異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的用途的制作方法

專利名稱：：異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域，涉及一種異戊烯基中藥單體化合物的用途，具體涉及異補(bǔ)骨脂甲素在誘導(dǎo)干細(xì)胞體外定向分化方面的用途，可用于藥物治療神經(jīng)退行性疾病和修復(fù)重建損傷神經(jīng)組織的再生醫(yī)學(xué)促細(xì)胞分化劑。技術(shù)背景補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂(i^ra/e"的果實(shí)，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)、固精縮尿、溫脾止瀉、止血止汗、納氣平喘之功能。補(bǔ)骨脂的化學(xué)成分含香豆精類、黃酮類、單萜酚類以及揮發(fā)油、皂苷、多糖、類脂等成分。已經(jīng)分離純化的黃酮類化合物有異補(bǔ)骨脂甲素(isobavachin)，新補(bǔ)骨脂異黃酮(neobavaisoflavone)，異補(bǔ)骨脂査耳酮(isobavachalcone)，補(bǔ)骨脂次素(psomlidin)?，F(xiàn)代藥理研究表明補(bǔ)骨脂具有多種生理活性，包括以下幾個(gè)方面1.心血管系統(tǒng)作用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示補(bǔ)骨脂有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈作用，可興奮心臟、提高心臟作功率，但心肌耗氧量增加不明顯。2.抗菌作用對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用。3.泌尿生殖系統(tǒng)作用能壯陽(yáng)固精，是治陽(yáng)痿及早泄的常用藥，具有固澀之功效。4.對(duì)平滑肌的作用能使離體和在位腸管興奮，對(duì)豚鼠子宮則呈松弛，舒張支氣管平滑肌作用。5.升高白細(xì)胞作用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明對(duì)粒細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，并能保護(hù)動(dòng)物在注射環(huán)磷酰胺后引起的白細(xì)胞下降。6.免疫調(diào)節(jié)作用對(duì)體液免疫有一定調(diào)節(jié)作用。尚能調(diào)節(jié)神經(jīng)和血液系統(tǒng)，促進(jìn)骨髓造血，促進(jìn)吞噬細(xì)胞功能，增強(qiáng)免疫和內(nèi)分泌功能，從而發(fā)揮抗衰老延壽作用。7.護(hù)肝作用對(duì)用氫化可的松造成小鼠肝臟損害有良好的治療作用。干細(xì)胞體外定向分化為神經(jīng)細(xì)胞模型，己用于胚胎神經(jīng)發(fā)育學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究。藥物調(diào)控細(xì)胞微環(huán)境可用于研究干細(xì)胞定向分化神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞表型及分化信號(hào)通路機(jī)制的研究，也可用以篩選促神經(jīng)分化"藥樣"小分子化合物。本發(fā)明申請(qǐng)者研究小組的前期工作發(fā)現(xiàn)，異戊烯基化合物淫羊藿素具有顯著誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞體外定向分化為神經(jīng)細(xì)胞表型作用。此外未見(jiàn)其它關(guān)于藥物誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的報(bào)道。鑒于異補(bǔ)骨脂甲素和淫羊藿素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式相似，均屬異戊烯基黃酮類化合物，亟待進(jìn)一步探討異戊烯基黃酮結(jié)構(gòu)類似物在發(fā)揮神經(jīng)分化和神經(jīng)保護(hù)方面的活性和機(jī)制，旨在為新型結(jié)構(gòu)化合物防治神經(jīng)退行性改變，藥物調(diào)控再生醫(yī)學(xué)或組織工程提供依據(jù)。迄今未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外對(duì)補(bǔ)骨脂提取物的單體化合物，尤其是異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞效應(yīng)的研究報(bào)道。補(bǔ)骨脂分離的異戊烯基化合物結(jié)構(gòu)式為+骨脂次異補(bǔ)骨脂査耳闞
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)干細(xì)胞(包括胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)體外定向分化為單一類型神經(jīng)細(xì)胞在制備干細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供異補(bǔ)骨脂甲素能誘導(dǎo)干細(xì)胞(包括胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)體外定向分化獲得的神經(jīng)細(xì)胞在制備修復(fù)重建損傷神經(jīng)組織的促細(xì)胞分化劑中應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供異補(bǔ)骨脂甲素能誘導(dǎo)干細(xì)胞(包括胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)體外定向分化獲得神經(jīng)細(xì)胞在構(gòu)建藥效篩選與評(píng)價(jià)模型中應(yīng)用。