誘導(dǎo)核受體tr3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：：誘導(dǎo)核受體tr3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物及其應(yīng)用。技術(shù)背景TR3是一種人源NR4A1基因編碼的孤兒核受體，目前克隆的鼠源基因包括Nur77(小鼠)和NGF-IB(大鼠)，它們與近年鑒定的另外兩個近親成員NOT-l和NOR-l組成一個引人注目的亞家族。TR3是一種立早基因，許多外界信號，包括各種生長因子(如神經(jīng)生長因子、表皮生長因子、成纖維生長因子、血清生長因子)、鈣離子載體、KC1、佛波酯、視黃酸家族、Tax蛋白等都能誘導(dǎo)TR3的表達(dá)。TR3家族成員的結(jié)構(gòu)具有較為獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，其轉(zhuǎn)錄活性主要由N端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)AF1控制，C端配體結(jié)合區(qū)口袋狀結(jié)構(gòu)較淺，目前尚未發(fā)現(xiàn)內(nèi)源或外源的配體結(jié)合于此區(qū)。TR3的功能主要通過轉(zhuǎn)錄水平或通過蛋白水平的修飾進(jìn)行調(diào)控。作為轉(zhuǎn)錄因子，TR3可通過單體形式或同源二聚體或寡聚體形式，與視黃醇受體RXR形成異源二聚體形式，結(jié)合到特定DNA應(yīng)答元件上，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，在細(xì)胞生長、分化和凋亡過程發(fā)揮重要作用。TR3的表達(dá)與細(xì)胞增殖和凋亡均有關(guān)系，在各種腫瘤中是一個關(guān)鍵的調(diào)控基因，同時，近年發(fā)現(xiàn)它可能與HBV感染引起的肝炎和肝癌有關(guān)，還可能參與動脈粥樣硬化的調(diào)控。因而，TR3是人體內(nèi)一個重要的耙基因。由于許多抗癌藥、凋亡誘導(dǎo)劑以及某些中草藥成分可通過調(diào)控TR3的表達(dá)和調(diào)控TR3的活性起作用，TR3作為一個非常有用的分子耙點(diǎn)用于篩選新的抗癌藥物。TR3也是肝炎病毒蛋白作用的靶分子之一，肝炎病毒蛋白對于TR3轉(zhuǎn)錄因子蛋白正常調(diào)節(jié)功能的干擾，與慢性病毒性肝炎、肝纖維化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。另外，TR3亞家族成員在血管壁高表達(dá)可能促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)病，Nur77調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄激活參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)何血管平滑肌細(xì)胞增值；可以推測，Nur77位于細(xì)胞核內(nèi)可能促進(jìn)動脈粥樣硬化，位于細(xì)胞核外時轉(zhuǎn)錄激活功能被抑制，可能抑制動脈粥樣硬化病變進(jìn)展。因此，調(diào)控核受體TR3表達(dá)的化合物，可能在核受體TR3相關(guān)的癌癥、肝炎、動脈粥樣硬化等疾病的預(yù)防和治療中顯示出廣闊的前景。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供具有以下通式的能誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物其中R！為CH3、CHO或CH2OH;R2為H或OH;R3為H或OH;R4為糖類所組成的直鏈糖鏈或支鏈糖鏈。所述Ri最好為CHO，所述R2最好為H，所述R3最好為OH，所述糖類包括單糖、雙糖、三糖、四糖、五糖、六糖中的一種或一種以上的組合。所述糖類更具體地包括葡萄糖(f3-D-glucose)、葡萄糖(a-D-glucose)、鼠李糖(a-L-rhamnose)、半乳糖(P-D-galactose)、半乳糖(a-D-galactose)、甘露糖(a-L-mannose)、阿拉伯糖(卩-D-arabinose)、阿拉伯糖(a-D-arabinose)、木糖((3-D-xylose)、木糖(a-D-xylose)、核糖(卩-D-ribose)、核糖(a-D-ribose)、來蘇糖(卩-D-lyxose)、來蘇糖(a-D-lyxose)、夫糖(a-D-fucose)中的一種或者一種以上的組合。所述糖類還包括6-去氧糖、2，6-二去氧糖、2-甲醚-6-去氧糖，3-甲醚-6-去氧糖、4-甲醚-6-去氧糖中的一種或者一種以上的組合。本發(fā)明的誘導(dǎo)核受體TR3(Nur77)表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物的特征還在于Ri為CHO，R2為H，R3為OH，R4為"-(6-去氧-2-0-甲基)-葡萄糖基的化合物，化學(xué)名為毒毛旋花子-3-0-"-(6-去氧-2-0-甲基)-葡萄糖苷；或者R,為CHO，R2為H，R3為H，R4為a，L-鼠李糖基的化合物，化學(xué)
