專利名稱：一種具有治療缺血再灌注損傷功能的含氫注射液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于治療缺血再灌注損傷的含氫 注射液。
背景技術(shù)：
缺血是臨床疾病中常見病因之一。缺血性疾病通?？梢栽谠缙诓捎萌?栓和抗自由基損傷等措施來治療，但有可能繼發(fā)缺血再灌注損傷，它是腦 梗塞等疾病重要的病理生理過程。在醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，氫氣已經(jīng)被用于飽和 潛水及減壓病的治療。至今未見有關(guān)采用含氫注射液防治缺血再灌注損傷 的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種含氫注射液，可用于治療缺血再灌注導(dǎo)致的組織損傷 和器官功能障礙。 制備方法如下
1. 脫氣處理
將生理鹽水、糖鹽水或碳酸氫鈉等醫(yī)用注射液軟包裝常溫中放置于
0.4—0.8絕對大氣壓 (atmosphere absolute, ATA)的低壓下2—24小時，再 在常溫、常壓下放置，使過飽和氣體充分析出，隨后抽除析出的氣體；
2. 低溫預(yù)處理
將脫氣處理后的注射液軟包裝置于2—1(TC充分冷卻，以增加對氫氣的 溶解度；
3. 注入純氫氣
從低溫處理后的注射液軟包裝中抽取占總體積5~15%的注射液，常壓 下注入純氫氣使軟包裝充盈。4.加壓助溶
將注入氫氣后的注射液軟包裝在低溫下持續(xù)加壓12~24小時，使氫氣 充分溶入注射液，減壓后取出，置于(T5"C保存?zhèn)溆?，穩(wěn)定24小時后即可 使用。
本發(fā)明注射液經(jīng)動物實驗證明對大鼠腦缺血再灌注損傷模型能明顯 減少腦梗死體積、減輕腦組織損傷、減少神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡數(shù)量、降低海 馬和大腦皮層中凋亡酶的活性；在心肌缺血再灌注、腎臟缺血再灌注和肝 臟缺血再灌注的損傷模型中也觀察到了類似的效果。因此本發(fā)明含氫注射 液可用作治療缺血再灌注損傷的藥物。
圖1為大鼠腦缺血再灌注后梗死體積的比較圖譜，其中，A:正常對
照組；B:生理鹽水組；C:含氫注射液治療組。
圖2為大鼠腦缺血再灌注后尼氏染色圖譜，其中，A:正常對照組， Al:皮層50x， A2波層400x， A3:海馬50x， A4:海馬400x; B:陰性對照組， Bl:皮層50x， B2:皮層400x， B3:海馬50x， B4:海馬400x; C:低劑量組， Cl:皮層50x， C2:皮層400x， C3:海馬50x， C4:海馬400x; D:中劑量組， Dl:皮層50x， D2:皮層400x， D3:海馬50x， D4海馬400x; E:高劑量組， El:皮層50x, E2:皮層400x, E3:海馬50x， E4:海馬400x。
圖3為大鼠腦缺血再灌注后尼氏染色400X鏡下細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計圖。
圖4為大鼠腦缺血再灌注后Tund染色細(xì)胞凋亡圖譜。
圖5為大鼠腦缺血再灌注后Tunel染色400X鏡下凋亡細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計圖。
圖6為大鼠腦缺血再灌注后皮層和海馬的凋亡酶caspase—3活性統(tǒng)計圖。 圖7為大鼠腦缺血再灌注后皮層和海馬的凋亡酶caspase-12活性統(tǒng)計圖。
具體實施例方式
現(xiàn)結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述。實施例僅用作說明本發(fā)明， 不能視為對本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的限制。 實施例1.制備含氫生理鹽水注射液
1. 脫氣處理
將生理鹽水注射液500 ml軟包裝袋置于低壓艙中，常溫下以0.4 ATA 減壓處理2小時，取出后常溫、常壓下放置4小時，將析出氣體用注射器 抽除；
2. 低溫預(yù)處理
常壓下將上述脫氣處理后的注射液軟包裝袋置于2T:環(huán)境下2小時以 充分冷卻；
3. 注入純氫氣
從上述低溫處理后的軟包裝袋中抽出50ml的生理鹽水，常壓下注入2 'C的純氫氣(上海基量標(biāo)準(zhǔn)氣體有限公司氫標(biāo)準(zhǔn)氣，下同)50ml;
4. 加壓助溶
將注入氫氣后的注射液軟包裝袋放入加壓艙，5'C下以5 ATA持續(xù)加壓 12小時，隨后減壓至常壓，置3~5匸保存?zhèn)溆茫?4小時后即可使用。經(jīng)檢 測，常溫常壓下所制得的含氫注射液氫氣的體積百分比濃度為1.7% (ml/ml)。
