgcaategtcagccttgtte0118]g3C3g3gC3g0119]3C3C3C皿Cggga皿ctctg0120]g郷gattgt賜tgtegctggatggctcct0121]tgtgccgg皿tggtcttecategtgg卿a0122]朋cgactetg0123]atcttccccaaaagttcttg0124]ctcagcatgtccateccaggggaggtcctc0125]gcatecccaac皿teg3gag0126]tttggtectgtgggggattcaccatcctea0127]acctetatttccgttggaac0128]aategctactte皿cgggca0129]ttteaagccg朋tgatgctetcaacttcga0130]0131]teactgcaacaccaaatgtc0132]cctctcaccatcgggg皿tg0133]ccttgcgacagggctcag皿ategccctca0134]atttggagctategcaggctttet卿ggggggtggagtt60cgggtgacgtagtegtgtggcgg皿gtgtg120Cg3Cgg3tgtggc皿皿gtgacgtttttgg180tttcgcgcggtttteggcggatgttgtegt240cattttcgcggg皿皿ctga3teagagg皿300agcgcgteatatttgtctegggccgcgggg360ggtgtttttctcaggtgttttccgcgttcc420C3gatcteg3gatetectgagtratteggg■ggt咖teggggtg皿tc皿C3gg皿3gtC540ggactttccattgggttttgcccagtecaa600ttcccattettggcacgtecateaggtc皿660acgccatgtectttcccacc720caacgtgaccttteaacggtactttcccat780gccaatecacgtc朋tgggaagtg腿ggg840ccctggaaattccatettggcactcattct■卿ggcgcgaccagcgtcggteccgtcgca960tcgaattcaagctgctegcgcteccggact1020gag朋皿tegtgcttcttct1080gatttgcattggttaccatg1140gaacgttectgttacacatgcccaagacat1200cgatctegatggagtg皿gcctctaatttt1260Cgg3朋tCC33tgtgtg3tg1320ggccagtccagccaatgacctctgtteccc1380acacctettg3gc3g皿teaaccattttga1440gtccaatcatgaagcctcatc郷ggtgag1500ctttttcagg皿tgtggtetggcttetcaa1560gagctec皿t1620tgatgcggrag3gC3g3C皿agctctetca1680tggtecca朋1740皿gtgg皿gaatggagttcttctggacaat1800gagt朋tggaaatttcattgctccagaata1860atcaattetgtgg朋tetgg1920gggggcgateaactctegtetgccattcca1980ccccaagtet3cagattegt2040皿g3gagate2100gg皿tggtegatggttggte2160tgggtaccaccategc皿tg賜C郷gg3gtggatacgctgC3g3C皿3gaatccactca2220a朋ggc朋tecaactcgatctgaacactca2280gtttgaggccgttgg朋gggcttega皿gg3g皿tegag32340gaagatggaggacggattcctagatgtttggacttateatgctgaactcctggttctcat2400gg朋朋tgagag皿ctctegactttcatgactcaaatgtcaagaaccttt3Cg3C皿ggt2460ccgactecagcttegggategctgggt雄ggttgtttcgagttctetca2520c朋atgtgattgg腿gtgt皿ga朋cggaacgtatgactacccgcagta2580ttcag朋g朋gc皿gactea皿teagtggagte朋attgg2640atectgtcaatttettcaacagtggcgagttccctegcgctggcaatcat2700ggtegctggtctetctttetggatgtgctcc皿tggatcgttecaatgcagaatttgcat2760ttaacccgggatccgcccctctccctccccccccccteacgttectggccgaagccgctt2820gg皿teaggccggtgtgcgtttgtctatetgttettttccaccatettgccgtcttttgg2880c朋tgtg郷gcccgga皿cctggccctgtcttcttgacgagcattccteggggtctttc2940ccctctcgccaaggtctgttg皿tgtcgtgttcctctgga3000agcttcttgacgtctgtegcgaccctttgc郷ragcgga3CCCCCC3CC3060tggcg織ggtgcctctgcggcc皿朋gccacgtgteteagatecacctgca皿ggcggc31203C皿CCCC3gtgccacgttgtgagttggatagttgtgg皿ggctctcctc3180aagcgtettc朋c皿ggggctg皿ggatgcccag朋ggteccccattgtetgggatctga3240tctggggcctcggtgcacatgctttecatgtgtttagtcg皿cgtctegg3300ccccccg皿cracggggacgtggttttcctcgatgateat3tggCC3C皿3360cratggtgagc皿gggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctgg3420acggcgacgt朋3CggCC3C朋gttcagcgtgtccggcgagggcg郷gcgatgccacct3480acggc皿gctgaccctg皿gttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggccca3540ccctcgtgac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