本發(fā)明的異補(bǔ)骨脂甲素能誘導(dǎo)干細(xì)胞(包括胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)體外定向分化獲得神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)主要采用經(jīng)典的4-/4+法進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)按約900個(gè)/30pl細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿蓋內(nèi)表面，翻轉(zhuǎn)后形成懸滴，置于培養(yǎng)箱中3天。將已形成擬胚體(embryoidbodies,EBs)的懸滴轉(zhuǎn)入盛有IOml分化培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內(nèi)，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)l天。第二天加入受試藥物異補(bǔ)骨脂甲素與ES細(xì)胞擬胚體(Ebs)懸浮共培養(yǎng)4天。再將EBs轉(zhuǎn)入預(yù)鋪多聚鳥(niǎo)氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。評(píng)價(jià)神經(jīng)樣細(xì)胞的指標(biāo)是出現(xiàn)細(xì)胞突起長(zhǎng)度為胞體直徑3-5倍以上。本發(fā)明在細(xì)胞層面上對(duì)異補(bǔ)骨脂甲素的藥效進(jìn)行了嚴(yán)格論證，對(duì)其中蘊(yùn)藏的大量生物學(xué)信息進(jìn)行了初步探討，具體有以下有益之處1.本發(fā)明開(kāi)拓了異補(bǔ)骨脂甲素的新用途，即誘導(dǎo)干細(xì)胞(包括胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)定向分化為單一類型神經(jīng)細(xì)胞。2.異補(bǔ)骨脂甲素可用作干細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾病和修復(fù)重建損傷神經(jīng)組織的促細(xì)胞分化劑。干細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾病目前正處于實(shí)驗(yàn)研究階段(含臨床實(shí)驗(yàn)研究)，預(yù)計(jì)促細(xì)胞分化劑異補(bǔ)骨脂甲素的介入將有助于該領(lǐng)域的研究。3.本發(fā)明一方面明確了具備藥理活性的成分異補(bǔ)骨脂甲素，為中藥防治作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)，另一方面藥效機(jī)制的闡明為中藥現(xiàn)代化開(kāi)發(fā)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥提供借鑒。圖1為異戊烯基黃酮類化合物異補(bǔ)骨脂甲素促神經(jīng)分化作用。圖2為流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)nestin陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞比例。圖3為異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞亞型特異性蛋白。圖4為異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞P-tubulinIII和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)mRNA表達(dá)。具體實(shí)施方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。此外應(yīng)理解，下面的優(yōu)選具體實(shí)施方案僅僅是舉例說(shuō)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l:異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell,ES細(xì)胞)體外定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究1.ES細(xì)胞支持培養(yǎng)小鼠ES細(xì)胞D3細(xì)胞株(ES-D3細(xì)胞)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含高糖DMEM、非必需氨基酸、10%胎牛血清、白血病抑制因子)中，按lxl()S個(gè)/ml的密度接種于飼養(yǎng)層細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞)上，23天進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2.異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)ES-D3細(xì)胞用胰酶消化，用分化培養(yǎng)基(含高糖DMEM、非必需氨基酸、10%胎牛血清、不含白血病抑制因子)將其制成單細(xì)胞懸液，按約600個(gè)/30接種于培養(yǎng)皿蓋子內(nèi)表面上，將蓋子翻轉(zhuǎn)形成懸滴，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。