專利名稱：竹蓀三螺旋多糖的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物高分子學和藥物化學領(lǐng)域，特別是涉及一種竹蓀二螺旋多糖在抗腫瘤 的藥物或者保健品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來的研究發(fā)現(xiàn)，竹蓀含有多種氨基酸、維生素、多糖和多種無機鹽等。除其營養(yǎng) 價值外，同時還具有一定的防病保健作用。多糖是竹蓀子實體中重要組成成分之一，多糖 生理活性和功能已有許多報道，竹蓀所具有的多種生物活性是否與其所含有多糖有關(guān)尚未 見報道。曾有人報道采用熱水萃取、有機溶劑沉淀和凝膠層析等方法，從竹蓀子實體中分 離得到竹蓀多糖，并利用薄板層析方法，確定了該多糖的單糖組成，為進一步研究竹蓀多 糖的化學結(jié)構(gòu)和生物活性提供依據(jù)。
自從60年代Chihara從香蔬實體中提取香燕多糖并發(fā)現(xiàn)其有抗腫瘤活性，多糖的研 究就受到了極大的關(guān)注和重視。80年代研究表明，真菌多糖是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它能夠 增強巨噬細胞和白細胞的吞噬功能，誘導產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞素，從而提 高人體的免疫機能，對多種危害人類健康的疾病如免疫紊亂、癌癥、糖尿病、高血壓、肝 炎、肺炎等都具有一定的療效，而且對細胞沒有毒副作用。
竹蓀屬于真菌，是我國的天然特產(chǎn)資源，長期用于食用，現(xiàn)在公開發(fā)表和研究的大多 集中在如何進行食用方面的開發(fā)，這種做法是造成對竹蓀資源極大的浪費，在藥用方面的 應(yīng)用更少見T報道。
發(fā)明內(nèi)容
木發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種竹蓀三螺旋多糖在抗腫瘤、提高免疫機能藥 用方面的應(yīng)用，以便更好地利用竹蓀這種天然資源。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用以下的技術(shù)方案竹蓀三螺旋多糖在抗腫瘤或提高免疫機 能藥用方面的應(yīng)用，所述竹蓀三螺旋多糖從天然竹蓀中提取而獲得，分子量為30 100萬， 具有三股螺旋有序結(jié)構(gòu)，竹蓀三螺旋多糖的單糖組成為葡萄糖，竹蓀三螺旋多糖的主鏈為
0- (1—3)連接，支鏈為0- (1 — 6)連接結(jié)構(gòu)，支化度為10 20% 。
木發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比主要有以下的優(yōu)點從竹蓀中提取分離得到的竹稱三螺旋多 糖，經(jīng)實驗分析，結(jié)果表明具有特殊的分子結(jié)構(gòu)在水溶液中呈現(xiàn)三股螺旋構(gòu)象，此獨特 的分子結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出的強的生物活性，主要在于抗腫瘤或者是提高免疫機能方面，竹蓀三螺
旋多糖對腫瘤細胞有明顯的抑制作用，體外測試抑制S-180腫瘤細胞的抑制率最高達38%， 與化學藥物5-FU的活性相比較，處在同一個數(shù)量級，與現(xiàn)在常用藥物香菇多糖進行比較， 其治療效果相當，具有相當廣泛的應(yīng)用前景。所用方法簡單，成本低廉，制備的竹蓀三螺 旋多糖可用于提高免疫機能和抗腫瘤的藥物或保健品的開發(fā)。
圖1為ZS-3、 ZS-4降解后單糖組成分析氣相圖譜。 圖2為ZS-3、 ZS-4進行FT工R測試圖譜。 圖3為三螺旋竹蓀多糖的結(jié)構(gòu)模型示意圖。 圖4為ZS-3、 ZS-4的13CNMR圖譜。 圖5為ZS-3、 ZS-4原子力顯微鏡的結(jié)果圖。
具體實施例方式
本發(fā)明提供的竹蓀二螺旋多糖，其用于抗腫瘤或提高免疫機能。所述竹蓀三螺旋多糖 從天然竹蓀中提取而獲得，分子量為30 100萬，具有三股螺旋有序結(jié)構(gòu)，竹蓀二螺旋多
糖的單糖組成為葡萄糖，竹蓀三螺旋多糖的主鏈為e- (1—3)連接，支鏈為e- (1—6)
