專利名稱：：一種冬凌草有效組分及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬中藥提取物，具體地說涉及從冬凌草中提取的有效組分，及其制備方法，以及該有效組分在制備治療、預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。目前業(yè)內(nèi)對惡性腫瘤的治療主要還是以手術(shù)、放療、化療為主，但許多化學(xué)抗癌藥物在作用于靶細(xì)胞時往往累及正常細(xì)胞，造成嚴(yán)重的副反應(yīng)。植物藥的遺傳毒性不明顯，中草藥在抗癌抗突變方面有獨特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景，而且中藥在對腫瘤的輔助治療中也起到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗癌活性的天然化合物，現(xiàn)己開發(fā)為抗腫瘤藥物。目前我國危害性最為嚴(yán)重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。特別是肝癌的發(fā)生率近年來有所增加。值得重視，這些腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)及其防治，均為我國腫瘤研究的重點。尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當(dāng)前腫瘤研究的重要內(nèi)容。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質(zhì)是研究和發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化學(xué)物，開發(fā)新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，用于開發(fā)成治療腫瘤疾病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，開發(fā)成具有抗腫瘤療效的新藥，具有重要應(yīng)用價值和廣闊發(fā)展前景。冬凌草又名冰凌草、六月令，得名于冬天全株結(jié)滿薄如蟬翼的銀白色冰凌片，植物來源為唇形科香茶菜屬植物碎米椏(Rabdosiarubescens(Hemls.)Hara)，廣布于黃河、長江流域，主產(chǎn)地在河南濟源太行山一帶。河南、安徽、湖北、貴州等地均有產(chǎn)，其中以河南濟源市產(chǎn)最佳。全草含有單萜、倍半萜、二萜等多種萜類化合物以及少量揮發(fā)油、生物堿，其中冬凌草素是含量較高的二萜類成分，具有很強的苦味。另外，還從中分離得到了水楊酸和三個黃酮類化合物——胡麻素、線薊素和Pedalitin(李欽，等.冬凌草化學(xué)成分、藥理作用及開發(fā)研究進展.河南中醫(yī)學(xué)院.2003，6(18):31-33)。冬凌草味甘苦，性微寒，具清熱解毒、消炎止痛、健胃活血及抗腫瘤之功效。冬凌草對金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、乙型鏈球菌均有小劑量抑菌，大劑量殺菌作用，其中肺炎雙球菌對之最敏感。另外，冬凌草醇提物對大鼠棉球肉芽腫有抑制作用，對小鼠有鎮(zhèn)痛作用(段曉穎.復(fù)方冬凌草含片體外抗菌實驗研究.河南中醫(yī)藥學(xué)刊，1997，12(3):38-40)。研究表明，冬凌草甲素具有抑制腫瘤細(xì)胞增值、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡等作用(辛慶鋒，等.冬凌草甲素抗腫瘤作用機制研究進展.醫(yī)學(xué)綜述.2008，14(3):455-456)。冬凌草甲素還有抗突變作用(楊勝利，張巧.冬凌草甲素抗突變性研究.癌變畸變突變,2001，13(1):8-10.)、3受體拮抗作用(李琦，劉潔.冬凌草甲素對家兔血流動力學(xué)的影響及機理研究[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1994，20(2):128-129.)、抗氧化作用(張予，王筠.冬凌草甲素對活性氧自由基的清除作用.河南醫(yī)學(xué)研究，1998，8(2):100-104.)。冬凌草多糖在體外高濃度下可以抑制EAC腫瘤細(xì)胞的生長，小鼠體內(nèi)進一步研究發(fā)現(xiàn)其能夠抑制S180的生長，且對S180的抑瘤效應(yīng)呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。冬凌草多糖對體液免疫和細(xì)胞免疫均有增強作用(王一飛，江金花，王慶端,等.冬凌草多糖的抗腫瘤及其免疫增強作用.中國病理生理雜志，2002，18(11):1341—1343.)。本發(fā)明的目的是提供一種冬凌草有效組分，該有效組分主要含有化合物A:CoetsoidinF，化合物B:CoetsoidinC，其中化合物A的摩爾百分比含量為7090%，化合物B的摩爾百分比含量為5~20%。優(yōu)選化合物A的摩爾百分比含量為75~85%，化合物B的摩爾百分比含量為8~15%?；衔顰的結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>化合物B的結(jié)構(gòu)式為:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>本發(fā)明的另一目的是提供該冬凌草有效組分的制備方法，通過以下步驟實現(xiàn)將冬凌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。優(yōu)選的冬凌草有效組分制備方法，包括下列步驟將冬凌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.81.2)，加熱回流0.8~1.2小時，提取1~3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(4753:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(813:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9llml/min，柱溫為室溫，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。最佳的冬凌草有效組分制備方法，包括下列步驟將冬凌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流l小時，提取2次，合并濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相為70%的水溶液和30%的乙腈溶液；40分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；50分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液。流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段7.115.5min收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明的再一個目的是提供該冬凌草有效組分在制備治療、預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的冬凌草有效組分可以作為活性成分，加入藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學(xué)上記載的方法制成制劑。本發(fā)明的冬凌草有效組分還可以作為活性成分之一，加入其他抗腫瘤藥物，加入藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學(xué)上記載的方法制成制劑。所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑、膠丸劑。包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。本發(fā)明的有益效果為1.本發(fā)明的提取分離工藝中使用了正相硅膠柱，能有效地除去糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)，提高有效成分的含量，同時采用了制備色譜，能快速準(zhǔn)確的得到有效成分。