此后將己形成擬胚體(embryoidbodies,EBs)的懸滴轉(zhuǎn)入盛有10mL分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)l天。第二天加入異補(bǔ)骨脂甲素與ES細(xì)胞擬胚體懸浮共培養(yǎng)4天。之后，再將擬胚體轉(zhuǎn)移到預(yù)鋪了多聚鳥(niǎo)氨酸及層粘連蛋白的96孔板內(nèi)，每孔加入100iaLES細(xì)胞分化培養(yǎng)基(DMEM/F12+N2/B27+1%胎牛血清)及異補(bǔ)骨脂甲素。此時(shí)開(kāi)始用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞，以捕獲出現(xiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞(細(xì)胞突起的長(zhǎng)度為胞體直徑的5倍以上)的最初時(shí)間。參見(jiàn)圖1，通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)獲得的擬胚體，若能出現(xiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞(細(xì)胞突起的長(zhǎng)度為胞體直徑的5倍以上)，則以此作為定向分化成神經(jīng)細(xì)胞的指標(biāo)。通過(guò)相差顯微鏡觀察，結(jié)果顯示異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞作用非常明顯，與溶劑對(duì)照組相比，其與ES細(xì)胞擬胚體共孵育8—10天時(shí)，就有80%以上擬胚體出現(xiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞，數(shù)量眾多，神經(jīng)細(xì)胞突起較密，相互連接成網(wǎng)狀，在擬胚體周?chē)佌狗植?，緩慢向遠(yuǎn)端延伸。圖1中A:溶劑對(duì)照(低倍)，B:溶劑對(duì)照(高倍)，C:異補(bǔ)骨脂黃酮0.1mol/L(低倍)，D:異補(bǔ)骨脂黃酮0.1mol/L(高倍)。實(shí)施例2:免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外定向分化為神經(jīng)前體細(xì)胞ES細(xì)胞分化早期，三胚層結(jié)構(gòu)處在不斷分化中，其中神經(jīng)前體細(xì)胞的形成是細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的關(guān)鍵步驟。巢蛋白(nestin)是神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，以此為標(biāo)志我們對(duì)分化早期異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)作用下神經(jīng)前體細(xì)胞的差異進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，在8+0天，經(jīng)異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)后nestin免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞有較明顯的差異，流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)結(jié)果顯示，異補(bǔ)骨脂甲素能顯著增加ES細(xì)胞分化而來(lái)的nestin陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞比例，參見(jiàn)圖2。圖2是異補(bǔ)骨脂甲素能顯著增加ES細(xì)胞分化而來(lái)的nestin陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞比例圖，(維A酸RA為陽(yáng)性對(duì)照)其中圖2A是流式檢測(cè)結(jié)果圖；圖2B是A圖的定量分析柱形圖。實(shí)施例3:免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外定向分化為神經(jīng)細(xì)胞收集分化8+6天的異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)組細(xì)胞樣本，用純冷甲醇固定10min，再用牛血清封閉處理30min，然后加入一抗(1)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白monoclonalmouseanti-GFAP，1:200稀釋，(2)神經(jīng)元細(xì)胞特異性蛋白monoclonalmouseanti-P-tubulinIII，1:100稀釋，4。C孵育過(guò)夜。第二天加入二抗FITC畫(huà)Conjugatedgoatanti-MouseIgG或Rhodamine國(guó)Conjugatedgoatanti-RabbitIgG，1:1000稀釋，37'C孵育1.5h。無(wú)熒光甘油封片后用熒光顯微鏡觀察，拍照記錄。參見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示，異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化8+6天，出現(xiàn)有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽(yáng)性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞特異性微管蛋白(J3-Tubulinin)陽(yáng)性的神經(jīng)元細(xì)胞，其中以P-TubulinIII陽(yáng)性細(xì)胞最為多見(jiàn)，呈現(xiàn)紅色熒光，多分布于克隆邊緣，胞體為圓形、橢圓形，突起為一個(gè)至數(shù)個(gè)，長(zhǎng)度大小不一，其細(xì)長(zhǎng)突起彼此相連聯(lián)交織成復(fù)雜的網(wǎng)狀，它們可能是不同發(fā)育階段的神經(jīng)元細(xì)胞；少數(shù)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP，呈現(xiàn)綠色熒光。