實施例2.制備含氫葡萄糖鹽水注射液
1. 脫氣處理
將葡萄糖鹽水注射液500 ml軟包裝袋置于低壓艙中，常溫下以0.8 ATA 減壓處理24小時，取出后常溫、常壓下放置24小時，將析出氣體用注射 器抽除；
2. 低溫預(yù)處理 常壓下將上述脫氣處理后的注射液軟包裝袋置于l(TC環(huán)境下8小時以 充分冷卻；
3. 注入純氫氣
從上述低溫處理后的軟包裝袋中抽出25 ml的注射液，常壓下注入IO 。C的純氫氣25 ml;
4. 加壓助溶
將注入氫氣后的注射液軟包裝袋放入加壓艙，rC下以7ATA持續(xù)加壓 24小時，隨后減壓至常壓，置3—5"C保存?zhèn)溆茫?4小時后即可使用。經(jīng)檢 測，常溫常壓下所制得的含氫注射液氫氣的體積百分比濃度為1.4% (ml/ml)。
實施例3.制備含氫碳酸氫鈉注射液
1. 脫氣處理
將氫碳酸氫鈉注射液100 ml軟包裝袋置于低壓艙中，常溫下以0.6 ATA 減壓處理20小時，取出后常溫、常壓下放置20小時，將析出氣體用注射 器抽除；
2. 低溫預(yù)處理
常壓下將上述脫氣處理后的注射液軟包裝袋置于6t環(huán)境下4小時以 充分冷卻；
3. 注入純氫氣
從上述低溫處理后的軟包裝袋中抽出15 ml的注射液，常壓下注入6°C 的純氫氣15 ml;
4. 加壓助溶
將注入氫氣后的注射液軟包裝袋放入加壓艙，3"C下以6 ATA持續(xù)加壓 20小時，隨后減壓至常壓，置3~5"保存?zhèn)溆茫?4小時后即可使用。經(jīng)檢 測，常溫常壓下所制得的含氫注射液氫氣的體積百分比濃度為0.8%
(ml/ml) o
實施例4.制備含氫生理鹽水注射液
1. 脫氣處理
將生理鹽水注射液500 ml軟包裝袋置于低壓艙中，常溫下以絕對壓為 0.5 ATA減壓處理12小時，取出后常溫、常壓下放置8小時，將析出氣體 用注射器抽除；
2. 低溫預(yù)處理
常壓下將上述脫氣處理后的注射液軟包裝袋置于4'C環(huán)境下2小時以充
分冷卻；
3. 注入純氫氣
從上述低溫處理后的軟包裝袋中抽出75 ml的生理鹽水，常壓下注入4 。C的純氫氣75 ml;
4. 加壓助溶
將注入氫氣后的注射液軟包裝袋放入加壓艙，5"C下以5ATA持續(xù)加壓 22小時，隨后減壓至常壓，置3 5"C保存?zhèn)溆茫?4小時后即可使用。經(jīng)檢 測，常溫常壓下所制得的含氫注射液氫氣的體積百分比濃度為2.0% (ml/ml)。
實施例5.制備含氫生理鹽水注射液
1. 脫氣處理
將生理鹽水注射液500 ml軟包裝袋置于低壓艙中，常溫下以0.4 ATA 減壓處理24小時，取出后常溫、常壓下放置12小時，將析出氣體用注射 器抽除；
2. 低溫預(yù)處理
常壓下將上述脫氣處理后的注射液軟包裝袋置于2。C環(huán)境下8小時以充 分冷卻；
3. 注入純氫氣
從上述低溫處理后的軟包裝袋中抽出75 ml的生理鹽水，常壓下注入2 r的純氫氣90ml;
4. 加壓助溶
將注入氫氣后的注射液軟包裝袋放入加壓艙，5'C下以7ATA持續(xù)加壓 24小時，隨后減壓至常壓，置3^5"C保存?zhèn)溆茫?4小時后即可使用。經(jīng)檢 測，常溫常壓下所制得的含氫注射液氫氣的體積百分比濃度為2.4% (ml/ml)。
本發(fā)明方法制備的含氫注射液在常溫常壓下經(jīng)中國科學(xué)院大連化學(xué)物 理研究所測得氫氣的體積百分比濃度為0.8~2.4% (ml/ml)。 動物實驗
實驗動物SD雄性大鼠，體重22(T250克，購于第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動 物中心。
取大鼠65只，雄性，隨機(jī)分成5組正常對照組、陰性對照組、實施 例l制備的注射液低、中、高劑量治療組，每組13只。除正常對照組外， 其余各組大鼠先制備成腦缺血再灌注損傷模型，再灌注后10分鐘，分別腹 腔注射生理鹽水和本發(fā)明實施例1制備的注射液。本發(fā)明注射液按體重低 劑量組注射0.3 ml/100 g，中劑量組注射0.6 ml/100 g，高劑量組注射0.9 ml/100 g，陰性對照組和正常對照組均注射生理鹽水0.6 ml/100 g。
大鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備