2.本發(fā)明提供的冬凌草有效組分化學(xué)成分簡單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。3.本發(fā)明提供的方法首次從冬凌草中得到A、B等幾個成分的組合物，并首次將其在多種腫瘤細(xì)胞株上進行藥效篩選，得到較好的藥理活性。具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合下面實施例進一步詳細(xì)說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容，該實施例僅用于說明本發(fā)明而并非對本發(fā)明的限制。實施例一冬凌草有效組分的制備將200g冬凌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:0.8)，加熱提取1次得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(53:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(13:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段7.115.5min收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。經(jīng)測定，化合物A的含量為70~86%，化合物B的含量為518Q/。。實施例二冬凌草有效組分的制備將500g冬凌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:1.2)，加熱回流1.2小時，提取3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(47:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9ml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段7.115.5min收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。經(jīng)測定，化合物A的含量為75~90%，化合物B的含量為820%。實施例三冬凌草有效組分的制備取冬凌草藥材250g，將其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流1小時，提取2次，濾液合并得提取液。將提取液濃縮成浸膏，將浸膏和硅膠拌樣，用正相硅膠柱進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品。用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品。制備色譜的分離條件色譜柱為Agient制備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B),梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相為70%的水溶液和30°/。的乙腈溶液；40分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；50分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；流速為10ml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段7.115.5min收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。經(jīng)測定，化合物A的含量為7585。/。，化合物B的含量為8~15%。實施例四冬凌草有效組分HPLC-ELSD分析色譜條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mmxl50mm，5pm);采用梯度洗脫，流動相A相為0.2%冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2%冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為90%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為10%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；10分鐘時，流動相A為50%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為50%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；35分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mLmin";檢測波長全波長；柱溫30。C。ELSD參數(shù)氮氣流速2.0L/min;漂移管溫度105°C。供試品溶液的制備稱取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。測定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，依色譜分析條件測定，即得。本發(fā)明中，化合物A的結(jié)構(gòu)式為實施例五冬凌草有效組分制劑滴丸的制備，取實施例三的冬凌草有效組分0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至68"C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實施例六冬凌草有效組分制劑凍干粉針的制備，取降香油1.5g，加入到13ml飽和的羥丙基p-環(huán)糊精中，攪拌溶解，濾過，濾液低溫干燥，得降香油和羥丙基3-環(huán)糊精的包合物粉末。本發(fā)明中，化合物B的結(jié)構(gòu)式為:9除上述降香油合羥丙基p-環(huán)糊精的包合物粉末外，再取實施例三的冬凌草提取物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300支，即得。實施例七冬凌草有效組分制劑注射液的制備，取實施例三的冬凌草有效組分適量用4(TC注射用水溶解，加入適量藥用載體等滲劑，調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.0-8.0，加注射用水至全量，用超濾器超濾除熱源，測定pH值后，用膜過濾，分裝后，高壓滅菌，檢驗、包裝，即得。實施例八冬凌草有效組分制劑膠丸的制備，取實施例三的冬凌草有效組分與花生油按2:18的比例水溶式不銹鋼攪拌灌中，同時加入適量明膠和甘油混合，放出再用膠體磨磨漿，磨出的混合液攪拌，制成藥液；將甘油與蒸餾水在40-5(TC溫度下攪拌混溶，再將甘油液溫至80-90°C，取明膠加入其中混合攪拌，直至全部溶化成膠液，然后在60'C溫度下使膠液靜置4小時，用制板機制成膠板供制丸工序使用；將上述制成的藥液和膠板送入壓丸機制丸，然后在22-25"C溫度下吹風(fēng)4小時作滾筒定型，又在25-3(TC溫度下吹風(fēng)干燥16-20小時，檢選合格膠丸，用95%乙醇清洗，在25-30'C下吹風(fēng)干燥4小時，即得。實施例九冬凌草有效組分制劑片劑的制備，取實施例三的冬凌草有效組分適量與微晶纖維素混合均勻，加3%聚維酮乙醇溶液制軟材，過18目篩制顆粒，6(TC干燥1小時，整粒，加入滑石粉適量，混勻，壓片，即得。實施例十冬凌草有效組分的藥理實驗藥理模型HL60腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10%,非必需氨基酸(Gibco)1。/?；旌吓囵B(yǎng)HL60細(xì)胞，密度需低于1(^個/mL。