專利名稱：含有轉(zhuǎn)化生長因子α的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是一種能夠引起對抗自 身TGFa的免疫去勢反應(yīng)的疫苗制劑。該疫苗可以用于某些癌癥和其 它TGFa相關(guān)疾病的治療。
現(xiàn)有技術(shù)
轉(zhuǎn)化生長因子(TGFa)是一種50個氨基酸的多肽，最初分離自 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化細胞的條件培養(yǎng)基。開始它被認為是一種能夠與表皮 生長因子(EGF)竟爭結(jié)合EGF-R的分子。然而，抗EGF抗體不能 識別TGFa ( Todaro等(1976)， Nature 264， 26-31 )。所以，這兩種生 長因子是兩種免疫學(xué)不同的實體。
TGFa屬于EGF家族。結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的蛋白組成了這個家族。 該家族的其他成員有EGF、雙調(diào)蛋白(AR)、 criptol ( CR1 )、肝素結(jié) 合EGF、 P動物纖維素、表皮調(diào)節(jié)素。另一方面痘病毒科包括了 EGF 相關(guān)蛋白。其中最具代表性的是牛痘病毒生長因子(VGF)。
所有這些分子結(jié)合并活化EGF-R，那就是為什么它們被視為這一 受體的配體。這個系統(tǒng)在正常和腫瘤細胞的生長中發(fā)揮作用。EGF-R 是一種170kD的糖蛋白，其基因已經(jīng)被克隆并測序。該受體的胞內(nèi)域 伴有酪氨酸激酶蛋白活性。這些蛋白與v-erb-B癌基因產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu) 同源性，這成為其與肺瘤轉(zhuǎn)化過程關(guān)聯(lián)的證據(jù)(Heldin C.H. (1984), Cell 37, 9-20.)
TGFa合成為160個氨基酸的跨膜前體形式(前TGFa)。成熟 TGFa， 50個氨基酸的可溶形式，是通過蛋白水解斷裂釋放的。人TGFa (hTGFa)顯示出與人EGF( hEGF)具有43%的氨基酸序列同 一性， 與小鼠或大鼠TGFa有93%同一性。此外，它們的生物學(xué)效應(yīng)不具有 種特異性。許多實驗室的工作已證實了 TGFa調(diào)節(jié)培養(yǎng)細胞增殖、遷移和分 化的能力(Carpenter和Wahl. (1990)， Springer-Verlag ,柏林，69-171頁)。
TGFa是最廣泛存在的EGF-R配體。它在胚胎發(fā)生時的正常組織 和成年人的正常及腫瘤組織中表達。然而，在敲除TGFa的小鼠中并 未觀察到大的病理缺陷，并且這些小鼠可以生存并繁衍(Bruce Mann 和同事(1993)， Cell, 73， 249-261 )。
在胂瘤發(fā)生過程中，EGF-R活化的旁分泌和自分泌過程的失調(diào)節(jié) 是由生長因子表達的上調(diào)或其受體高合成或突變造成的。
在上皮性腫瘤中測到了高水平的EGF-R。在許多情況下，該受體 的過度表達預(yù)示著不良預(yù)后。
TGFa的誘導(dǎo)常見于腫瘤轉(zhuǎn)化。事實上，許許多多的研究表明不 同部位的上皮性胂瘤中該分子有過度表達，包括乳腺、肺、腦、肝、 前列腺、膀胱、胃腸道、結(jié)腸、生殖(卵巢)和內(nèi)分泌組織等。
盡管TGFa誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的機制尚未明確，已有一些報道將該生 長因子的過度表達與肺瘤的分級、患者的生存和其它胂瘤標記物聯(lián)系 起來。此外， 一些研究人員已經(jīng)證實了它們與其它癌基因的關(guān)系，如 肝癌中的c-myc。 TGFa也是von Hippel-Lindau腫瘤抑制基因(VHL ) 的標耙(總結(jié)在Lee等，(1996), Growth Factors and Cytokines in Health and Disease,巻IB, 277-318)。
盡管TGFa和EGF以相似的親和力與同 一受體結(jié)合，TGFa通 常比EGF效力更強，并且在一些情況下，據(jù)述它的效應(yīng)更強和/或更 持久(Barrandon和Green ( 1987)， Cell, 50, 1131誦1137)'據(jù)報道 對于內(nèi)化的TGFa/EGF-R復(fù)合物，TGFa和EGF-R優(yōu)先重新循環(huán)回 到細胞表面，而當EGF/EGF-R復(fù)合物內(nèi)化至同一類型細胞中時，兩 種成分都被有效降解(Ebner和Derynck ( 1991 ), Cell Regul. 2， 599-612)。這些結(jié)果表明每種生長因子生物活性的差異可能是由于細 胞內(nèi)運輸機制不同造成的。