發(fā)明內(nèi)容5名為19-醛基-毛地黃-3-0-C(，L-鼠李糖苷；或者R,為CHO，R2為H，R3為OH，R4為,6-去氧-2-(9-甲基-阿洛糖基的化合物，化學(xué)名為毒毛旋花子-3-0--去氧-2-0-甲基)-阿洛糖苷；或者R,為CHO，R2為H，R3為OH，R4為AD-6-去氧-古洛糖基的化合物，化學(xué)名為毒毛旋花子-3-C^-D-(6-去氧)-古洛糖苷；或者為CHO，R2為H，R3為OH，R4為",D-6-去氧-阿洛糖基的化合物，化學(xué)名為毒毛旋花子-3-C^-D-(6-去氧)-阿洛糖苷；或者Ri為CH20H，R2為H，R3為H，R4為ct,L-鼠李糖基的化合物，化學(xué)名為坎納醇-3-Oct-L-鼠李糖苷；或者R!為CH20H，R2為H，R3為OH，R4為y，D-6-去氧-阿洛糖基的化合物，化學(xué)名為羊角拗醇-3-0-"-D-(6-去氧)-阿洛糖苷；或者R,為CHO，R2為OH，R3為OH，R4為",D-6-去氧-阿洛糖基的化合物，化學(xué)名為12-羥基-毒毛旋花子-3-0-^D-6-去氧-阿洛糖苷；或者R,為CHO，R2為H，R3為OH，R4為/-6-去氧-2-6>-甲基-阿洛糖基的化合物，化學(xué)名為12-羥基-毒毛旋花子-3-0_"-(6-去氧-2-0>甲萄-阿洛糖苷。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供所述誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物在制備誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用的更進(jìn)一步特征在于所述誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物在制備預(yù)防和治療癌癥、肝炎、動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明將植物桑科見血封喉屬植物見血封喉U""'a^tox/can'flLesch)的干燥莖粉碎成粗粉，將其浸入提取溶劑中冷提或在提取溶劑中加熱回流，然后過濾或離心等方法除去不溶物，再對所得提取溶液進(jìn)行減壓濃縮，之后應(yīng)用多種分離手段進(jìn)行分離得到一系列具有上述通式的強(qiáng)心苷類化合物。用于提取的溶劑可采用通常用于植物提取的溶劑，例如，可以單獨(dú)或組合使用甲醇、乙醇等低級醇、丙酮和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑及水。提取方法可采用常規(guī)方法，一般提取溫度為20-100。C，較好為40-8(TC，總提取時間為1-48小時，較好為4-16小時。提取液，通過過濾除去不溶物，減壓濃縮。將提取物分散于等體積的水中，依次用系統(tǒng)溶劑萃取法如先用氯仿萃取，再用正丁醇萃取。取正丁醇萃取部分，真空減壓干燥，得丁醇萃取物。隨后，用正相、反相、凝膠色譜法分離精制得到上述化合物。采用以單體化合物或者選擇其中任意兩個或多個化合物以不同比例進(jìn)行組合，使之與適宜的賦形劑相結(jié)合，按照常規(guī)方法制成的散劑、片劑、膠囊劑、丸劑、栓劑、滴丸劑、腸溶劑、注射劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑、酊劑、膏劑、噴霧劑等劑型，用于制備TR3的誘導(dǎo)劑及制備預(yù)防和治療TR3相關(guān)疾病如癌癥、肝炎、動脈粥樣硬化藥物。口服給藥可制成片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑等常用劑型，至少需要一種賦形劑，如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羥甲基纖維素等。除這些賦形劑以外，還可以使用硬脂酸鎂、月桂醇硫酸鈉、滑石粉等作為潤滑劑，糊精、結(jié)晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠等作為粘合劑，馬鈴薯淀粉、羥己基纖維素作為崩解劑。此外，還可以制成糖漿劑、乳劑、混懸劑等。對于這些劑型，可加入矯味劑、矯臭劑等。外用劑型包括栓劑、軟膏劑、外用散劑、噴霧劑、灌腸劑、乳劑等。這里所使用的固體或液體添加劑是在本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)經(jīng)常使用的。對于軟膏劑，選用由水、脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蠟、石蠟、液體石蠟、樹脂、高級醇、塑料、表面活性劑組成的疏水性基質(zhì)或親水性基質(zhì)等在內(nèi)的添加劑。制成注射劑時，一般是用注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、丙二醇、聚乙二醇等。必要時，還可以加入適宜的等張劑、助溶劑、抗氧化劑、防腐劑等。本發(fā)明所提供的一系列的強(qiáng)心苷類化合物，作為核受體TR3(Nm77)表達(dá)的誘導(dǎo)劑，由于現(xiàn)代研究表明核受體TR3的表達(dá)與多種人類疾病相關(guān)，因此本發(fā)明提供的強(qiáng)心苷類化合物可以作為誘導(dǎo)劑應(yīng)用于制備預(yù)防和治療與核受體TR3相關(guān)的人類疾病(如癌癥、肝炎、動脈粥樣硬化等)的藥物。圖1是實(shí)施例1所得的強(qiáng)心苷類化合物在不同濃度下對TR3的mRNA表達(dá)的影響圖。圖2是實(shí)施例1所得的強(qiáng)心苷類化合物在不同時間下對TR3蛋白質(zhì)表達(dá)的影響圖。具體實(shí)施方式以下通過具體實(shí)施例和附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明的方案及效果，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。實(shí)施例l本發(fā)明的強(qiáng)心苷類化合物及其制備取?？浦参镆娧夂?MaAtox/can'"Lesch)的干燥莖6Kg，粗粉碎后用8倍量60%乙醇加熱回流提取三次，每次兩小時，濃縮提取液得到乙醇提取物300g。將該提取物混懸于6升水中，分別用等體積乙酸乙酯和正丁醇萃取三次。