參照Longa、Kuge等報道的方法(詳見Kuge Y， MinematsuK, Yamaguchi T, et al. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke, 1995,26:1655-58)，采用頸外動脈插入線 栓法造模。SD大鼠用N20/U (70:30)加1%七氟烷麻醉，仰臥固定，頸正中 切口，鈍性分離暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈與頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)端，游離其主干備用。尼龍線長40mm，直徑0.2CT0.23腿， 一端約O. 5 cm 長度上均勻涂布聚胺酯清漆，使其頭端成一光滑的錐型，頭端直徑小于O. 25 mm，從右側(cè)頸外動脈入口，至右頸總動脈后，轉(zhuǎn)向右頸內(nèi)動脈入顱推進(jìn)17~19 mm，微遇阻力時停止，完成一側(cè)大腦中動脈的阻塞。再灌注時緩慢地輕拉 線栓使其頭端回到頸外動脈內(nèi)，可實現(xiàn)大腦中動脈再灌注。本實驗采用的 動物模型均為缺血90分鐘后再灌注。
上述各組大鼠在腹腔注射24小時后處死,分別取腦組織進(jìn)行TTC、HE、 尼氏、細(xì)胞凋亡染色，并提取海馬和大腦皮層腦，測定其中凋亡酶的活性。 實驗結(jié)果如下-
1. 觀察對大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積的影響 取各組動物腦組織，進(jìn)行TTC染色，TTC染色是檢測組織缺血梗死體積
的經(jīng)典方法，染色后缺血區(qū)顯示為白色，正常組織為紅色。結(jié)果見圖l，圖 l中，A.正常對照組；B.陰性對照組；C.本發(fā)明注射液中劑量治療組。圖l 顯示，陰性對照組梗死范圍分布在缺血側(cè)大腦皮層、海馬和尾核；用ImageJ 軟件算出各腦片截面面積和梗死區(qū)面積，再用所有連續(xù)切片梗死面積之和 除以所有連續(xù)切片橫截面面積之和，得到的商數(shù)即約為梗死體積占全腦體 積的比例為(20.7±4.5) %;本發(fā)明中劑量治療組梗死范圍僅出現(xiàn)在缺血 側(cè)部分皮層，梗死體積占全腦體積(12.5±3.6) %。結(jié)果表明，本發(fā)明注 射液可明顯減少腦梗死體積。
2. 觀察對大鼠腦缺血再灌注后24小時大腦皮層與海馬神經(jīng)元數(shù)量的 影響
取各組動物腦組織，石蠟固定并切片，采用經(jīng)典的尼氏染色(詳見 Li Z, Liu W， Kang Z, Lv S, Han C， Yun L, Sun X, Zhang JH.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Brain Res. 2008; 1196(2): 151-156)，結(jié)果見圖2和圖3。在尼氏染色中尼氏
體清晰可辨，胞核、核仁也非常清晰，而且很容易區(qū)分軸突和樹突，在生 理情況下，尼氏體大而數(shù)量多，反映神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng)，在 神經(jīng)元受損時，尼氏體的數(shù)量可減少甚至消失。圖2中可以清晰顯示具有
生物活性的神經(jīng)元細(xì)胞，在400X鏡下計數(shù)，將各組的細(xì)胞數(shù)繪制成圖3。 圖3中，園表示皮層，口表示海馬；Control組為正常對照組，HI組為陰性 對照組，H2l組為低劑量組，H22組為中劑量組，H23組為高劑量組。如圖 3示，與正常對照組相比，陰性對照組中缺血側(cè)大腦皮層與海馬的神經(jīng)元明 顯減少(* p <0.05， ** p <0.01)，說明腦缺血再灌注后大腦皮層與海馬 神經(jīng)元出現(xiàn)明顯損傷。本發(fā)明注射液低、中、高劑量組對腦缺血再灌注后 腦皮層與海馬神經(jīng)元均有改善，其中以中劑量0.6ml/100g組作用最明顯， 神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量和組織結(jié)構(gòu)均接近正常對照組。結(jié)果表明，本發(fā)明注射液 可減輕大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷。
3. 觀察對大鼠腦缺血再灌注后24小時大腦皮層與海馬細(xì)胞凋亡數(shù)量 的影響
取各組動物腦組織，石蠟固定并切片，采用Tunel染色(詳見Li Z， Liu W， Kang Z, Lv S， Han C, Yun L， Sun X， Zhang JH.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Brain Res. 2008; 1196(2): 151-156)，結(jié)果見圖4，圖4中分組同圖2。圖中被顯色細(xì)胞 為Tund染色的陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。在400X鏡下分別計數(shù)個組凋亡細(xì) 胞數(shù)，并由此繪制成圖5，圖5中分組如圖3。由圖5可見本發(fā)明注射液 低、中、高劑量組對腦缺血再灌注后缺血側(cè)大腦皮層與海馬細(xì)胞凋亡數(shù)量 減少，其中以中劑量組作用最明顯，接近于正常對照組水平(*p <0.05，
