專利名稱：：Tat-n25多肽在治療銀屑病等細(xì)胞生長異常皮膚病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種融合多肽在治療銀屑病等細(xì)胞生長異常皮膚病中的用途，屬于醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：銀屑病俗稱"牛皮癬"，是皮膚科常見、多發(fā)的頑固性皮膚病之一。根據(jù)銀屑病的臨床和病理特征，一般可分為尋常型、關(guān)節(jié)炎型、膿皰型、掌跖膿皰病、紅皮病型、及連續(xù)性肢端皮炎六種類型。因該病頑固難治，因此被列為當(dāng)今世界皮膚科領(lǐng)域的重要研究課題。銀屑病病因不明，其主要病理特點是表皮細(xì)胞異常增殖及角化不全，具體病理特征主要表現(xiàn)為l.表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和分化不全；2.真皮淺層微血管擴(kuò)張；3.炎癥反應(yīng)。臨床上以往多以白血寧、乙亞胺、乙雙嗎啉、環(huán)磷酰胺等細(xì)胞毒類抗癌藥，地塞米松、強(qiáng)的松、倍他米松等激素類藥物，免疫抑制劑以及表皮細(xì)胞分化促進(jìn)劑維曱酸等藥物治療。因以上藥物及其配制的各種制劑，只能作用于銀屑病的單一病理變化并對機(jī)體肝、腎和免疫功能有嚴(yán)重?fù)p壞作用；部分患者用后雖有一定的短期效果，但停藥后病情反跳加重惡化的毒副作用，已使不少患者深受其害。治愈或全面改善銀屑病病情的有效方法是很需要的。這種方法應(yīng)該理想地控制表皮細(xì)胞異常增殖及角化不全并抑制在病患部位的炎癥反應(yīng)。本發(fā)明中敘述的融合多肽就滿足了這一需要并具備上述優(yōu)點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種融合多肽，該融合多肽包括抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞分化的多肽和穿透細(xì)胞膜的多肽或分子，穿透細(xì)胞膜的多肽或分子將抑制細(xì)胞生長的多肽帶入細(xì)胞中。經(jīng)過實驗證明了這一融合多肽具有抑制表皮細(xì)胞生長、促進(jìn)表皮細(xì)胞分化的能力，此外，該融合多肽也能有效地抑制銀屑病人的病理變化，并取得顯著療效。融合多肽已在專利申請200710051286.6公開，融合多肽包括抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞分化的多肽和穿透細(xì)胞膜的多肽或分子，抑制細(xì)胞生長的多肽與穿透細(xì)胞膜的多肽或分子通過化學(xué)共價健連接，或抑制細(xì)胞生長的多肽與穿透細(xì)胞膜的多肽在細(xì)胞中表達(dá)成融合多肽。融合多肽的抑制細(xì)胞生長的多肽與純化融合多肽的標(biāo)簽蛋白連接。抑制細(xì)胞生長促進(jìn)細(xì)胞分化的多肽是由磷脂酰肌醇-3-激酶的調(diào)節(jié)亞基p55PIK中氨基端25個氨基酸殘基組成的N-25多肽，其序列為甲硫氨酸-天門冬氨酸-精氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸-丙氨酸-天門冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-纈氨酸-曱硫氨酸-曱硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-曱石克氨酸(MDRDDADWREV羅PYSTELIFYIEM),或是從該多肽氨基端連續(xù)或間斷地缺失或取代1-12中任意數(shù)值個氨基酸殘基得到的多肽之一，或是將所述多肽的序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的添加得到的具有抑制細(xì)胞生長活性的多肽之一。穿透細(xì)胞膜的多肽是衍生于HIV病毒TAT蛋白的多肽，其序列為酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸-谷酰胺-精氨酸-精氨酸-精氨酸(YGRKKRRQRRR)。TAT多肽在TAT-N25融合多肽中的作用為幫助N25多肽進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮N25的藥效作用。