正丁醇部位(35g)應(yīng)用硅膠柱色譜(-5.0x60cm)分離，并采用氯仿-甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫，得到5個餾分A-E。其中，餾分B(2.9g)經(jīng)過開放ODS柱色譜(-3.0x40cm)分離，用40%甲醇洗脫，得到兩個子餾分B1和B2。餾分B2(930mg)通過制備型反相高效液相RP-18柱色譜分離，流動相為35%甲醇，得到化合物2、3、4和5。餾分C(3.7g)經(jīng)過開放ODS柱色譜(03.0x40cm)分離得到兩個子餾分C1-C2，分別通過制備型高效液相純化，餾分Cl用33c/。甲醇洗脫，得到化合物1和6;餾分C2用35c/。甲醇洗脫，得到化合物7、8和9。所得化合物結(jié)構(gòu)如下表1所示表1:從見血封喉中分離得到的具有TR3誘導(dǎo)作用的強(qiáng)心苷類化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table>4CHOHOH6-deoxy-/S,D-gulopyranosylCHOHOH6-deoxy-/,D-allopyfanosyl6CH2OHHHa，L-RhamnopyranosylCH2OHHOH6-deoxy-/,D-allopyranosyl8CHOOHOH6-deoxy-AD-allopyranosyl9CHOOHOHy-D-javopyranosyl化合物1-9的結(jié)構(gòu)解析化合物l:白色無定形粉末，[a]l5+37.0°(c0.2,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反應(yīng)呈陽性，提示可能是強(qiáng)心苷類化合物。高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z587.2817[M+Na]+(calculatedforQoH440,。Na，587.2832)，確定其分子式為C3QH44O10。'HNMR(400MHz,気代吡啶)和13CNMR(100MHz,氖代吡啶)圖譜顯示甲型強(qiáng)心苷類化合物特征吸收信號內(nèi)酯羰基(c5c174.4)，一個雙鍵6.21，^117.7，175.6)，一個連氧亞甲基(<5H5.27,5.01,&73.6)，以及糖端基信號4.80,4100.8)，提示該化合物為單糖苷。在310.41(1H,s,H-19)和l.OO(3H，s,H-18)顯示的兩組質(zhì)子信號，說明該強(qiáng)心苷母核兩個角甲基其中一個被醛基化。在HMBC圖譜中，兩個重水可交換的活潑質(zhì)子信號35.49,4.94分別與(584.4(C-14)，73.6(C-5)相關(guān)，提示母核的14位和5位分別被羥基化。在ROESY圖譜中，相關(guān)信號OH-5/H-19,H-19/H-8y5，H-8"/H-18andH-12a/H-15a提示苷元的駢合方式為c&-A/B，/rara-B/C以及c&-C/D。另外，H-3質(zhì)子顯示為寬單峰，提示H-3處于平伏鍵。由于內(nèi)酯環(huán)的自由旋轉(zhuǎn)可以觀觀倒H-18/H-21和H-18/H-22的ROESY相關(guān)信號也說明H-17處于《位。以上結(jié)構(gòu)信息表明該強(qiáng)心苷的苷元為毒毛旋花子苷元。糖部分的端基質(zhì)子信號H-l'(lH,d,J^8.0Hz)的偶合常數(shù)提示單糖為"構(gòu)型。根據(jù)HMBC圖譜'，相關(guān)信號H-3/C-l'和H-l'/C-3提示糖連接在苷元3位；糖的2'位質(zhì)子信號[33.39(lH，dd，8.8，8.0)]與甲氧基碳信號(<560.8)相關(guān)，并且C-2'(385.0)的化學(xué)位移向低場位移，均說明C-2'發(fā)生甲醚化。結(jié)合糖上質(zhì)子的'H」HCOSY相關(guān)信號與鄰位偶合常數(shù)以及碳的化學(xué)位移值，提示單糖部分為6-去氧-2-0甲基-葡萄糖。因此，化合物1被鑒定為毒毛旋花子-3-6-/-(6-去氧-2-0-甲基)-9物?；衔?:白色針狀結(jié)晶(氯仿/甲醇)，熔點(diǎn)215-216°C，[a]g-45.5°(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反應(yīng)呈陽性，提示可能是強(qiáng)心苷類化合物。ESI-MS(negative)給出準(zhǔn)分子離子峰w/z533[M-H]-，提示該化合物的分子量為534，結(jié)合1D-NMR推測分子式為C29H4209。進(jìn)一步的二級質(zhì)譜給出碎片離子387[M-H-146r，表明其結(jié)構(gòu)中可能含有一分子去氧六碳糖。l3CNMR(100MHz，気代吡啶)中該化合物苷元部分的碳信號與毒毛旋花子苷元的信號比較，發(fā)現(xiàn)化合物2苷元部分少了一個連氧季碳，而相應(yīng)的多了-個次甲基碳信號(329.8)，提示化合物2的苷元部分是5位尚未發(fā)生羥基化的19-醛基-毛地黃苷元。單糖部分的核磁數(shù)據(jù)提示該單糖可能是鼠李糖，經(jīng)過酸水解并衍生化后進(jìn)行GC分析，與L-鼠李糖一致。該化合物被鑒定為19-醛基-毛地黃-3-C^，L-鼠李糖苷?；衔?:白色針晶(氯仿/甲醇)，熔點(diǎn)155-156。C，[a]『-3.7。(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反應(yīng)呈陽性，提示為強(qiáng)心苷類化合物。ESI-MS(negative)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z563[M-H]、提示該化合物的分子量為564，結(jié)合1D-NMR推測分子式為C3QH4401Q。