另一方面，TGFa是一種比EGF更強的血管生成因子(Schreiber等，(1986), Science 232， 1250-1253 )。
至于在胂瘤中的表達，有證據(jù)表明某些上皮性腫瘤的細胞膜中存 在EGF前體，但TGFa在上皮性腫瘤中有著最多的表達，并且與EGF 相反，它是通過與EGF-R的自分泌環(huán)起作用的。另一方面，我們中心 的結(jié)果顯示在某些上皮性肺瘤的活檢組織中有TGFa表達而沒有EGF (乳腺異管癌、喉癌)，但其它腫瘤呈現(xiàn)的EGF多于TGFa (非小細 胞肺癌(NSCLC))。這些結(jié)果表明生長因子在不同腫瘤細胞的腫瘤生
物學(xué)中具有不同的影響。
這些年所累積的關(guān)于EGF-R/EGF-R配體系統(tǒng)和癌癥之間關(guān)系的 所有證據(jù)，使該系統(tǒng)成為癌癥免疫治療中極富吸引力的目標。
我們小組先前的結(jié)果證實了可發(fā)展一種基于EGF的疫苗用于癌 癥主動免疫治療。事實上，已經(jīng)獲得了有關(guān)用偶聯(lián)至載體蛋白的hEGF 進行疫苗接種所產(chǎn)生的免疫原性和低毒性的臨床前期和臨床證據(jù) (Gonzdlez等 (1996 )， Vaccine Research 5 ( 4), 233-243 )。
臨床前期研究顯示用在佐劑中的hEGF免疫小鼠可以增加移植了 Ehrlich腹水瘤(EAT)的小鼠的存活(Gonzalez等(1996)， Vaccine Research 5(4)， 233-243 )-
制備了 hEGF與P64K的融合蛋白。該蛋白含有在P64K的45/46 氨基酸間插入的hEGF序列。該融合蛋白被用于免疫小鼠，引起抗 hEGF的特異性體液免疫應(yīng)答。所激發(fā)的免疫應(yīng)答使負荷EAT的小鼠 壽命延長(Gonzalez和同事(1997 )， Vaccine Research 6(2)， 91-100 )。
在兩項針對NSCLC患者的臨床試驗中觀察到，與歷史對照組相 比較，接種疫苗的患者的生存有增加趨勢。具有抗hEGF高水平抗體 反應(yīng)的患者存活顯著增加(Gonz^ez等 (1998)， Annals of oncology 9, l畫5)'
通常接種EGF不會產(chǎn)生抗TGFa的特異性抗體應(yīng)答。然而已經(jīng) 獲得的證據(jù)是小鼠模型接種含TGFa的免疫原性制劑后，僅一些小鼠 產(chǎn)生了低水平的抗EGF抗體。該抗體應(yīng)答在一些情況下能夠阻斷EGF 在體外與其受體的結(jié)合。然而所獲得的抗EGF抗體的水平并不足以產(chǎn)生有效的EGF免疫去勢反應(yīng)并在抗腫瘤作用中發(fā)揮影響。
由于這些生長因子中的每一種在各肺瘤和/或原發(fā)瘤及其轉(zhuǎn)移灶
之間作用不同， 一種聯(lián)合EGF-R的兩種主要配體TGFa和EGF的疫
苗通常對上皮性腫瘤具有更好的抗腫瘤效應(yīng)。
在本發(fā)明之前，尚未有任何治療將含有hTGFa或任何衍生物，
或其與EGF-R的其它配體EGF的組合的疫苗制劑用于癌癥主動免疫治療。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，它含有TGFa或其任何來源的任 何衍生物，與載體蛋白遺傳連接(融合蛋白)或通過化學(xué)方法偶聯(lián)， 它能夠抑制上皮性腫瘤的生長而無不良副作用。這一作用是通過生長 因子免疫去勢機制實現(xiàn)的。本發(fā)明還要求保護一種含有hTGFa與 hEGF或任何衍生物的組合以及載體蛋白的疫苗組合物。
該疫苗組合物可用于治療依賴TGFa或TGFa/EGF的上皮性腫 瘤，或與TGFa相關(guān)的任何其它疾病，如銀屑病(Kapp等(1993) J Dermatol Sci， Jun; 5 ( 3): 133-42)'
在TGFa的詳細說明中，具有與原分子相同的免疫學(xué)特性和/或相 似作用的任何TGFa衍生片段都包括在內(nèi)。那些衍生物，包括但并不 排除其它氨基酸的原始置換、改變特定氨基酸以增加穩(wěn)定性和/或活 性、化學(xué)修飾等。
更為具體地說，本發(fā)明提供了一種能夠引起自身TGFa免疫去勢 反應(yīng)的疫苗組合物，它可以用于某些癌癥和其它與TGFa相關(guān)的疾病 的治療。
另一方面本發(fā)明包括了由TGFa和EGF的組合構(gòu)成的疫苗制劑腫瘤。
1- 免疫原性制劑
本發(fā)明使用的疫苗制劑所包含的hTGFa或者通過基因工程的方 法與載體蛋白偶聯(lián)(融合蛋白)，或者通過化學(xué)方法與之結(jié)合。這些免疫原性制劑的任何一種中所使用的hTGFa可以是重組的、合成的或 來自天然來源。不同的蛋白可以用作栽體?？捎米髟泽w蛋白的例子有 破傷風類毒素、KLH、來自腦膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白及其它。 疫苗制劑中hTGFa的最佳量波動在每劑5jxg至1000jag之間。