連接結(jié)構(gòu)，支化度為10 20% 。
所述的三螺旋竹蓀多糖，其衍生物及具有支鏈的多糖用于抗腫瘤或提高免疫機能。 所述的三螺旋竹蓀多糖及其衍生物和支鏈的多糖，其采用以下方法從天然竹蓀中提 取先將粉碎后過60目篩的天然竹蓀用乙醇乙酸乙酯在索氏提取器中脫脂，然后在20 S(TC下水提2-6小時，過濾得濾液，重復進行三次，離心得提取液；該提取液經(jīng)Sevage 法脫蛋白和用51202氧化法脫色后，分別用清水和二次蒸餾水透析，并經(jīng)DEAE柱除去酸 性多糖后，再經(jīng)濃縮和冷凍干燥即可。
所述的三螺旋竹蓀多糖，其結(jié)構(gòu)如圖3所示具有三股螺旋有序結(jié)構(gòu)，其單糖組成 為葡萄糖，其主鏈為0-(l — 3)連接，支鏈為(1 —6)連接結(jié)構(gòu)，支化度為10 20% 。 該多糖的分子量為30 100萬，其在水溶液中粘度為540 1550cm3/g,流體力學半徑為 70 150nm。圖3中，n為多糖的結(jié)構(gòu)重復單元8000-12000。
所述的有機溶劑為乙醇、乙酸乙酯和丙酮，它們濃度規(guī)格均是分析純。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例l:三螺旋竹蓀多糖在抗腫瘤藥用方面的應(yīng)用 體內(nèi)抗腫瘤實驗
實驗小鼠為BALB/C清潔級(SPF)， 6周齡，體重18-22克，雌雄兼用，由華中科技大 學同濟醫(yī)學院動物中心提供。腫瘤瘤株為S-180腹水瘤細胞。選取正常BALB/C清潔級小 鼠50只，體重18-22克，雌雄兼用。無菌條件下抽取S180腹腔荷瘤小鼠的腹水，用無菌 的生理鹽水稀釋至l: 20濃度的腫瘤細胞液(106 cell/tnL )，無菌條件下在小鼠右前肢腋 皮下接種制備移植瘤模型(每只0. 1 mL ) 。 24 h后小鼠隨機分為5組，每組10只。瘤塊 形成后，水溶性試樣溶于生理鹽水，每種試樣的劑量為每kg小鼠體重注射60 mg試樣， 陽性實驗用5-氟脲嘧啶(5-Fu ) 60 nig'kg—、陰性對照組注射等容積的生理鹽水。小鼠 每天注射給藥l次，連續(xù)10天，停藥24h后將小鼠稱重，脫頸處死，解剖剝離瘤塊，并 用電子分析天平稱瘤重。將試驗組瘤塊的體積和重量與對照組比較，觀察多糖試樣對腫瘤 生長的抑制作用。由式-1和式-2計算腫瘤抑制率l (%)和體重變化率f (%)。*100% (式-1)
/ =[(Wb-Wa)/ Wa] * 100% (式-2)
式中Wt和Wc分別為注射和未注射多糖溶液的小鼠組腫瘤的平均重量，Wa和Wb分別 為注射多糖溶液前后的小鼠組平均體重。
抗腫瘤活性體內(nèi)、體外實驗結(jié)果采用t-test ( Student's t-test )方法統(tǒng)計分析。 P值小于0. 05時認為試樣組與對照組存在顯著差異。
下面提供從天然竹蓀中提取而獲得竹蓀三螺旋多糖及其衍生物和支鏈的多糖的兩個 實施例(實施例2和實施例3)。
實施例2:將竹蓀實體在組織粉碎機中粉碎，依次用乙醇、乙酸乙酯和丙酮在索氏提
取器中脫脂，然后分別在2crc、 4crc、 so'c、 so'c下水提三小時，得四種多糖溶液，分
別加以處理如下，離心得提取液。用Sevage法脫蛋白后，HA氧化法脫色，分別用清水和 二次蒸餾水透析，濃縮，用乙醇分級沉淀，冷凍干燥得到三螺旋竹蓀多糖ZS-1、 ZS-2、 ZS-3和ZS-4。凍干得到多糖純品。
實施例3:將竹蓀實體在組織粉碎機中粉碎，依次用乙醇、乙酸乙酯和丙酮在索氏提 取器中脫脂，然后分別在20'C、 40°C、 60。C、 8(TC下水提三小時，得四種多糖溶液，分 別加以處理如下，離心得提取液。用Sevage法脫蛋白后，&02氧化法脫色，分別用清水和 二次蒸餾水透析，濃縮，經(jīng)超濾后，冷凍干燥得到三螺旋竹蓀多糖ZS-1、 ZS-2、 ZS-3和 ZS-4。凍干得到多糖純品。
上述實施例2和實施例3所得到的ZS-1、 ZS-2、 ZS-3和ZS-4四種多糖，其產(chǎn)率分別 為0.444%、 0.364%、 0.243%、 0.388%。
本發(fā)明對得到的四種產(chǎn)物分別用GC測得其單糖組成，發(fā)現(xiàn)ZS-1、 ZS-2為雜多糖，而 ZS-3、 ZS-4為單一葡萄糖組成。重點對ZS-3， ZS-4多糖進行分析，用FTIR及麗R的方