進(jìn)一步的二級質(zhì)譜給出碎片離子385[M-H-178]—，提示該結(jié)構(gòu)中可能含有一分子六碳糖?；衔?的碳譜數(shù)據(jù)與化合物l比較，發(fā)現(xiàn)這兩個化合物苷元部分的碳信號基本一致，僅所連接單糖信號有所不同。根據(jù)糖上鄰位氫的偶合常數(shù)、'H」HCOSY相關(guān)信號，以及糖的2'位質(zhì)子信號與甲氧基碳信號的HMBC相關(guān)信號，確定化合物3中的單糖為y5-6-去氧-2-0-甲基-阿洛糖基?；衔?為毒毛旋花子-3-0-/-(6-去氧-2-6>-甲基)-阿洛糖苷。化合物4:白色針晶(氯仿/甲醇)，熔點(diǎn)188-189°C，[a]^7.8°(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反應(yīng)呈陽性，提示為強(qiáng)心苷類化合物。ESI-MS(negative)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z549[M-H].，提示該化合物的分子量為550，結(jié)合1D-NMR推測分子式為C29H4201(>。進(jìn)一步的二級質(zhì)譜給出碎片離f403[M-H-146;r,提示結(jié)構(gòu)中可能含有一分子去氧六碳糖。與化合物1和3比較碳譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)這三個化合物的苷元部分碳信號基本一致，均為毒毛旋花子苷元。區(qū)別僅在于連接的單糖信號有所不同。根據(jù)糖上鄰位氫的偶合常數(shù)、10"H-"HCOSY和ROESY相關(guān)信號確定該單糖種類為6-去氧-古洛糖基。化合物4為毒毛旋花子-3-OW-D-6去氧-古洛糖苷。化合物5:白色針晶(氯仿/甲醇)，熔點(diǎn)178-179。C，[oTb63.6°(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反應(yīng)呈陽性，提示為強(qiáng)心苷類化合物。ESI-MS(negative)給出準(zhǔn)分子離子峰m々5的[M-H]-，提示該化合物的分子量為550，結(jié)合lD-NMR推測分子式為C29H420io。進(jìn)一步的二級質(zhì)譜給出碎片離子403[M-H-146]—，提示結(jié)構(gòu)中結(jié)構(gòu)可能含有一分子去氧六碳糖，與化合物1、3、4的碳譜數(shù)據(jù)相比較，發(fā)現(xiàn)這四個化合物的苷元部分碳信號基本一致，均為毒毛旋花子苷元，區(qū)別在于連接的單糖信號有所不同。根據(jù)糖上鄰位氫的偶合常數(shù)、'H-'HCOSY和ROESY相關(guān)信號確定該單糖種類為6-去氧-阿洛糖基?；衔?為毒毛旋花子-3-C^-D-(6-去氧)-阿洛糖苷?；衔?:白色無定形粉末，[og-74.5。(c1.0，甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反應(yīng)呈陽性，提示為強(qiáng)心苷類化合物。ESI-MS(negative)給出準(zhǔn)分子離子峰wA535[M-H]—，提示該化合物的分子量為536,結(jié)合1D-NMR推測分子式為C29H4409。進(jìn)一步二級質(zhì)譜給出碎片離子389[M-H-146]—，提示結(jié)構(gòu)中含有一分子去氧六碳糖。13CNMR(100MHz,気代吡啶)的碳信號與化合物2比較，發(fā)現(xiàn)單糖部分的碳信號基本相同，苷元部分碳信號的區(qū)別19位醛基信號消失，而在365.4顯示一個亞甲基碳信號，提示該化合物的10位被羥甲基取代?；衔?為坎納醇-3-0-cx-L-鼠李糖苷?；衔?:白色針晶(氯仿/甲醇)，熔點(diǎn)167-168。C，[aff-《5。(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反應(yīng)呈陽性，提示為強(qiáng)心苷類化合物。ESI-MS(negative)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z551[M-H]'，提示該化合物的分子量為552。結(jié)合lD-NMR推測分子式為C29H440u)。進(jìn)一步二級質(zhì)譜給出碎片離子峰405[M-H-146]'，提示結(jié)構(gòu)中含有一分子去氧六碳糖。13CNMR(100MHz,気代吡啶)的碳譜數(shù)據(jù)與化合物5比較，單糖部分的碳信號基本一致，苷元部分碳信號的區(qū)別僅在于19位醛基信號消失，而在c565.4顯示一個亞甲基碳信號，提示該化合物的10位被羥甲基取代?；衔?為羊角拗醇-3-CS5-D-(6-去氧)-阿洛糖苷?；衔?:白色針晶(氯仿/甲醇)，熔點(diǎn)225-226。C，[a]2D64.7°(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反應(yīng)呈陽性，提示為強(qiáng)心苷類化合物。ESI-MS(negative)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z565[M-H]—，提示該化合物的分子量為566。進(jìn)一步二級質(zhì)譜給出碎片離子峰419[M-H-146]—，提示結(jié)構(gòu)中含有一分子去氧六碳糖，結(jié)合lD-NMR推測分子式為C29H420n。與化合物7的碳譜數(shù)據(jù)相比較，區(qū)別主要在于化合物7在339.6(C-12)的信號消失，而在374.2顯示一個連氧次甲基碳信號，提示該化合物的苷元12位發(fā)生了羥基化?；衔?為12-羥基-毒毛旋花子-3-C^-D-6-去氧-阿洛糖苷?；衔?:白色針晶(氯仿/甲醇)，熔點(diǎn)201-202。C，[ag5.4°(c1.0,甲醇)。