專利名稱：：一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬納米粒的應用，主要涉及一種負載了抗病毒藥物的脂質(zhì)納米粒及其在制備抗乙肝病毒藥物中的應用。
背景技術：
：病毒性疾病作為傳染性疾病已經(jīng)成為人類健康的主要威脅之一。慢性乙型肝炎是危害嚴重的病毒性傳染病，是引起肝纖維化、肝硬化和肝癌的最主要原因。全球每年有超過50萬人死于原發(fā)性肝癌，而其中多達80°/。的原發(fā)性肝癌是由慢性乙肝引起的。由于現(xiàn)有的抗病毒藥物不能完全抑制、清除病毒，存在著給藥劑量大、療效低、毒副作用和易產(chǎn)生耐藥的問題，因此，對于病毒性疾病的治療，尤其是病毒慢性感染的治療仍然是醫(yī)學上的難題。現(xiàn)有的抗病毒化療藥物，具有一般化療藥物的體內(nèi)非特異性分布特點，同時受到體內(nèi)生物膜吸收與轉(zhuǎn)運屏障，酶代謝的影響，藥物無法大量進入其分子靶標，從而導致療效低、劑量大、毒副作用以及耐藥性的產(chǎn)生。通過靶向制劑技術，改變以藥物自身性質(zhì)為主導的藥物體內(nèi)分布模式，將外源性的藥物輸送到藥物作用的分子靶標，可最大限度地提高藥物作用的療效，降低藥物在正常臟器的分布和毒副作用?？笻BV化療藥物的分子作用位點，除HBV吸附抑制劑外，均作用于宿主細胞內(nèi)的亞細胞器，因此理想的抗HBV靶向制劑應具有高效的肝臟、肝細胞和肝細胞內(nèi)的亞細胞器靶向功能。國內(nèi)外的科學家，通過對藥物載體大小、表面理化性質(zhì)的調(diào)控、以及在此基礎上的配體或抗體修飾技術，目前己經(jīng)實現(xiàn)了藥物向肝臟細胞的靶向輸送，亞細胞器靶向載體技術己成為當前實現(xiàn)藥物分子靶向治療的核心環(huán)節(jié)。固體脂質(zhì)給藥系統(tǒng)是20世紀90年代初發(fā)展起來的新型膠體給藥系統(tǒng)，它是繼乳劑、脂質(zhì)體、聚合物納米粒之后，極具發(fā)展?jié)摿Φ陌邢蚩蒯尳o藥系統(tǒng)。固體脂質(zhì)給藥系統(tǒng)采用天然或合成的類脂材料，如硬脂酸、卵磷脂、單甘酯等為載體，將藥物包裹于類脂核中制成固體膠粒給藥系統(tǒng)。它既具備聚合物給藥系統(tǒng)控釋、避免藥物泄漏等優(yōu)點，又兼具了乳劑、脂質(zhì)體的毒性低、生物相容性好、生物利用度高的優(yōu)點。但是，固體脂質(zhì)給藥系統(tǒng)也存在一些潛在的局限性，如有限的載藥能力、儲存過程的藥物排擠現(xiàn)象等問題。在固體脂質(zhì)中混和形態(tài)相異的液體脂質(zhì)作為混合類脂基質(zhì)，以此制備得到新型納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructuredlipidcarrier,NLC)。液體脂質(zhì)的加入，可擾亂固體脂質(zhì)規(guī)則的晶格結(jié)構(gòu)，增加納米粒結(jié)構(gòu)中不規(guī)則晶型的比例，使承載脂溶性藥物的空間容量增加，從而提高載體的載藥能力。通過控制液體脂質(zhì)比例，還可使NLC在體溫下保持固體骨架結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)NLC藥物的控制釋放。研究發(fā)現(xiàn)固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體均具有快速的細胞攝取和細胞漿滯留特性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒，所述脂質(zhì)納米粒由抗病毒藥物和脂質(zhì)材料組成，該脂質(zhì)納米粒負載了分子靶標位于細胞內(nèi)的抗病毒藥物，所述抗病毒藥物包括阿德福韋酯等藥物，阿德福韋酯的含量為脂質(zhì)納米粒的1°/。-4%。其中的脂質(zhì)材料可由單硬脂酸甘油酯、棕櫚酸甘油酯、硬脂酸、或單硬脂酸甘油酯和油酸等一種或兩種脂質(zhì)組成，其重量占納米粒的96-99%;其中由兩種脂質(zhì)材料組成時，油酸占脂質(zhì)材料的比例為5-20%;本發(fā)明的另一個目的是提供該脂質(zhì)納米粒在制備抗乙肝病毒藥物中的應用。該脂質(zhì)納米粒與病毒感染細胞共孵育后，與藥物的溶液對照相比，可顯著抑制病毒的表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和DNA(HBVDNA)含量，體現(xiàn)出良好的抗病毒療效。本發(fā)明的有益之處是通過具有高效細胞攝取和細胞漿滯留功能的脂質(zhì)納米粒，對分子靶標位于細胞內(nèi)的抗病毒藥物的包封，可大大增加病毒細胞對藥物的攝取，以及藥物分子靶標部位的藥物濃度。增加病毒細胞對藥物的攝取，有利于減小藥物在正常組織或細胞的分布，降低藥物的毒副作用；而藥物分子耙標部位的藥物濃度的增加，有利于提高抗病毒藥物的療效。本發(fā)明利用固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體均具有快速的細胞攝取和細胞漿滯留功能，負載阿德福韋酯等抗病毒藥物，以提高藥物分子靶標部位的藥物濃度，從而達到提高該類藥物的抗乙肝病毒療效的目的。圖1為不同藥物濃度的阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒和阿德福韋酯溶液與1^。62.2.15細胞共孵育后，對HBsAg的抑制率變化。圖2為不同藥物濃度的阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒和阿德福韋酯溶液與HepG2.2.15細胞共孵育后，對HBeAg的抑制率變化。圖3為不同藥物濃度的阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒和阿德福韋酯溶液與HepG2.2.15細胞共孵育后，對HBV-DNA表達的抑制率變化。具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例做進一步的說明。實施例1:負載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的制備與應用1)負載阿德福韋酯單甘脂脂質(zhì)納米粒的制備分別精密稱取單硬脂酸甘油酯50mg和10mg阿德福韋酯，置于2mL無水乙醇中，水浴5(TC溶解。以PH7.2的磷酸緩沖液為分散相，置冰浴中。