另一方面使用了含有hTGFa與hEGF的組合的疫苗制劑(國家 藥品注冊辦7^室，Office of National Registration of Medication, HEBERMIN Not 1266 )。
在TGFa或EGF的詳細說明中，具有與原分子相同的免疫學(xué)特 性和/或相似作用的任何TGFa或EGF衍生片段都包括在內(nèi)。那些衍 生物包括但并不排除其它氨基酸的原始置換、改變特定氨基酸以增 加穩(wěn)定性和/或活性、化學(xué)^^飾，及其它。
A) 通過基因工程方法獲得融合蛋白TGFa-栽體蛋白 使用特定引物通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增編碼hTGFa的
基因(500bp)。將獲得的DNA片段進行消化并在特定的位點克隆至 含有編碼載體蛋白的基因的表達載體中。獲得的蛋白含有兩種分子的 一個或多個拷貝?？梢允褂貌溉閯游锛毎⒓毦蚪湍妇鳛楸磉_載 體。該載體還可以在載體蛋白的N末端包括6個組氨酸，通過在瓊脂 糖凝膠上進行限制酶切分析、使用Sequenase2.0(Amersham-USB)進 行DNA測序，以及最后使用抗hTGFa的特異性單克隆抗體(R&D System)通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)對任意大腸桿菌表達抹表達融合蛋白進 行分析來證實所獲得的質(zhì)粒。為獲得蛋白，使用強破壞法破壞細菌細 胞壁，然后使用琉酸銨差異沉淀法和色譜法相結(jié)合純化蛋白。最后，
在無菌條件下過濾蛋白并保存于-20x:或凍干并保存于4X:直至隨后使用。
B) 獲得含hTGFa的化學(xué)結(jié)合物
獲得含有與不同載體蛋白(如P64K)結(jié)合的hTGFa的不同制劑。 可以使用任何化學(xué)結(jié)合法。優(yōu)先使用的化學(xué)法是北美專利U.S.Pat， Not. 4,302,386; Lee等，1981中所述的使用EMCS物質(zhì)的方法。
或者，可以使用戊二醛結(jié)合方法。簡而言之，將這兩或三種在最終溶液中濃度為lmg/ml的分子與0.05%戊二醛(在總?cè)芤褐?混合。 混合物于室溫下溫育1小時，然后用PBS1 x/10mMMgCl2溶液透析。 最后，在4'C用PBS1 x透析過夜。在無菌條件下過濾該免疫原性制劑 并保存于4。C直至使用。
C ) 獲得將hTGFa和hEGF相結(jié)合的疫苗。
獲得將EGF-R的兩種主要配體相結(jié)合的疫苗可以通過不同方式 進行
1- 在注射時按1:1關(guān)系混合兩種分別含有與栽體蛋白相連的 hTGFa或hEGF的疫苗。為此目的可以使用每種生長因子與栽體蛋白 的融合蛋白或化學(xué)結(jié)合物。疫苗制劑中hTGFa和hEGF的最佳量波 動在每劑5|ug至1000ng之間。
2- 根據(jù)A部分所述獲得一種相似的基因構(gòu)建體，它含有兩種生 長因子hTGFa和hEGF，或它們?nèi)魏螘鴉生物的組合。
3- 應(yīng)用B部分所述的方法通過化學(xué)方法獲得含hTGFa和hEGF 或它們?nèi)魏窝苌锏慕M合與載體蛋白的化學(xué)結(jié)合物。
D) 獲得免疫原性制劑
為獲得該疫苗組合物理想的免疫原效應(yīng)，可便利地使用合適的佐 劑并選擇給藥途徑以使疫苗制劑表現(xiàn)出高免疫原性。
本發(fā)明所述疫苗組合物是通過兩種特定方式制備的
1) 使用Al(OH)3作為佐劑以獲得水溶液，疫苗制劑吸附在該化 合物上。為此目的在不同制劑中用相當于5jxg到1000pg的TGFa結(jié) 合到2到5mg的Al(OH)3上.振蕩該制制l小時，最終的溶液置于4 匸保存直至隨后使用。
2) 使用不完全弗氏佐劑，形成水/油或油/水乳狀液。融合蛋白或 化學(xué)結(jié)合物與佐劑在最終制劑中的量在40/60到60/40 (體積/體積)的 范圍內(nèi)。所用體積取決于期望獲得的最終乳狀液。在免疫接種前加入 佐劑并將制劑于室溫下振蕩10到30分鐘。
每種免疫原性制劑的最終體積覆蓋了相應(yīng)給藥途徑的適宜范圍。 對于如C部分所述在注射時即刻制備聯(lián)合疫苗的情況，如前所述將與適宜佐劑混合的兩種疫苗通過振蕩混合并注射或者分別注射。
可以通過多種途徑施用疫苗組合物肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)和皮內(nèi)。 實施例
實施例1:通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)獲得編碼成熟TGFoc的 DNA片段。