計算需要細(xì)胞總量N產(chǎn)pcell'mL"xVT(p=2xl04個/mL)，其中Vf0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10pL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)Nl，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為Nl/4x10、2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VimL，吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使VfNT/NxV^在細(xì)胞槽中再加入Vt-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100)iL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100)iLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案冬凌草有效組分用DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88^L藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50iaL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50ng/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4個平行復(fù)孔，每板設(shè)空白組(blank,只加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞)，及陰性對照組(negative,細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200^iL的培養(yǎng)液，將吸取0.88(iLDMSO加入混勻)。SRB染色細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)100pL固定細(xì)胞，室溫放置5min，fC冰箱中放置1h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4。/。的SRB100^iL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用lOmmol/LTrisl50nL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標(biāo)儀(ELx800)測定，所用波長為490nm。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物組難-空白組難xl00%陰性對照組力值一空白組j值藥效結(jié)果見表l。根據(jù)HL60腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，冬凌草有效組分對抑制HL60腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.2藥理模型K562腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/?；旌吓囵B(yǎng)K562細(xì)胞。計算需要細(xì)胞總量NT:pcell'mL"xVT(p二8x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取l(^L，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液V1mL，吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100^iL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案冬凌草有效組分加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心?？蓛Υ?20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88(iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50pL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4(2)個平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。SRB染色細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)70pL固定細(xì)胞，4。C冰箱中放置1h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4%的SRB100^iL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用10mmol/LTrisl50!iL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標(biāo)儀(ELx800)測定，所用波長為490nm。抑制率的計算抑制率按如下公式計算-抑制率(％)=藥物歸-空白歸x腦陰性對照組/i值一空白組/(值藥效結(jié)果見表2。根據(jù)K562腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，冬凌草有效組分對抑制K562腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.3藥理模型MCF-7腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/?；旌吓囵B(yǎng)MCF-7細(xì)胞。計算需要細(xì)胞總量NT-pcell'mL"xVT(p-2x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取l0^iL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液V1mL，吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2=NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100)iL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案冬凌草有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入22(VL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88pL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50iaL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4(2)個平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4昭/mL)。MTT比色法測定取出培養(yǎng)板，去除每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液=10:1)100pL，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150^iL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標(biāo)儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=,隨-空白歸x腦陰性對照組^值一空白組/4值藥效結(jié)果見表3。根據(jù)MCF-7腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，冬凌草有效組分對抑制MCF-7腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.4藥理模型KB腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1%混合培養(yǎng)KB細(xì)胞。計算需要細(xì)胞總量NT-pcell，mL"xVT(p二2x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10|iL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液V1mL，吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案冬凌草有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心?？