除了TAT外，目前已知有其他多肽，比如來自x蛋白的TDT多肽，序列為xxxxx,也具有類似的幫助多肽穿透細(xì)胞膜的功能。其他分子如多聚賴氨酸，某些脂質(zhì)體也能幫助N25或其他多肽穿透細(xì)胞膜。我們預(yù)計上述分子和N24通過共價或非共價結(jié)合組成新的化合物也應(yīng)具有TAT-N25類似的藥效。用于純化融合多肽的標(biāo)簽蛋白是寡聚組氨酸標(biāo)簽，其中組氨酸數(shù)目為5-10中的任意數(shù)值個。抑制細(xì)胞生長的N25多肽與穿透細(xì)胞膜的TAT多肽或分子通過化學(xué)共價健連接成融合多肽(TAT-N25多肽)在治療4艮屑病及其他皮膚細(xì)胞增生和分化異常導(dǎo)致的疾病中的用途。治療細(xì)胞生長異常相關(guān)皮膚病及銀屑病的TAT-N25多肽藥物，將TAT-N25多肽以及藥學(xué)上可接受的藥劑配制而成的多肽軟膏。TAT-N25多肽軟膏，其特征在于按重量百分比計十八醇3%;單硬脂酸甘油酯6%;甘油10%;液狀石蠟10%;白凡士林3%;三乙醇胺0.1%;十二烷基辟u酸鈉0.2%;輕苯乙酯0.1%;TAT-N25多肽0.2%;水60%;尿素7.4%。融合多肽藥物應(yīng)包括含有或應(yīng)用該融合多肽以藥學(xué)上可接受的藥劑進(jìn)行組合的內(nèi)外用藥物。N25多肽也能和其他能幫助N25進(jìn)入細(xì)胞膜的多肽或其他分子通過共價或非共價鏈接制成新的具有治療細(xì)胞生長異常相關(guān)皮膚病及銀屑病的藥物。融合多肽藥物在治療相關(guān)皮膚病皮膚炎癥、多基因遺傳背景下細(xì)胞失常的免疫性疾病、表皮過度增殖與分化異常與細(xì)胞生長異常相關(guān)疾病比如4艮屑病中的用途以及通過不同方式應(yīng)用該藥物治療這些疾病的途徑。TAT-N25多肽軟膏治療4艮屑病的機(jī)理為1.抑制上皮細(xì)胞增生；2.促進(jìn)上皮細(xì)胞分化；3.抑制新生血管生成；4.抑制淋巴細(xì)胞分裂，減少炎癥因子合成分泌。該多肽軟膏的使用方法極其簡便將軟膏均勻涂抹在患者皮膚上，每曰3次，療程為10天一1個月。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有治愈率高、安全副作用小等治療優(yōu)點，為銀屑病患者提供了一種理想的藥物。具體實施方式下面借助具體實驗及其數(shù)據(jù)結(jié)果對本發(fā)明進(jìn)行論證說明，但應(yīng)該說明的是，這些實施例子并不對本發(fā)明加以限制。TAT-N25多肽在下列實驗中證明其治療4艮屑病的有效性，包括但不限于下列實驗實例1TAT-N25多肽抑制角質(zhì)細(xì)胞生長和DNA合成用人角質(zhì)細(xì)胞系HACAT纟田胞檢測TAT-N25融合多肽對細(xì)胞生長的影響。HACAT細(xì)胞在含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM),37°C，5°化02/95%空氣培養(yǎng)條件下培養(yǎng)于1Q厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿，將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，加入多肽至最終濃度為15微克/毫升，同時培養(yǎng)空白組和尿素組用以對照，培養(yǎng)24小時收取細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀分析這些細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。TAT-N25多肽原液溶于6M尿素，6M尿素指的是每升水中含有6摩爾尿素，以下都簡稱為6M尿素。實驗結(jié)果表明在這一劑量下表達(dá)TAT-N25融合多肽對細(xì)胞凋亡沒有明顯影響，增加G0/G1期細(xì)胞數(shù)，其作用見下表l。表l:TAT-N25對細(xì)胞周期的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>DNA合成是細(xì)胞增殖的標(biāo)志。下一個實驗中，我們;險測TAT-N25對細(xì)胞DNA合成的影響。因為BrdU為胸腺嘧啶類似物，^DNA合成的S期可摻入到DNA中，摻入到DNA的BrdU經(jīng)過免疫染色后，利用流式細(xì)胞儀通過檢測熒光強(qiáng)度的變化來分析DM的合成情況，空白組和尿素組用以對照。