使用PSK/TGFot載體(CIGB，古巴)作為模板通過PCR擴增編碼 hTGFa的基因。該質(zhì)粒含有克隆至商品載體pBluescript KS-(Stragene) 的EcoRV位點的hTGFa互補DNA(cDNA)。使用所述特異性引物 擴增編碼成熟TGFa (50個氨基酸長(圖l))的序列
N末端5-GCTCTAGAAGTGGTGTCCCATTTTAATGAC-3，
(下劃線，Xbal限制酶切位點)
C末端5畫CGGAATTCGCCAGGAGGTCCGCATGCTCAC畫3， (下劃線，EcoRI限制酶切位點)
簡而言之，在75pL的混合物中使用200ng的PSKTGFa，混合 物含有每種特異性引物各500ng，各200mM濃度的脫氧三磷酸核苷 酸的混合物，25mMMgCh和100單位溶于Promega提供的緩沖溶液 中的Taq-聚合酶(Promega),。執(zhí)行30個循環(huán)的變性(94°C 1分鐘)、 退火(60t: 1分鐘)和延伸(72" 30秒)。在第一個循環(huán)之前，將 DNA變性4分鐘；最后一個循環(huán)之后，再最后延伸2分鐘。
PCR產(chǎn)物在低熔點(LGT)瓊脂糖凝膠上電泳分離，并按照常規(guī) 步驟用笨酚提取來純化擴增的基因并用Xbal和EcoRI酶(NEB， USES)消化。按該方案制備的是編碼成熟TGFa的基因片段。
實施例2:獲得融合蛋白TGFot-P64K的表達載體。
使用表達載體pM 92(CIGB，古巴)。該質(zhì)粒含有編碼腦膜炎奈瑟 氏球菌(B385抹)的P64K蛋白的lpdA基因，其受大腸桿菌色氨酸 搡縱子啟動子(ptrp)和噬菌體T4轉(zhuǎn)錄終止子(tT4)的控制。pM92編碼 氨芐西林和卡那霉素抗生素耐藥性。用pM 92轉(zhuǎn)化Dam-大腸桿菌菌 抹(GC-366)并使用商品試劑盒(Quiagen)根據(jù)生產(chǎn)商的方案純化該質(zhì) 粒。消化PM92栽體并從LGT瓊脂糖凝膠純化。而后用T4連接酶(Gibeo BRL)將PM92栽體與之前制備的成熟hTGFa的cDNA相連接。 所獲質(zhì)粒pMTGFa編碼含有在P64K的45/46氨基酸間插入的 hTGFa的融合蛋白。通過瓊脂糖凝膠限制酶切分析、使用 Sequenase2.0(Amersham-USB)進行DNA測序，以及最后使用hTGFa 的特異性單克隆抗體(R&D System)通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析大腸桿 菌MM299株中融合蛋白表達，來證實該重組質(zhì)粒。圖2顯示了表達 栽體pMTGFa獲得過程的圖解。該載體編碼融合蛋白TGFa-P64K。
實施例3:獲得N末端有6個組氨酸的融合蛋白TGFa-P64K的 表達載體(pMHisTGFa)。
依照之前實施例所述的相同方案獲得表達載體pMHisTGFa，起 始栽體為pM224,它包括了一個編碼P64KN末端6個組氨酸的片段。 由于與帶有Cu^或其它金屬的螯合S印harose結(jié)合增加，該6個組氨 酸的標記在蛋白純化過程中顯現(xiàn)了優(yōu)勢。
實施例4:融合蛋白(TGFa-P64K)純化。
表達融合蛋白TGFa-P64K的大腸桿菌(MM299抹)在LBA培 養(yǎng)基(IO g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl和50mg/L氨千 西林)中于37。C生長10小時。收集細胞后，所有的步驟在0-4'C下進行。 在弗氏壓碎器中于1500 kg/cm2破裂細菌，并于11,000 xg下高速離心 30分鐘以除去不溶部分。第一步純化使用4(T/o的辟f酸銨沉淀以去除部 分大腸桿菌蛋白。在4"C11，000 xg下進一步離心30分鐘以去除得到的 沉淀。上清通過疏水作用層析法(TSK-butil， Pharmacia,瑞典)分部分 離，使用在pH=7.2、含0.15M NaCl的Tris-Cl緩沖液中從40%到0% 遞減的硫酸銨梯度。然后將所得樣品通過經(jīng)PBS 1 x平衡的G200柱 (Pharmacia)凝膠過濾而分離，使最終純度大于95%,按照Lowry等 (1951 )丄Biol. Chem. 191,495-498描述的比色法測定蛋白濃度。使用 抗P64K和TGFa的特異性抗體，通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)對融合蛋白進 行表征。
實施例5:融合蛋白(HisTGFa-P64K)純化。