Liebermann-Burchard和Kedde，s反應(yīng)呈陽性，提示為強(qiáng)心苷類化合物。ESI-MS(negative)給出準(zhǔn)分子離子峰w/z579[M-H]—，進(jìn)一步二級質(zhì)譜給出碎片離子峰401[M-H-178]'，提示該化合物的分子量為566，提示結(jié)構(gòu)含有--分子去氧六碳糖，結(jié)合lD-NMR推測分子式為C29H420n。與化合物3的碳譜數(shù)據(jù)相比較，區(qū)別主要在于化合物3在c539.5(C-12)的信號消失，而在374.2顯示一個連氧次甲基碳信號，提示該化合物的苷元12位發(fā)生了羥基化。化合物9為12-羥基-毒毛旋花子-3-0-"-(6-去氧-2-0-甲基)-阿洛糖苷。化合物1-9的核磁數(shù)據(jù)參見表2-4。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>.34(1H，m)1.45(1H'm)1.36(1H,m)1.38(IH,m)121.77(1H,m)1.48(1H,m)1.73(1H,m)1.77(IH.m)1.35(1H,m)1.38(1H，m)1.31(1H,m)1.38(1H'm)152.05(1H，m)1.78(1H，m)2.03(1H，2.08(IH,m)1.85(1H，m)1.62(1H,m)1.80(1H,1.83(IH，m)162.04(2H，m)1.85(2H'itO2.03(2H,m)2.02(2H.m)172.77(1H,m)2.81(舊，m)2.77(1H，m)2.78(1Rm)181.00(3H,s)1.12(3H,s)1.00(3H，s)1.00(3H，s)1910.41(1H,s)9.60(IH，s)10.41(1H，s)I0.40(1H,s)215.27(IH，d，17.6)5.30(1H，d,18.2)5.26(1H，dd，18.0，1.2)5.28(IH.dd.17.9.1.0)5.01(1H，dd，18.0,1.2)5.03(1H,d，18.1)5.00(1H'dd,18.1,1.4)5.02(IH,dd,18.1'1.2)226.21(1H,brs)6.14(IH，brs)6.11(1H,brs)6.13(IH,brs)r4.80(1H'd，7.6)5.40(1H，d，5.6)5.31(1H,d,8.0)5.41(IH.d,8.0)2,3.39(1H,dd,8.8,8.0)4.52(1H,m)3.33(IH，dd，8.8,2.8)4.48(IH,dd.8.0.3.3>3'4.01(1H，dd'8.0,8.4)4.52(1H,m)4.66(1H，m)4.74(IH.t.3.2)4,3.62(1H,m)4.27(lH'm)3.59(1H,m)4.14(IH,bi.d'3.2)5'3.66(1H,m)4.27(1H，m)4.25(1H,m)4.60(IH,m)6,1.57(3H,d，5.2)1.68(3H，d，6.8)1.57(3H，d,6.0)1.57(3H,d,6.0)2-O-methylEther3.82(3H,s)3.37(3H,s)表4化合物5-9的'HNMR(400MHz，氘代吡啶)數(shù)據(jù)No568989n2.67(1H,m)1.93(IH，m)2.21(IH,m)1.80(IH,m)4.46(IH,brs)2.30(IH，m),1.85(1H，m)2.32(IH,m)1.80(lH'm)2.45(IH,m)1.44(IH,m)2.29(lH'm)U5(IH,m)1.55(IH,m)1.43(1H，2.40(IH,m)1.97(1H，m)1.97(lH，m)1.53(1H，m)4.22(IH，brs)2.15(1H，m)1.87(1H，m)2.58(1H,m)1.75(IH,m)1.52(lH，m)1.94(1H，1.52(IH,m)2.16(IH,m)1.88(1H'1.88(1H，m)1.50(IH，m)2.30(IH,m)1.90(IH，m)2.19(1H,m)1.78(IH,m)4.46(IH，brs)2.24(IH,m)，1.80(IH,m)2.27(IH,m)1.75(1H,m)2.30(1H,m)1.45(IH,2.23(IH，1.37(1H,m)1.57(1H,m)1.40(1H,m)2.67(IH,m)2.10(1H，2.10(IH,m)1.85(IH，m)4.46(IH,brs)2.32(IH，m),1.85(1H'm)2.32(1H，m)2.10(lH，m2.35(IH，m1.40(IH,m2.35(1H，ni)1.85(IH,m)2.10(IH,m)1.85(IH,m)2.67(IH,m)2.10(IH.m)2.10(IH.m)1.85(IH.m)4.46(IH，brs)2.32(IH.m),1.85(IH.m)2.32(IH.m)2.10(IH.m)2.35(IH.m)1.40(IH.m)2.35(IH.m)1.85(IH.m)2.10(IH.m)1.85(iH.m)14121.75(1H，1.37(1H，m)m)1.50(1H,m)1.40(1H，m)1.72(1H，m)1.37(1H，m)3.66(1H,m)3.66(1H.m)152.08(1H,1.85(1H,m)m)1.88(1H，m)1.62(1H,m)2.10(1H，m)1.86(1H,m)1.85(2H'm)1.85(2H,m)162.00(2H，im)1.91(2H，m)2.11(2H,m)2.10(2H'm)2.10(2H，m)172.75(1H,:m)2.81(1H，m)2.80(1H,m)3.69(1H，m)3.69(1H.m)181.00(3H，s)0.98(3H，s)1.00(3H，s)1.22(3H，s)1.22(3H's)1910.38(1H，s)4.07(1H,d,10.8)3.74(1H,d，10.8)4.43(1H，d,11.2)3.96(1H.d,11.2)10.42(1H，s)10.42(1H，s)5.265.3021(1H,dd,