<0.01)。結(jié)果表明，本發(fā)明注射液可減少大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋 亡數(shù)量。
4. 觀察對大鼠腦缺血再灌注后24小時大腦皮層與海馬凋亡酶活性的 影響
取各組動物新鮮腦組織，采用熒光酶活性檢測(詳見Li Z, Liu W, Kang Z, Lv S, Han C， Yim L， Sun X, Zhang JH.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Brain Res. 2008; 1196(2): 151-156)，結(jié)果見圖6、圖7，分別是凋亡酶caspase-3和caspase-12
的活性比較，其分組情況同圖3。此兩圖均可見本發(fā)明注射液低、中、高 劑量組對腦缺血再灌注后缺血側(cè)大腦皮層與海馬中的凋亡酶的活性明顯減
小，其中以中劑量組0.6ml/100g作用最明顯，接近于正常對照組水平(*;> <0.05， <0.01)。結(jié)果表明，本發(fā)明注射液可降低大鼠腦缺血再灌注
后凋亡酶的活性。
上述實驗結(jié)果表明，本發(fā)明注射液可減少大鼠局灶性腦缺血后腦梗死 的體積、減少神經(jīng)細(xì)胞損傷、減少細(xì)胞凋亡數(shù)量、降低皮層和海馬中的凋 亡酶活性，在心肌缺血再灌注、腎臟缺血再灌注和肝臟缺血再灌注損傷模 型中觀察到類似效果。所以本發(fā)明可用作治療腦、心、腎等重要器官缺血 再灌注損傷的藥物。
ii
權(quán)利要求
1.一種含氫注射液，其特征在于常溫常壓下所含氫氣的體積百分比濃度為0.8～2.4％，所說的注射液選自生理鹽水、葡萄糖生理鹽水、碳酸氫鈉或其他醫(yī)用注射液。
2. 按權(quán)利要求1所述的含氫注射液，其特征在于常溫常壓下所 含氫氣的體積百分比濃度為1.6~2.1%。
3. 按權(quán)利要求1或2所說的含氫注射液，其特征在于所說的注 射液為生理鹽水。
4. 權(quán)利要求1或2所述含氫注射液的制備方法，步驟如下 (O脫氣處理將醫(yī)用注射液軟包裝，以0.4~0.8 ATA減壓處理2~24小時，再在常溫常壓下放置，使氣體充分析出，將析出的氣體 抽除；(2) 低溫預(yù)處理將脫氣處理后的注射液軟包裝置于2 10'C充 分冷卻；(3) 注入純氫氣從低溫處理后的注射液軟包裝中抽出占總體 積5 15%的注射液，常壓下注入純氫氣使軟包裝充盈；(4) 加壓助溶將注入氫氣后的注射液軟包裝在低溫下持續(xù)加 壓12~24小時，使氫氣充分溶入注射液即可。
5. 權(quán)利要求1或2所述含氫注射液用作治療缺血再灌注損傷藥 物的用途。
6. 權(quán)利要求3所述含氫注射液用作治療缺血再灌注損傷藥物的 用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于治療腦、心、腎等組織器官缺血再灌注損傷的注射液。制備方法為將醫(yī)用注射液軟包裝袋置于低壓下脫氣處理，抽除氣體后進(jìn)行低溫預(yù)處理，再注入氫氣進(jìn)行加壓助溶，使氫氣溶于注射液，在常壓下置4℃左右保存?zhèn)溆?。穩(wěn)定24小時后就可使用。動物實驗表明，本發(fā)明注射液可減少大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦梗死體積、減少神經(jīng)細(xì)胞損傷、減少細(xì)胞凋亡數(shù)量、降低大腦皮層和海馬中的凋亡酶的活性；還可減少心、腎缺血再灌注后損傷程度，保護(hù)心、腎缺血再灌注后心、腎功能。所以本發(fā)明含氫注射液可用作治療腦、心、腎等重要器官缺血再灌注損傷的藥物。
文檔編號A61K33/00GK101347451SQ20081003942
公開日2009年1月21日 申請日期2008年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月24日
發(fā)明者劉文武, 孫學(xué)軍, 康志敏, 合 張, 徐偉剛, 丁 茆, 蔡建美, 陶恒沂 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)