表達融合蛋白TGFa-P64K的大腸桿菌(MM299株)在LBA培養(yǎng)基(IO g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl和50mg/L氨芐西 林)中于37。C生長10小時。收集細胞后，所有的步驟在0-4。C下進行。 在弗氏壓碎器中于1500 kg/cin2下破裂細菌，并于11,000 xg下高速離 心30分鐘以除去不溶部分。第一步純化^f吏用40y。的辟u酸銨沉淀以去 除部分大腸桿菌蛋白。在4°C 11,000 xg進一步離心30分鐘以去除得到 的沉淀。由于蛋白中存在6個組氨酸，上清通過螯合親和層析法 (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia,瑞典)分部分離，使用在 pH=5.5、含0. 5M NaCl的Tris-Cl緩沖液中從25mM到500mM遞增 的咪唑梯度。然后所得樣品通過經(jīng)PBS 1 x平衡的凝膠過濾G25柱 (Pharmacia)去除鹽分，達到95%純度水平。按照Lowry等(1951) J. Biol. Chem. 191,495-498描述的比色法測定蛋白濃度。使用抗P64K 和TGFa的特異性抗體，通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)對融合蛋白進行表征。
實施例6:用hTGFa特異性單克隆抗體(Mab)識別重組蛋白 TGFa-P64K。
4吏用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)確定在融合蛋白中的TGFa是否可以被抗 hTGFa Mab (Calbiochem)所識別。按傳統(tǒng)步驟將25jug的EGF-P64K、 TGFa-P64K或P64K在兩個聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到 0.45pm硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移后，將膜與含5%脫脂奶的TBS 1 x封 閉液一起于4。C溫育過夜。使用TBS 1 、Tween 20(0.05%)簡單沖洗后， 將一張膜與抗P64K抗體(1/500)(圖3A),另一張膜與抗TGFa Mab(1/100)(圖3B)—起在室溫下溫育2小時。然后用同樣的溶液洗3 次，并將膜在同樣條件下與堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白 (1/1000 ) —起溫育1小時。最后加入0.004g Fast Net酶底物(Sigma), 該底物在含O.IM Tris-Cl(pH=8.2)、 0.004g萘酚ACE-MX磷酸(Sigma) 及400pLNN，二甲基甲酰胺的20mL緩沖液中。用相似的沖洗終止反 應(yīng)。觀察到了抗hTGFa Mab對TGFa -P64K的特異性識別(圖3 )。 這一結(jié)果證明融合蛋白中的TGFa保持了能夠被特異性抗體識別的結(jié) 構(gòu)。
實施例7:獲得化學(xué)結(jié)合物hTGFa-P64K。將1毫升在PBS/10 mM MgCl2中濃度為2mg/mL的TGFa與1 毫升在同樣溶劑中濃度為2mg/mL的P64K相混合。然后加入0.2mL 0.5%的戊二醛溶液使最終百分比為0.05%?；旌衔镉谑覝販赜?小時， 然后用PBS 1 x/10 mM MgCh溶液透析。最后，于4'C用PBS 1 x透 析過夜。在無菌條件下過濾該免疫原性制劑并在4X:保存直至使用。 實施例8:獲得hTGFa、 hEGF與P64K的融合蛋白。 使用質(zhì)粒pBEF 10作為模板PCR擴增編碼hEGF ( 150bp )的基 因。該質(zhì)粒含有克隆至商品載體pBiuescript SKII(Stragene)的EcoR V 位點的完整hEGF。用實施例2所述方法將獲得的DNA連接到 pMHisTGFa質(zhì)粒位于P64K C末端的Bam HI位點。這樣就獲得了編 碼融合蛋白TE-P64K的pMTGFa-EGF載體。
實施例9:獲得化學(xué)結(jié)合物hTGFa-hEGF-P64K。 將1亳升在PBS/10 mM MgCl2中濃度為3mg/mL的TGFa與1 亳升在同樣溶劑中濃度為3mg/mL的hEGF和3mg/mL的P64K相 混合。然后加入0.6mL 0.5%的戊二醛溶液使最終百分比為0.05%。混 合物于室溫溫育1小時，然后用PBS1 x/10 mMMgCl2溶液透析。最 后，于4'C用PBS1 x透析過夜。在無菌條件下過濾該免疫原性制劑并 在4'C保存直至使用。
實施例10:制備含hTGFa的制劑。
如本發(fā)明中詳述的那樣將實施例2、 3、 7、 8和9中所述的不同免 疫原性制劑與Al(OH)3或Montanide ISA 51相混合。所有制劑中 hTGFa的用量等于50jLig ,在實施例8和9所述的聯(lián)合疫苗中，hTGFa 和hEGF的用量為50pg 。每種融合蛋白或化學(xué)結(jié)合物制劑使用2毫 克Al(OH)3,制劑分別含有50pghTGFa或hEGF的相當物。
實施例11:制備含TGFa-P64K蛋白和EGF-P64K蛋白的聯(lián)合疫苗。
在注射之前，將總體積為0.5mL在0.6mg重組體中的50pg每種 生長因子與相同體積的Montanide ISA 51混合并在室溫下振蕩10分鐘。當使用Al(OH)3作為佐劑時，注射之前將在2 mg Al(OH)3中含