18.0，1.2)5.33(1H,d，18.2)(1H,dd.18.0,1.2)5.23(1H,d,18.0)5.23(1H.d.18.0)5.005.03(IH,d'18.1)5.005.09(1H,d,18.0)5.09(1H,d,18.0)(1H,dd，18.0,1.4)(1H,dd'18.0,1.4)226.11(1H,brs)6.12(1H,brs)6.13(1H，brs)6.23(1H，brs)6.23(lH.brs)1'5.33(1H,d，8.0)5.29(1H,d,5.6)5.37(1H,d,8.0)5.34(1H，d,8.0)5.31(1H.d,8.0)2'3.90(1H,dd，8.0，2.8)4.55(1H'm)3.92(1H，dd,8.0,2.8)3.90(IH,dd,8.0,2.8)3.33(1H.dd.8.8.2.8)3'4.61(1H，t,2.8)4.55(1H,m)4.63(1H,t,2.8)4.62(1H'm)4.66(IH,m>4'3.66(1H，dd'9.2'2.8)4.30(1H'm)3.66(1H,dd,9.2,2.8)3.66(1H'dd,8.4,2.0)3.59(IH.m)5'4.23(1H,rn)4.30(1H,m)4.30(1H，m)4.30(1H'm)4.25(1H,m>6'1.58(3H,d，6.0)1.63(3H,d，6.8)1.58(3H，d'6.0)1.57(3H，d,6.0)1.57(3H，d.6.0):-(9-methylEther3.37(3H，s)實(shí)施例2實(shí)施例1所得的強(qiáng)心苷類化合物對TR3mRNA表達(dá)的影響我們采用RT-PCR進(jìn)行分析。NIH-H460肺癌細(xì)胞接種于6孔板中(5xl05cells/we11)，貼壁培養(yǎng)過夜，并且饑餓12h后，加藥培養(yǎng)。按總RNA提取試劑盒說明提取并純化細(xì)胞系的總RNA。并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將細(xì)胞總RNA的mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR條件20|iL體系中cDNA4^L，10xPCRbuffer，25mmo1/LMgCl2，10mmo1/LdNTPs，每次加TR3引物10fimo1/L，ra《酶lU，反應(yīng)在PCR儀中進(jìn)行。94。C4min,94。C30sec，56。C30sec，72。C30sec，35個循環(huán)。PCR引物序列TR3上游5'-TCATGGACGGCTACACAG-3'，下游5'-GTAGGCATGGAATAGCTC-3';p-actin上游5'-CTGGAGAAGAGCTACGAG-3'，下坊,5'-TGATGGAGTTGAAGGTAG-3'。實(shí)驗結(jié)果顯示強(qiáng)心苷類化合物可以誘導(dǎo)TR3mRNA的表達(dá)，并且具有一定的量效關(guān)系。圖1是實(shí)施例1所得的強(qiáng)心苷類化合物在不同濃度下對TR3的mRNA表達(dá)的影響圖。其中，化合物2、1、4、6在lpM濃度下即可誘導(dǎo)TR3mRNA的表達(dá)，活性強(qiáng)度與陽性對照藥TPA相當(dāng)，提示上述強(qiáng)心苷類化合物為TR3的誘導(dǎo)劑。實(shí)施例3:本發(fā)明強(qiáng)心苷類化合物對TR3蛋白質(zhì)表達(dá)的影響我們采用WesternBlotting方法進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。制備10。/。SDS-聚丙烯酰胺凝膠。將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，電轉(zhuǎn)條件為100mA通電2h。雜交按Westernblottingkit說明進(jìn)行。將膜置暗盒中X光片曝光。實(shí)驗結(jié)果顯示強(qiáng)心苷類化合物可以誘導(dǎo)TR3蛋白的表達(dá)。圖2是實(shí)施例1所得的強(qiáng)心苷類化合物在不同時間下對TR3蛋白質(zhì)表達(dá)的影響圖。分別測定化合物2、4、5在2,3,6,9小時下誘導(dǎo)TR3蛋白質(zhì)的農(nóng)達(dá)的情況，由圖中可見，上述強(qiáng)心苷化合物在6小時內(nèi)即可誘導(dǎo)TR3蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)一步提示它們?yōu)門R3的誘導(dǎo)劑。實(shí)施例4:本發(fā)明強(qiáng)心苷類化合物的體外抑瘤實(shí)驗我們采用MTT法測試化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。選融合度在80%，對數(shù)期生長的細(xì)胞，用胰酶消化，轉(zhuǎn)移，離心，去上清液，用新配制的含10%FBS(滅活的小牛胎血清)的DMEM培養(yǎng)液混懸。各種細(xì)胞以1.0><104萬/孔接種于96孔培養(yǎng)板均同時依次加入5個不同稀釋度的待篩樣品藥液,每個稀釋度重復(fù)3個孔，同時平行做相同濃度的溶劑對照，及不加藥的陰性對照，37。C培養(yǎng)72小時，MTT染色，DMSO脫色，測定OD57Q，計算腫瘤生長抑制率IR(%)=(空白OD平均值-給藥組OD平均值)/空白OD平均值xl00。實(shí)驗結(jié)果參見表4.結(jié)果顯示，實(shí)施例1中的9個強(qiáng)心苷類化合物對人體的7種腫瘤細(xì)胞非小肺癌細(xì)胞H-460，A549與Calu-6;前列腺癌細(xì)胞LNCaP;乳腺癌細(xì)胞MCF-7;結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480;宮頸癌細(xì)胞Hela的增殖具有不同程度的抑制作用。