圖3中A:P-tubulinIII陽(yáng)性細(xì)胞(紅色)，B:GFAP陽(yáng)性細(xì)胞(綠色)。實(shí)施例4:RT-PCR實(shí)驗(yàn)鑒定異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外定向分化為神經(jīng)細(xì)胞收集分化d8+6由異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)組和溶劑對(duì)照組細(xì)胞，按照Trizolreagent說(shuō)明書(shū)提取總mRNA。引物序列與實(shí)驗(yàn)條件如下(表l):表1.引物序列和PCR反應(yīng)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR反應(yīng)體系94。C變性30s，72。C延伸60s，P-tubulinIII、GFAP、P-actin退火溫度分別是58。C、58°C、55°C，分別循環(huán)40、40、30輪，末次循環(huán)后72"再延伸10min，4"C冷卻保存。PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察及拍照分析。參見(jiàn)圖4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化8+6天時(shí)，卩-tubulinm和GFAP基因有表達(dá)，且表達(dá)量與溶劑對(duì)照組比較明顯增加。實(shí)施例5:異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究BMSCs具有干細(xì)胞的自我復(fù)制和多向分化潛能兩個(gè)特性，可以向多種結(jié)締組織和部分來(lái)源于外胚層和中胚層的組織分化，其中包括神經(jīng)細(xì)胞。1.BMSCs的分離培養(yǎng)取大鼠股骨、脛骨骨髓置于離心管中，微吸管反復(fù)吸吹骨髓，形成分散的單細(xì)胞懸液，加入配制的PERCOLL分離液，密度為11073g/mL，離心2000r/min，20min后可見(jiàn)中間有一層約l2mm厚的白色層，其成分主要為MSCs，仔細(xì)用吸管吸取這一層，再用PBS離心后，按lxl(^個(gè)/mL細(xì)胞密度接種至含IOn/。FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2.將傳至第3，5，7代的BMSCs按照0.4xl()S/ml接種于事先放置有消毒蓋玻片的六孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%80%融合時(shí)，棄培養(yǎng)液，加入含bFGF和20%FCS的L-DMEM培養(yǎng)液預(yù)誘導(dǎo)24h后，更換培養(yǎng)液，PBS洗兩次，再分別加入不同濃度異補(bǔ)骨脂甲素對(duì)BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白。實(shí)施例6:異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells,NSCs)是神經(jīng)系統(tǒng)終生保持增殖能力和分化潛能的細(xì)胞，可通過(guò)對(duì)稱或不對(duì)稱分裂，生成新的干細(xì)胞和分化潛能逐漸降低的子細(xì)胞，最終生成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞。取孕13天胎鼠大腦，在無(wú)菌條件下用機(jī)械法將其制備成單細(xì)胞懸液，加入含B27,bFGF和insulin的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。NSC培養(yǎng)710天后，形成神經(jīng)球，呈懸浮狀生長(zhǎng)。收集NSCs集落，以800r/min離心5min后，計(jì)數(shù)后接種于預(yù)先用多聚賴氨酸處理過(guò)的6孔板內(nèi)，加入含不同濃度異補(bǔ)骨脂甲素的DMEM/F12分化培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白。異補(bǔ)骨脂甲素對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞這一過(guò)程具有顯著誘導(dǎo)分化作用。異補(bǔ)骨脂甲素有望成為一種以神經(jīng)為作用靶點(diǎn)的新型誘導(dǎo)分化劑。由于在異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程中富含發(fā)育依賴性生物信息，能提供很多靶點(diǎn)供藥效評(píng)價(jià)用，因此可將神經(jīng)發(fā)育依賴性特殊基因和蛋白表達(dá)等能夠反映神經(jīng)細(xì)胞功能的指標(biāo)，借助PCR、免疫組化、WesternBlot等技術(shù)對(duì)異補(bǔ)骨脂甲素的藥效進(jìn)行深入評(píng)價(jià)，以論證異補(bǔ)骨脂甲素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和功能改善的促進(jìn)作用。無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開(kāi)的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。