法確定了 zs-3、 zs-4多糖的結(jié)構(gòu)為主鏈為e- (1—3)，支鏈為e- (l—6)連接的葡聚
糖。用光散射的方法測得ZS-3和ZS-4多糖重均分子量分別為60萬，80萬，ZS-3和ZS-4 兩種多糖在化學組成上是一樣的，只是在分子量大小不同。流體力學半徑為70-150 nm。 測得ZS-1、 ZS-2、 ZS-3和ZS-4四種糖的黏度為540 1550cm3g—1 (見表1)，并且ZS-3 和ZS-4多糖有粘度高達1500 cm3g—'以上，是具有很強的剛性多糖。并且用剛果紅實驗、 AFM實驗的結(jié)果證實，該多糖為三螺旋多糖。
下面是對得到的四種產(chǎn)物進行檢測的實施例。
實施例3:測各糖的單糖組成
用2M的硫酸對多糖進行水解封，封管IOO'C下反應(yīng)六小吋，水解液用碳酸鋇中和多 余的酸，離心得到上清液，冷凍干燥，用糖腈乙酸酯衍生物方法對樣品進行處理后用氣相 測定單糖組成。
5衍生化方法取10mg固體糖樣、10mg鹽酸羥胺和7nig內(nèi)標，加入0. 5ml吡啶放入90 'C水浴中加熱反反應(yīng)30分鐘，取出后冷室溫，加入醋酸酐O. 5ml，在90。C下繼續(xù)反應(yīng)30 分鐘進行乙酰化，反應(yīng)產(chǎn)生直接進行氣相色譜分析。氣相色謗儀的型號為Agilent (安杰 倫)GC6890N。操作條件如下
氣流速度N2為20ml/min， ^為30ml/min' 02為50ml/min。
溫度進樣口 25(TC，檢測器28(TC， HP-5柱溫度采用程序升溫，起始溫度14(TC， 停留3分鐘，7'C每分鐘升至240'C，保留10分鐘。
經(jīng)檢測，ZS-3和ZS-4均為單一葡萄糖組成，并純度較高。參見圖l。 實施例4:測各種多糖的粘度
利用烏氏黏度計在25'C下進行粘度測定。用做圖法得到多糖的特性粘度。在水溶液 中得到的結(jié)果，請見表l。 實施例5:光散射測試
對ZS-3和ZS-4多糖樣品在溶液中的散射光強用多角度激光散射儀測量。激光光源為 He-Ne激光，波長633nm,通過計算得到ZS-3和ZS-4分子量分別為80萬和60萬，流體力 學半徑分別為150 nm和70 nm 。
實施例6: FTIR分析
對ZS-3和ZS-4進行FTIR分析，用KBr壓片法在5000-500cm—1范圍內(nèi)用紅外測定其 多糖的構(gòu)型，確定該糖是a型還是e型。通過實驗數(shù)據(jù)，紅外光譜有3500-3300cm—1 (糖 環(huán)上OH的O-H伸縮振動)；2920-2800"(糖環(huán)上C-H變角振動)；1100-100(T1 (糖環(huán)上
c-o伸縮振動)；890" (e構(gòu)型的異頭碳特征吸收)，等四個特征吸收峰，確定樣品為為e
構(gòu)型糖鏈(圖2)。
實施例7: NMR測試分析
用D20作溶劑，探針溫度為60°C,樣品濃度為10tng/ml，13C核磁共振光譜具 103.836ppm(e - (1 — 3)葡聚糖的C-l信號)；87.054ppm(C-3信號)；76.836ppm(C-5信 號);75.359ppm(C-2信號)；68,738ppm(C-4信號)；61.300(C-6信號)，可推出ZS-3， ZS-4 糖的主鏈結(jié)構(gòu)為P- (1 — 3)葡聚糖連接，具有支鏈為P- (1 — 6)連接結(jié)構(gòu)。"C醒R圖譜 見圖4。
通過以上實施例3、實施例6和實施例7，得到竹蓀多糖的結(jié)構(gòu)式見圖3，其中支化 度大約在10%-20°/。。
實施例8:剛果紅實驗
剛果紅與具有螺旋構(gòu)象的多糖可形成絡(luò)合物，此絡(luò)合物的最大吸收波長較多糖紅移向 長波，由此可基本推測多糖分子內(nèi)有螺旋結(jié)構(gòu)。產(chǎn)品經(jīng)剛果紅反應(yīng)，然后紫外測定，發(fā)現(xiàn) 在480-495nm處呈最大吸收峰。中和后再測紫外，其最大吸收收位移移至505-520nm，該 反應(yīng)紫外吸收的兩個范圍為e- (1 — 3)葡聚糖所特有，最大吸收波長明顯發(fā)生紅移，證 明該分子內(nèi)存在三螺旋結(jié)構(gòu)。實施例9:原子力顯微鏡測試
將溶液涂在云母片上進行測試，比結(jié)果可以看到，分子呈現(xiàn)直鏈形態(tài)(圖5)。表現(xiàn) 為較強的剛性。 附表