表5:實(shí)施例1的強(qiáng)心苷類化合物的體外抑瘤實(shí)驗數(shù)據(jù)化合物IC50±SD(nM)H460LNCaPMCF-7SW-480HelaA549Calu-6強(qiáng)心苷總提物10.6pg/ml9.7兆/ml7.8貼/ml8.5jig/ml6.7pg/ml9.3Mg/ml4.5(ig/ml130.3土4.4115.5=23.348.5土0.9103.0土1.499.7士9.867.1士45.8619.0±195.052.4±3.628.2土1.961.6±8.537.0±4.724.8士13.5345.5士10.6321.5土2.989.0±2.934.1土0.476.3±2.367.9士15.048.3士8.3331.0±81.3415.0土1.847.6±5,223.4土3.364.0±0.644.9土1.925.8士8.0207.0土90.419.6二4.769.7±29.341.0土1.877.6±76.159.1±8.032.2±15.9221.3±13.6610.8±5.442.8±17.337.0土2.265.8土46.527,7±10.17-6±5.863,3±47,775.8±0.421.9士2.015.2±1.543.6±34.711.5丄6.78.3士3.967.5±9.68215.0±60.8688.5±275437.0±140990.5±41.7493.0±95.1450.7丄24.42893丄536981.6±16.1478.5土235.5123.0±7.1239.5±70259.7±75.6238.0丄31.1>5()(1實(shí)施例5:毒毛旋花子-3吞/-(6-去氧-2-0-甲萄-葡萄糖苷片劑的制備取強(qiáng)心苷毒毛旋花子-3-0-^(6-去氧-2-0-甲基)-葡萄糖苷1g與微晶纖維素27g及硬脂酸鎂2g混合，混合物用單沖壓片機(jī)打成直徑6mm，重量300mg的片。本片劑中每片含強(qiáng)心苷10mg。實(shí)施例6:毒毛旋花子-3-0{(6-去氧-2-0-甲萄-葡萄糖苷顆粒劑的制備取毒毛旋花子-3-0-A(6-去氧-2-0-甲基)-葡萄糖苷1g與玉米淀粉29g混合，加水制成軟材，過12目篩進(jìn)行造粒，干燥后得到顆粒劑。本顆粒劑中，每300mg中含強(qiáng)心苷10mg。實(shí)施例7:毒毛旋花子-3-0+(6-去氧-2-0-甲基)-葡萄糖苷膠囊劑的制備取強(qiáng)心苷毒毛旋花子-3-C^-(6-去氧-2-0甲萄-葡萄糖苷1g與乳糖"g、硬脂酸鎂2g混合，以每300mg填充腸溶膠囊。本腸溶膠囊劑屮，每個膠囊含強(qiáng)心苷10mg。實(shí)施例8:坎納醇-3-0-a-L-鼠李糖苷和毒毛旋花子-3-0-Z-D-6去氧-古洛糖苷混合物膠囊劑的制備取坎納醇-3力-(x-L-鼠李糖苷和毒毛旋花子-3-C^-D-6去氧-古洛糖苷各1g與乳糖36g、硬脂酸鎂3g混合，以每500mg填充膠囊。本膠囊劑中，每隔膠囊含強(qiáng)心苷25mg。實(shí)施例9:坎納醇-3力-a-L-鼠李糖苷和毒毛旋花子-3-6>-/-D-6去氧-古洛糖苷混合物糖漿劑的制備17取坎納醇-3-0-a-L-鼠李糖苷和毒毛旋花子-3-C^-D-6去氧-古洛糖苷各1g加水300ml溶解，加入橙皮苷4ml，加單糖降至1000ml得糖漿劑。本糖漿劑lml中含強(qiáng)心苷2mg。實(shí)施例10:實(shí)施例5、6、8和9的樣品誘導(dǎo)荷瘤大鼠C6腦膠質(zhì)瘤凋亡的作用大鼠腫瘤接種后次日將動物隨機(jī)分組，分為治療組51(實(shí)施例5低劑量組)、治療組52(實(shí)施例5高劑量組)、分為治療組61(實(shí)施例6低劑量組)、治療組62(實(shí)施例6高劑量組)、分為治療組81(實(shí)施例8低劑量組)、治療組82(實(shí)施例8高劑量組)分為治療組91(實(shí)施例9低劑量組)、治療組92(實(shí)施例9高劑量組)和對照組(給藥生理鹽水)。采用量瘤徑的評價方法動態(tài)觀察被試物抗腫瘤的效應(yīng)。腫瘤直徑的測量次數(shù)為每周2-3次，每次測量同時還需稱鼠重。腫瘤體積的計算公式為V4/2xaxp其中a、b、c分別表示長寬高。按公式求得抑瘤率抑瘤率％=[(對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)]/對照組腫瘤體積]xl00%。實(shí)驗結(jié)果顯示治療組與生理鹽水對照組相比，腫瘤體積明顯減小，治療組的抑瘤率分別為73.5%、86.1%、77.2%、89.2%、61.1%、70.0%、60.1%和70.9%。(見表6)。表6各組移植瘤的體積測定結(jié)果組別動物數(shù)(只)成瘤數(shù)(個)移植瘤平均體積(mm3)抑瘤申.對照組1010112.3±65.2-治療組51101029.8±12.3**73.5%治療組52101015.6±2.7**86.1%治療組61101025.6±14.1**77.2%治療組62101012.1±0.5**89.2%治療組81101043.7±9.0**61.1%治療組82101033.7±5.7**70.0%治療組91101044.8±12.2**60.1%治療組92101032.7±10.9**70.9%18SEQUENCELISTING<no>暨南大學(xué)<120>誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物及其應(yīng)用<130>101164<160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>Homosapiens<220><221>人工序列<222>(1)..(18)<223>為檢測TR3mRNA的表達(dá)而設(shè)計的TR3上游引物<400>1tcatggacggctacacag18<210>2<211>18<212>DNA<213>Homosapiens<220><221>人工序列<222>(1)..