本發(fā)明涉及的序列<110>浙江大學(xué)<120>異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的用途<160>6<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)卩-actinmRNA序列設(shè)計(jì)的PCR檢測(cè)上游引物序列<400>1TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)(3-actinmRNA序列設(shè)計(jì)的PCR檢測(cè)下游引物序列<400>2CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG30<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)p-tubulinIIImRNA序列設(shè)計(jì)的PCR檢測(cè)上游引物序列<400>3GGTGTCCGAGTACCAGCAGT20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>根據(jù)p-tubulinIIImRNA序列設(shè)計(jì)的PCR檢測(cè)下游引物序列<400>4GAAGAGCACCAGAGACCCAG20<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)GFAPmRNA序列設(shè)計(jì)的PCR檢測(cè)上游引物序列<400〉5AAGCTCCAAGATGAAACCAACCTGA25<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)GFAPmRNA序列設(shè)計(jì)的PCR檢測(cè)下游引物序列<400〉6GCAAACTTAGACCGATACCACTC2權(quán)利要求1.一種異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)干細(xì)胞體外定向分化為單一類型神經(jīng)細(xì)胞在制備干細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用，所述干細(xì)胞是指胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。2.—種異補(bǔ)骨脂甲素能誘導(dǎo)干細(xì)胞體外定向分化獲得的神經(jīng)細(xì)胞在制備修復(fù)重建損傷神經(jīng)組織的促細(xì)胞分化劑中應(yīng)用，所述干細(xì)胞是指胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。3.—種異補(bǔ)骨脂甲素能誘導(dǎo)干細(xì)胞體外定向分化獲得神經(jīng)細(xì)胞在構(gòu)建藥效篩選與評(píng)價(jià)模型中應(yīng)用，所述干細(xì)胞是指胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的異補(bǔ)骨脂甲素的應(yīng)用，其特征是所述的異補(bǔ)骨脂甲素能誘導(dǎo)干細(xì)胞體外定向分化獲得神經(jīng)細(xì)胞是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)采用經(jīng)典的4-/4+法進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，胚胎干細(xì)胞按900個(gè)/30pl細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿蓋內(nèi)表面，翻轉(zhuǎn)后形成懸滴，置于培養(yǎng)箱中3天，(2)將已形成擬胚體的懸滴轉(zhuǎn)入盛有IOml分化培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內(nèi)，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)l天，第二天加入受試藥物異補(bǔ)骨脂甲素與擬胚體懸浮共培養(yǎng)4天，(3)再將已形成的擬胚體轉(zhuǎn)入預(yù)鋪多聚鳥(niǎo)氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，評(píng)價(jià)神經(jīng)樣細(xì)胞的指標(biāo)是出現(xiàn)細(xì)胞突起長(zhǎng)度為胞體直徑3-5倍以上。全文摘要本發(fā)明提供異補(bǔ)骨脂甲素誘導(dǎo)干細(xì)胞(包括胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)體外定向分化為單一類型神經(jīng)細(xì)胞在制備干細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用，可在制備修復(fù)重建損傷神經(jīng)組織的促細(xì)胞分化劑中應(yīng)用，也可在構(gòu)建藥效篩選與評(píng)價(jià)模型中應(yīng)用。本發(fā)明開(kāi)拓了異補(bǔ)骨脂甲素的新用途，為異補(bǔ)骨脂甲素中藥防治作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也為藥物調(diào)控再生醫(yī)學(xué)或組織工程提供依據(jù)。文檔編號(hào)A61L27/38GK101273983SQ20081006140公開(kāi)日2008年10月1日申請(qǐng)日期2008年4月25日優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日發(fā)明者俞永平,吳佳瑩,朱丹雁,梅宇欽,樓宜嘉,歐麗麗,王志強(qiáng),王歡歡,許敏華申請(qǐng)人:浙江大學(xué)