表l 各種多糖在水溶液中的粘度
糖樣品粘度(cm3g-')
ZS-1540
ZS-2600
ZS-31550
ZS-41500
表2 抗腫瘤活性的測試結(jié)果
樣品分子量 (105)齊'J量(mg/kg* 天)抑制率(％)體重增長率 (%)完全抑制 率
5-Fu60*850.512. 50/10
三螺旋香菇多糖5.060*839.331. 20/10
三螺旋竹蓀多糖6.260*838.436. 40/10
解螺旋竹蓀多糖2.160*811.732. 50/10
權(quán)利要求
1. 一種竹蓀三螺旋多糖的應(yīng)用，其特征是竹蓀三螺旋多糖在抗腫瘤或提高免疫機能藥用方面的應(yīng)用，所述竹蓀三螺旋多糖從天然竹蓀中提取而獲得，分子量為30～100萬，具有三股螺旋有序結(jié)構(gòu)，竹蓀三螺旋多糖的單糖組成為葡萄糖，竹蓀三螺旋多糖的主鏈為β-(1→3)連接，支鏈為β-(1→6)連接結(jié)構(gòu)，支化度為10～20％。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三螺旋竹蓀多糖的應(yīng)用，其特征是三螺旋竹蓀多糖的衍生物及具有支鏈的多糖在抗腫瘤藥用保健方面的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的三螺旋竹蓀多糖的應(yīng)用，其特征是采用以下方法從天然竹蓀中提取而獲得竹蓀三螺旋多糖及其衍生物和枝鏈的多糖先將粉碎后的天然竹蓀用乙醇乙酸乙酯在索氏提取器中脫脂，然后在20 80'C下水提，過濾得濾液，重復進行三 次，離心得提取液；該提取液經(jīng)Sevage法脫蛋白和用11202氧化法脫色后，分別用清水和 二次蒸餾水透析，并經(jīng)DEAE柱除去酸性多糖后，再經(jīng)濃縮和冷凍干燥，得到所述三螺旋 竹蓀多糖及其衍生物和枝鏈的多糖。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的三螺旋竹蓀多糖的應(yīng)用，其特征是三螺旋竹蓀多糖在水 溶液中粘度為540 1550cm3/g，流體力學半徑為70 150nm。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三螺旋竹蓀多糖的提取方法，其特征是索氏提取器中脫 脂所用的有機溶劑為乙醇、乙酸乙酯和丙酮，它們濃度規(guī)格均是分析純。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的三螺旋竹蓀多糖的應(yīng)用，其特征是在20 80。C梯度溫度 進行水提，該過程中所用的溫度依次為2(TC、 4(TC、 60°C、 80°C 。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的三螺旋竹蓀多糖的應(yīng)用，其特征是水提的時間為2-6小時。
全文摘要
本發(fā)明提供的竹蓀三螺旋多糖，其在抗腫瘤或提高免疫機能藥用方面的應(yīng)用，該竹蓀三螺旋多糖從天然竹蓀中提取而獲得，分子量為30～100萬，具有三股螺旋有序結(jié)構(gòu)，竹蓀三螺旋多糖的單糖組成為葡萄糖，竹蓀三螺旋多糖的主鏈為β-(1→3)連接，支鏈為β-(1→6)連接結(jié)構(gòu)，支化度為10～20％。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并驗證了竹蓀多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)，并且通過對抗S-180腫瘤細胞對腫瘤細胞的體外實驗結(jié)果分析，竹蓀三螺旋多糖對S-180腫瘤細胞有明顯的抑制作用，與目前臨床常用藥物香菇多糖的腫瘤抑制作用相當，在醫(yī)藥及材料方面有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P35/00GK101502532SQ200810197139
公開日2009年8月12日 申請日期2008年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日
發(fā)明者王家堂, 化 鄭, 陳敬華 申請人:武漢理工大學