0.6mg每種蛋白的兩種制劑相混合。
實施例12:制備含化學(xué)結(jié)合物TGFa/P64K和EGF/P64K的聯(lián)合疫苗。
于室溫下使用注射器將0.25mL含50pg如實施例7所述連接到 P64K的hTGFa的免疫原性制劑與0.25mL含hEGF的相應(yīng)免疫原性 制劑相混合，并如實施例10所述與0.5mL的Montanide ISA 51混合 10分鐘。
當使用Al(OH)3作為佐劑時，將吸附于2 mg Al(OH)3、分別含有 50pg hTGFa或hEGF的前述化學(xué)結(jié)合物各0.5mL相混合。
實施例13:小鼠模型中TGFa-P64K/不完全弗氏佐劑(Montanide ISA 51)的免疫原性。
為了證實疫苗的免疫原性，對6-8周齡的雌性Balb/c小鼠皮下注 射與Montanide ISA 51按1:1混合的58mg(相當于5pgTGFa)、 116mg(10ng)或0，6mg(50iag) TGFa-P64K。如本發(fā)明的詳細描述制備 免疫原并在免疫前振蕩IO分鐘。每只動物接種4劑。在免疫前、 一周 后及此后每兩周進行抽血。從所抽取的動物血中分離血清并采用間接 ELISA技術(shù)測定抗hTGFa的特異性抗體滴度。
簡而言之，用含2.5)ag/mL hTGFa的pH=7.2碳酸鹽-碳酸氬鹽緩 沖液按50pL/孔包被微滴ELISA板(COSTAR)，并在4。C溫育過夜。 用PBS 1 x_Tween 20(0.05%)沖洗三次后，用PBS 1 x-Tween 20(0.050/。)-SFT(5o/。)溶液在37r封閉1小時。立刻加入被免疫小鼠的 血清并于37 。C溫育2小時。沖洗后，將于PBS 1 x-Tween 20(0.05。/。)-SFT(5。/。)中1/1000稀釋的堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠免 疫球蛋白(Sigma)加入板中在相同溫度下溫育板1小時(50nL/pozo)。最 后，在沖洗后，加入在pH=9.8 二乙醇胺緩沖液中終濃度為lmg/mL 的酶底物(對硝基苯磷酸(Sigma)) (50pL/孔)。在ELISA讀板機中測 量所形成的酶-底物復(fù)合物在405nm的吸光度。
圖4顯示了在用TGFa-P64K免疫的小鼠中獲得的多價抗hTGFa抗體應(yīng)答的動力學(xué)。
由于hTGFoc與大鼠或小鼠相應(yīng)因子之間的高度同源性(93% )， 可以將此抗hTGFa的免疫應(yīng)答視為抗自身TGFa (小鼠)的應(yīng)答。 實施例14:小鼠模型中TGFa-P64K/Al(OH)3的免疫原性。 使用2 mg Al(OH)3作為佐劑，按之前實施例所述實施免疫方案。 按本發(fā)明的詳細描述制備免疫原性制劑。對于TGFa獲得的抗體滴度 達1/10000。用于測定抗體滴度的技術(shù)是實施例13中所述的間接 ELISA。
實施例15:小鼠模型中用TGFa-P64K蛋白/不完全弗氏佐劑 (Montanide ISA 51)免疫的小鼠中的IgG亞群分布。
通過實施例13中所述的間接ELISA技術(shù)，使用1/1000稀釋的與 生物素(Jackson)偶聯(lián)的抗不同IgG亞群的特異性抗血清，然后用鏈 霉抗生物素蛋白-磷酸酶復(fù)合物(1/1000)，來測定IgG亞群分布。
測定每種IgG亞群相對于被免疫動物血清中的總IgG的比例。按 照實施例13中所述的免疫程序通過皮下(組1)或肌內(nèi)(組2)途徑 用含50嗎TGFa的融合蛋白免疫動物。圖5是所獲得的亞群分布。研 究所用的兩組小鼠均獲得更大比例的IgGl。
實施例16:通過放射受體測定技術(shù)(RRA)測定用TGFa-P64K 蛋白/不完全弗氏佐劑(Montanide ISA 51)免疫的動物血清抑制 I125-TGFa結(jié)合的能力。
為測定之前所述的免疫程序中所產(chǎn)生的抗體是否能夠抑制TGFa 與其受體結(jié)合，使用了一種稱為RRA的體外技術(shù)。在合成中，如實施 例13中所述獲得的被免疫小鼠的血清與包含100mL人胎盤膜和20mL I125-TGFa(100000 cpm)以及330mL緩沖液(pBN7.4， 10mM Tris曙Cl， 10mM MgCl2和1°/。 BSA)的混合物一起溫育。使用氯胺T方法(Hunter 和Greenwood (1962)， Nature, 358:495-498)將TGFa偶聯(lián)至放射性同 位素I125。混合物于室溫下溫育1小時并用lmL之前提到的緩沖液終 止反應(yīng)。最后將試管于1000rpm離心30分鐘。洗滌沉淀并晾干。用 Y發(fā)射計數(shù)器(Wallac，芬蘭)檢測放射性。放射性測量值的減少表明由于被測血清的作用，TGFa與其受體的結(jié)合被抑制。在所有被測血 清中抑制百分比為50%-80%。