(18)<223>為檢測TR3mRNA的表達(dá)而設(shè)計的TR3的下游引物<400>2gtaggcatggaatagcte18<210>3<211>18<212>DNA<213>Homosapiens<220><221>人工序列<222>(1)..(18)<223>e-actin上游引物<400>3ctggagaagagctacgag18<210>4<211>18<212>DNA<213>Homosapiens<220><221>人工序列<222>(1)..(18)<223>e-actin下游引物<400>4tgatggagttgaaggtag18權(quán)利要求1、誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物，具有以下通式其中R1為CH3、CHO或CH2OH；R2為H或OH；R3為H或OH；R4為糖類所組成的直鏈糖鏈或支鏈糖鏈。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心^類化^物，丄U力征在于所述R,為CHO。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物，其特征在于所述R2為H。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物，其特征在于所述R3為OH。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物，其特征在于所述糖類包括單糖、雙糖、三糖、四糖、五糖、六糖中的一種或一種以上的組合。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物，其特征在于所述糖類包括葡萄糖(卩-D-glucose)、葡萄糖((x-D-glucose)、鼠李糖(a扁L-rhamnose)、半乳糖(卩-D-galactose)、半乳糖(a-D-galactose)、甘露糖(a-L-mannose)、阿拉伯糖(卩-D-arabinose)、阿拉伯糖(a-D-arabinose)、木糖((3-D-xylose)、木糖(a-D-xylose)、核糖(卩-D-ribose)、核糖(a-D-ribose)、來蘇糖(卩-D-lyxose)、來蘇糖(a-D-lyxose)、夫糖(a-D-fucose)中的一種或者一種以上的組合。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物，其特征在于所述糖類包括6-去氧糖、2,6-二去氧糖、2-甲醚-6-去氧糖，3-甲醚-6-去氧糖、4-甲醚-6-去氧糖中的一種或者一種以上的組合。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物，其特征在于R^為CHO，R2為H，R3為OH，R4為,(6-去氧-2-O-甲基)-葡萄糖基的化合物，化學(xué)名為毒毛旋花子-3-0-^(6-去氧-2-0-甲基)-葡萄糖苷；或者R,為CHO，R2為H，R3為H，R4為a，L-鼠李糖基的化"物，化':〔'名為19-醛基-毛地黃-3-0-a，L-鼠李糖苷；或者Ri為CHO，R2為H，R3為OH，R4為"-6-去氧-2-0-甲基-阿洛糖基的化合物，化學(xué)名為毒毛旋花子-3-0-"-(6-去氧-2-0-甲萄-阿洛糖苷；或者R,為CHO，112為H，&為OH，R4為AD-6-去氧-古洛糖基的化合物，化學(xué)名為毒毛旋花子-3-C^-D-(6-去氧)-古洛糖苷；或者為CHO，R2為H，R3為OH，R4為^，D-6-去氧-阿洛糖基的化合物，化學(xué)名為毒毛旋花子-3-C^-D-(6-去氧)-阿洛糖苷；或者R,為CH20H，R2為H，R3為H，R4為a,L-鼠李糖基的化合物，化學(xué)名為坎納醇-3-0會L-鼠李糖苷；或者R,為CH20H，R2為H，R3為OH，R4為A，D-6-去氧-阿洛糖基的化合物，化學(xué)名為羊角拗醇-3-0-^-D-(6-去氧)-阿洛糖苷；或者R4為CHO，R2為OH，R3為OH，R4為P，D-6-去氧-阿洛糖基的化合物，化學(xué)名為12-羥基-毒毛旋花子-3-C^-D-6-去氧-阿洛糖苷；或者R,為CHO，R2為H，R3為OH，R4為"-6-去氧-2-0-甲基-阿洛糖基的化合物，化學(xué)名為12-羥基-毒毛旋花子-3-0-^(6-去氧-2-0-甲基)-阿洛糖苷。9、權(quán)利要求1至8任意一項所述的誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物在制備誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述誘導(dǎo)核受體TR3農(nóng)達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物在制備預(yù)防和治療癌癥、肝炎、動脈粥樣硬化藥物屮的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)的強(qiáng)心苷類化合物，具有以下通式其中R₁為CH₃、CHO或CH₂OH；R₂為H或OH；R₃為H或OH；R₄為糖類所組成的直鏈糖鏈或支鏈糖鏈。本發(fā)明所述的強(qiáng)心苷類化合物，能夠誘導(dǎo)核受體TR3表達(dá)，從而可以作為誘導(dǎo)劑應(yīng)用于制備預(yù)防和治療癌癥、肝炎、動脈粥樣硬化等藥物。文檔編號A61P9/00GK101323634SQ20081002777公開日2008年12月17日申請日期2008年4月29日優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日發(fā)明者何加友,姚新生,姜苗苗,雪張,張曉坤,毅戴,曾錦章,王光輝申請人:暨南大學(xué)