結(jié)果顯示加入TAT-N25多肽后，腫瘤細(xì)胞中有DNA合成的S期的細(xì)胞數(shù)目變化不大，但平均BrdU的摻入量較空白組有明顯減小，見表2，這說明融合多肽抑制了DNA的合成，減少了腫瘤細(xì)胞的增殖。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實例2TAT-N25多肽抑制小鼠陰道上皮細(xì)胞層增生雌性小鼠預(yù)先注射雌激素如乙烯雌酚7天，使其處于雌激素生理周期。陰道給予0.2(wt)%的TAT-N25多肽軟膏7天，末次給藥后腹腔注射秋水仙堿以終止細(xì)胞分裂。取小鼠陰道組織，固定，染色，觀察陰道上皮細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)。0.2(wt)°/TAT-N25多肽軟膏為按重量百分比計十八醇3%;單硬脂酸甘油酯6%;甘油10%;液狀石蠟10%;白凡士林3%;三乙醇胺0.1%;十二烷基石克酸鈉0.2%;羥苯乙酯0.1°/。；TAT-N25多肽0.2%;水60%;尿素7.4%。試驗結(jié)果如表3，表明TAT-N25多肽有效抑制陰道上皮細(xì)胞的有絲分裂。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實例3TAT-N25多肽促進(jìn)小鼠尾鱗片表皮細(xì)胞生成的影響試驗取小鼠，將O.2(wt)y。的TAT-N25多肽軟膏直接在尾部外涂給藥7天，每日3次，取尾根部皮膚，固定，染色，測量鼠尾表皮厚度和顆粒形成情況。試驗結(jié)果如表4，表明TAT-N25多肽軟膏有促進(jìn)鼠尾顆粒層形成的作用。表4:TAT-N25多肽促進(jìn)鼠尾細(xì)胞顆粒層形成<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實例4TAT-N25多肽抑制炎癥因子分泌含濃度為30微克/亳升TAT-N25多肽培養(yǎng)液1升孵育淋巴細(xì)胞2天，測定培養(yǎng)液中IL-1、6、8，TNF-a和IFN-Y的含量。結(jié)果表明TAT-N25多肽抑制淋巴細(xì)胞分泌炎癥因子。實驗5TAT-N25多肽軟膏治療銀屑病人實例0.2(wt)。/。的TAT-N25多肽軟膏涂抹于銀屑病患者患處皮膚，每日3次，結(jié)果如表5,表明TAT-N25多肽治療銀屑病效果明顯。表5:TAT-N25多肽軟膏治療銀屑病病人結(jié)果總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、TAT-N25多肽在治療與細(xì)胞生長異常相關(guān)皮膚病中的用途。2、TAT-N25多肽在治療4艮屑病的用途。3、TAT-N25多肽藥物，其特征在于應(yīng)包括含有或應(yīng)用TAT-N25多肽以及藥學(xué)上可接受的藥劑進(jìn)行組合的治療用藥物。4、治療細(xì)胞生長異常相關(guān)皮膚病的TAT-N25多肽藥物，其特征在于將TAT-N25多肽以及藥學(xué)上可接受的藥劑配制而成的多肽軟膏。5、治療4艮屑病的TAT-N25多肽藥物，其特征在于將TAT-N25多肽以及藥學(xué)上可接受的藥劑配制而成的多肽軟膏。6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的TAT-N25多肽藥物，其特征在于按重量百分比計十八醇3%;單硬脂酸甘油酯6%;甘油10%;液狀石蠟10%;白凡士林3%;三乙醇胺0.1%;十二烷基硫酸鈉0.2%;羥苯乙酯0.1%;TAT-N25多肽0.2%;水60%;尿素7.4%。7、N25多肽和其他能幫助N25進(jìn)入細(xì)胞膜的多肽或其他分子通過共價r;H梭市'J風(fēng)薪的興^》5打朔胞」物。全文摘要本發(fā)明公開了TAT-N25多肽在治療銀屑病等與細(xì)胞生長異常相關(guān)皮膚病中的用途。該多肽藥物組合物能夠抑制上皮細(xì)胞增生，調(diào)節(jié)表皮增生及分化，使皮膚角化過程正?；?；此外，還能抑制淋巴細(xì)胞分裂，減少炎癥因子合成分泌，調(diào)節(jié)人體免疫功能。文檔編號A61P17/06GK101244258SQ20081004711公開日2008年8月20日申請日期2008年3月21日優(yōu)先權(quán)日2008年3月21日發(fā)明者夏獻(xiàn)民申請人:夏獻(xiàn)民