實施例17:測定通過用TGFa-P64K蛋白免疫而產(chǎn)生的抗人EGF (hEGF)體液應(yīng)答。
使用所述的間接ELISA技術(shù)在顯示高抗TGFa抗體滴度的小鼠 血清中檢測抗EGF抗體的存在。向包被有hEGF(CIGB)的板內(nèi)加入 1/100 、 1/1000和1/10000稀釋的血清。圖6顯示了用TGFa-P64K蛋 白免疫的小鼠血清中獲得的抗EGF抗體滴度。僅在一組被免疫小鼠 中獲得了陽性抗EGF抗體應(yīng)答。
然而用 一種化學(xué)結(jié)合物EGF-P64K免疫的小鼠未顯示任何水平的 抗TGFa抗體。
實施例18:通過用TGFa-P64K蛋白/不完全弗氏佐劑(Montanide ISA 51)免疫而獲得的多克隆抗血清抗hTGFa在體外對人類胂瘤的 識別。
將使用TGFa-P64K蛋白與Montanide ISA 51免疫小鼠獲得的多 克隆抗血清抗hTGFa用于檢測包埋在石蠟中的腫瘤活檢組織中的 TGFa表達。這些活檢組織獲自接種了基于EGF的疫苗的患者。在一 名有高抗hEGF抗體反應(yīng)的患者身上，觀察到了 NSCLC胂瘤的消退。 然而，后來檢測到了喉部的第二胂瘤。分析這兩個胂瘤的活檢組織并 觀察到每一個腫瘤中EGF和TGFa的差異性表達。圖7中顯示的是 不同抗體的反應(yīng)性值。這些結(jié)果證實了用含TGFa-P64K的疫苗制劑 進行免疫會產(chǎn)生能識別人體肺瘤中hTGFa的抗hTGFa特異性抗體這 一事實。
實施例19:乳腺癌活檢組織中EGF、 TGFa和EGF-R的mRNA表達。
使用TRIZOL試劑(Life technologies)從乳腺癌肺瘤活檢組織中分 離信使核糖核酸(mRNA)并通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)換為cDNA。使用對于這 些分子中每一種的特異性引物對總cDNA進行30個PCR循環(huán)。用一 個管家基因(GAPDH)作為內(nèi)對照。獲得的PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離并用溴化乙錠來觀察。
圖8顯示了在22個乳腺癌中使用對EGF、 TGFa、 EGF-R和 GAPDH (內(nèi)對照)的特異性引物獲得的結(jié)果。只在1/22的活檢組織 中觀察到了 EGF mRNA,而在大多數(shù)樣品中觀察到TGFot和EGF-R mRNA的高表達。這兩個分子表達之間的高度相關(guān)性提示 TGFa/EGF-R自分泌環(huán)在這類胂瘤生長中的重要性(圖9)。
附圖簡要說明
圖1:成熟hTGFa的基因和氨基酸序列(黑體下劃線字母)。 圖2:表達載體pMTGFa獲得過程圖解。
圖3:通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，抗P64KMab( A)和抗hTGFaMab (B )對TGFa-P64K融合蛋白的識別。對P64K( 1 )、 EGF-P64K ( 2 ) 和TGFoc-P64K ( 3 )進行10%SDS-PAGE。然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖 維素膜并與抗P64K ( A)或TGFa (B)的特異性抗體一起溫育，以 表征TGFa與P64K的融合蛋白。
圖4:抗hTGFa抗體反應(yīng)動力學(xué)通過間接ELISA技術(shù)測定抗 hTGFa特異性抗體滴度。用與Montanide ISA 51混合的相當于 5pg(A)、 10pg(B)和50pg(C) hTGFa的TGFa-P64K蛋白免疫小鼠。x 軸代表從每只小鼠收集樣本的天數(shù)，y軸代表所達到的抗體滴度的倒 數(shù)。免疫的天數(shù)在圖A中用箭頭指出(0、 14、 28和42天)。
圖5:用相當于50iigTGFa的融合蛋白進行免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG 亞群分布。使用TGFa-P64K蛋白經(jīng)皮下(1)或肌內(nèi)(2)免疫所誘 導(dǎo)的抗體反應(yīng)中IgG亞群比例的比較。對每組5只免疫動物，圖中顯 示標準偏差值。
圖6:用TGFa-P64K融合蛋白免疫的小鼠中的抗EGF特異性抗 體反應(yīng)。圖表中顯示的是在用TGFa-P64K免疫的小鼠中達到的抗 hTGFa和抗EGF抗體的滴度。
圖7:通過對EGF疫苗II期臨床試驗中接受疫苗接種的患者胂瘤 活檢組織的免疫組化分析來測定EGF-R、 EGF和TGFa的表達。這三種分子在肺原發(fā)腫瘤和后出現(xiàn)的喉部第二原發(fā)瘤中的差別活性，在 圖中用加號顯示。
圖8: EGF、 hTGFa和EGF-RmRNA在22個乳腺癌中的表達。 該圖顯示了用對每種分子特異性的引物獲得并在1.5%的瓊脂糖凝膠 上分離后用溴化乙錠觀察到的30個PCR循環(huán)的產(chǎn)物。GAPDH mRNA 表達作為內(nèi)對照，也可以看到。