在400rmin—1機械攪拌條件下，將有機相注入10mL分散相中，攪拌5min，得到負載阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。所得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液用3mol丄"HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，以20000r'min"離心10min，沉淀加0.1%泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用lmol'L"NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。即得得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。表l為所制備得到的負載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率等理化性質(zhì)。表l:負載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2)負載阿德福韋酯單甘脂脂質(zhì)納米粒的體外抗乙肝病毒療效取1^口02.2.15細胞，在含有約10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)(5%C02，37'C孵箱)。當細胞達對數(shù)生長期時，即可進行接種。取對數(shù)生長期細胞，PBS潤洗后，加入胰酶消化并用培養(yǎng)液稀釋，按每孔口104個細胞的密度接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時。24孔培養(yǎng)板內(nèi)細胞貼壁生長后，棄去舊培養(yǎng)液，使用PH7.4的緩沖溶液(PBS)潤洗2遍后分別加入含不同藥物濃度的阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒和阿德福韋酯溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2-5天后，收集培養(yǎng)液，酶免疫測定試劑盒測定細胞培養(yǎng)液中的表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)含量,即時PCR定量法測定乙肝病毒DNA(HBVDNA)含量。不同藥物濃度的阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒和阿德福韋酯溶液與HepG2.2.15細胞共孵育后，對HBsAg，HBeAg和HBV-DNA表達的抑制率變化結(jié)果見圖1-3。結(jié)果顯示阿德福韋酯經(jīng)脂質(zhì)納米粒包封后，與阿德福韋酯溶液相比，對HBsAg,HBeAg和HBV-DNA表達的抑制率顯著增加，揭示阿德福韋酯經(jīng)脂質(zhì)納米粒的顯著抗病毒效果。實施例2:負載阿德福韋酯單甘脂脂質(zhì)納米粒的制備分別精密稱取單硬脂酸甘油酯50mg和5mg阿德福韋酯，置于2mL無水乙醇中，水浴50'C溶解。以PH7.2的磷酸緩沖液為分散相，置冰浴中。在400r'min—1機械攪拌條件下，將有機相注入10mL分散相中，攪拌5min，得到負載阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。所得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液用3mol七"HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，以20000rmin"離心10min，沉淀加0.1%泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用lmol'L'1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。即得得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。表2為所制備得到的負載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率等理化性質(zhì)。表2:負載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率。體均粒徑表面電位藥物包封率載藥量(腦)(畫mV)(%)(%)381.338.610.21.0實施例3:負載阿德福韋酯硬脂酸脂質(zhì)納米粒的制備分別精密稱取單硬脂酸50mg和10mg阿德福韋酯，置于2mL無水乙醇中，水浴5(TC溶解。以PH7.2的磷酸緩沖液為分散相，置冰浴中。在400rmin"機械攪拌條件下，將有機相注入10mL分散相中，攪拌5min，得到負載阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。所得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液用3mol丄"HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，以20000r'min"離心10min，沉淀加0.1%泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用lmol'L—1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。即得得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。表3為所制備得到的負載阿德福韋酯硬脂酸脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率等理化性質(zhì)。表3:負載阿德福韋酯硬脂酸脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例4:負載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯油酸脂質(zhì)納米粒的制備分別精密稱取單硬脂酸甘油酯47.5mg，油酸2.5mg和10mg阿德福韋酯，置于2mL無水乙醇中，水浴5(TC溶解。以PH7.2的磷酸緩沖液為分散相，置冰浴中。在400。min"機械攪拌條件下，將有機相注入10mL分散相中，攪拌5min，得到負載阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。