蓛Υ?20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88|iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50^iL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4(2)個平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測定取出培養(yǎng)板，去除每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液二10:1)100pL，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150|iL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標(biāo)儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=難值-空畫x腦陰性對照組^值一空白組^值藥效結(jié)果見表4。根據(jù)KB腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，冬凌草有效組分對抑制KB腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.5藥理模型HepG2腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10%,非必需氨基酸(Gibco)1%混合培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。計算需要細(xì)胞總量NT:pcell，mL"xVT(p-2x103個/mL)，其中VT-0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10pL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL，吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案冬凌草有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心?？蓛Υ?20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88|iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50pL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為5(Vg/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4(2)個平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200i!L的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4嗎/mL)。MTT比色法測定取出培養(yǎng)板，去除每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液二10:1)100pL，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150(^L的DMSO，振蕩10min,550nm酶標(biāo)儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=,歸-空畫x廳陰性對照組力值一空白組^值藥效結(jié)果見表5。根據(jù)HepG2腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，冬凌草有效組分對抑制HepG2腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表5冬凌草組分陰性空白陽性平均細(xì)胞存活數(shù)0.070.470.080.09抑制率(％)102.630.00100.0097.69RSD(。/cO4.282.837.364.30權(quán)利要求1.一種冬凌草有效組分，其特征是該有效組分主要含有化合物ACoetsoidinF和化合物BCoetsoidinC，其中化合物A的摩爾百分比含量為70～90％，化合物B的摩爾百分比含量為5～20％，化合物A的結(jié)構(gòu)式為化合物B的結(jié)構(gòu)式為2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬凌草有效組分的制備方法，其特征是通過以下步驟實現(xiàn)將冬凌草藥材粉碎后加入1:0.8~1.2的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.81.2小時，提取13次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用4753:1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，再用813:1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的目的物；制備色譜的分離條件為色譜柱為制備柱，流動相為水和乙化合物B的結(jié)構(gòu)式為:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>腈，梯度洗脫，流速為9llml/min，柱溫為室溫，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種冬凌草有效組分的制備方法，其特征是所述梯度洗脫程序為0分鐘時，流動相為70%的水溶液和30%的乙腈溶液；40分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；50分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種冬凌草有效組分的制備方法，其特征是色譜分離后，在7.115.5min時間段收集溶液。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬凌草有效組分在制備治療、預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種冬凌草有效組分的應(yīng)用，其特征是所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種冬凌草有效組分的應(yīng)用，其特征是所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑或膠丸劑。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種冬凌草有效組分的應(yīng)用，其特征是所述藥物的給藥方式包括口服給藥或注射給藥。全文摘要本發(fā)明提供一種冬凌草有效組分，主要含有化合物ACoetsoidinF和化合物BCoetsoidinC，其中化合物A的含量為70～90％，化合物B的含量為5～20％。藥材通過加熱提取，濃縮，硅膠柱分離，洗脫，洗脫液濃縮干燥，再用液相色譜繼續(xù)分離，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明提供的冬凌草有效組分可在制備治療、預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明方法設(shè)計合理，能快速準(zhǔn)確地得到有效成分，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。文檔編號A61K31/352GK101317837SQ20081006301公開日2008年12月10日申請日期2008年7月4日優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日發(fā)明者靂劉,水文波,程翼宇,葛志偉申請人:浙江大學(xué)