圖9:乳腺癌活檢組織中hTGFa和EGF-R mRNA水平之間的關(guān) 系通過一個計算程序(ImagQuant, Amersham)分析用溴化乙錠獲 得的條帶強度。x軸顯示對于每個樣品用對EGF-R特異性的引物獲得 的PCR產(chǎn)物的強度值與用GAPDH獲得的強度值之間的關(guān)系(相對強 度)，y軸是對hTGFa相同的相對強度值。在這兩種分子的表達之間 觀察到了確實的相關(guān)性(R2=0.657， P-0.00121 )。
權(quán)利要求
1.引發(fā)抗自身TGFα的特異性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其中所述組合物包含自身TGFα或其任何衍生物作為活性成分以及合適的佐劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其包含人重組TGFa。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2的疫苗組合物，其包含單獨的或與其它 EGF-R配體相組合的自身TGFa作為活性成分。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3的疫苗組合物，其中作為活性成分的自身 TGFa和EGF-R配體可任選通過化學(xué)結(jié)合或通過遺傳方式偶聯(lián)至載體 蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的疫苗組合物，其包含來自腦膜炎奈瑟氏球菌 的P64K蛋白作為載體蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物，其包含TGFa和來自腦膜炎奈 瑟菌的P64K蛋白之間的化學(xué)結(jié)合物作為活性成分。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物，其包含TGFa和來自腦膜炎奈 瑟氏球菌的P64K蛋白之間的化學(xué)結(jié)合物作為活性成分，還包含EGF。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物，其包含TGFa和來自腦膜炎奈 瑟氏球菌的P64K蛋白之間的重組融合蛋白作為活性成分。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物，其包含TGFa和來自腦膜炎奈 瑟氏球菌的P64K蛋白之間的重組融合蛋白作為活性成分，其中所述 P64K蛋白的N末端有一個六個組氨酸的尾。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗組合物，其包含TGFa、來自腦膜炎 奈瑟氏球菌的P64K蛋白和EGF之間的重組融合蛋白作為活性成分。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10的疫苗組合物，其包含不完全弗氏佐劑 作為佐劑。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-10的疫苗組合物，其包含Al(OH)3作為佐劑。
13. 治療表達TGFa或任何EGF-R配體的上皮性來源腫瘤惡性疾病的方法，其中使用權(quán)利要求1- 12中任何一項所述的疫苗組合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，用于治療胂瘤，如肺、乳腺、前列 腺、胃和卵巢的表皮樣癌，其中使用權(quán)利要求1-12中任何一項所述 的疫苗組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有轉(zhuǎn)化生長因子α的疫苗組合物。本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生針對自身TGFα的特異性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其包含TGFα及其任何衍生物作為活性成分，以及適宜的佐劑。所述疫苗制劑還可包括TGFα和其它生長因子如表皮生長因子(EGF)的組合，從而抑制其進展依賴于所述因子的腫瘤的增殖。使用所述組合物可控制表皮樣癌的生長和增殖。
文檔編號A61K39/385GK101406692SQ20081008766
公開日2009年4月15日 申請日期2001年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月6日
發(fā)明者A·奧瓦雷斯阿科斯塔, A·穆萊謝拉, B·桑切斯拉米雷斯, G·E·吉倫涅托, G·M·岡薩雷斯馬里內(nèi)羅, R·佩雷斯羅德里格斯, T·梅南德斯麥迪納 申請人:分子免疫中心