所得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液用3mo卜L"HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，以20000rmin"離心10min，沉淀加0.1%泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用1mol'L/1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。即得得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。表4為所制備得到的負載阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率等理化性質(zhì)。表4:負載阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例5:負載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯油酸脂質(zhì)納米粒的制備分別精密稱取單硬脂酸甘油酯40mg，油酸10mg和10mg阿德福韋酯，置于2mL無水乙醇中，水浴5(TC溶解。以PH7.2的磷酸緩沖液為分散相，置冰浴中。在400rmin"機械攪拌條件下，將有機相注入10mL分散相中，攪拌5min，得到負載阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。所得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液用3mol'L"HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，以20000rmin"離心10min，沉淀加0.1%泊洛沙姆(Poloxamer)(w，/v)再分散后，用lmol'L"NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。即得得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。表5為所制備得到的負載阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率等理化性質(zhì)。表5:負載阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例6:負載阿德福韋酯棕櫚酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的制備負載阿德福韋酯單甘脂脂質(zhì)納米粒的制備分別精密稱取棕櫚酸甘油酯50mg和10mg阿德福韋酯，置于2mL無水乙醇中，水浴50'C溶解。以PH7.2的磷酸緩沖液為分散相，置冰浴中。在400r，min—1機械攪拌條件下，將有機相注入10mL分散相中，攪拌5min，得到負載阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。所得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液用3moHL"HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，以20000rmin"離心10min，沉淀加0.1%泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用lmol'I/1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。即得得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。表6為所制備得到的負載阿德福韋酯棕櫚酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率等理化性質(zhì)。表6:負載阿德福韋酯棕櫚酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求1.一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒，所述脂質(zhì)納米粒由藥物和脂質(zhì)材料組成，其特征是該脂質(zhì)納米粒負載了抗病毒藥物，該抗病毒藥物為分子靶標位于細胞內(nèi)的藥物。2.根據(jù)權利要求l所述的一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒，其特征是.-所述藥物選用阿德福韋酯，阿德福韋酯的含量為脂質(zhì)納米粒的1%-4%。3.根據(jù)權利要求l所述的一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒，其特征是其中的脂質(zhì)材料可由單硬脂酸甘油酯、棕櫚酸甘油酯、硬脂酸、或單硬脂酸甘油酯和油酸等一種或兩種脂質(zhì)組成，其重量占納米粒的96-99%，其中由兩種脂質(zhì)材料組成時，油酸占脂質(zhì)材料的比例為5-20%。4.根據(jù)權利要求l所述的一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒在制備抗乙肝病毒藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明提供一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒，所述脂質(zhì)納米粒由抗病毒藥物和脂質(zhì)材料組成，所述藥物選用阿德福韋酯。本發(fā)明利用固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體均具有快速的細胞攝取和細胞漿滯留功能，對分子靶標位于細胞內(nèi)的抗病毒藥物的包封，可大大增加病毒細胞對藥物的攝取，以及藥物分子靶標部位的藥物濃度。增加病毒細胞對藥物的攝取，有利于減小藥物在正常組織或細胞的分布，降低藥物的毒副作用；而藥物分子靶標部位的藥物濃度的增加，有利于提高抗病毒藥物的療效，可在制備抗乙肝病毒藥物中的應用。文檔編號A61K47/12GK101288646SQ20081006144公開日2008年10月22日申請日期2008年4月30日優(yōu)先權日2008年4月30日發(fā)明者杜永忠,靜繆,胡富強,弘袁申請人:浙江大學