專利名稱：Lyrm1基因在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及LYRMl基因在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用。
背景技術：
肥胖，是一種常見的能量代謝性疾病，已成為日趨嚴重的全球性流行病。肥胖與冠 心病、高血壓、高脂血癥、糖尿病、腦血管意外等多種疾病關系密切，嚴重危害著患者 的身心健康。目前已知肥胖是機體在遺傳、環(huán)境、行為因素或三者相互作用下能量代謝 失衡的結果，并且隨著遺傳學和生物學的發(fā)展，遺傳因素在肥胖發(fā)生中的重要性己倍受 重視。已有研究結果指出，肥胖發(fā)生的病因中遺傳因素占40-70%，開展肥胖病因的遺 傳學研究十分重要。
在前期研究工作中，我們以抑制性差減雜交(suppressive subtractive hybridization, SSH)技術篩選肥胖與正常人網膜脂肪組織中的差異表達基因(differentially expressed genes),克隆到一條在肥胖者脂肪組織中表達顯著上調的功能尚未明確的新基因 ——LYRMl (GenBank登錄號NM—020424.3)，目前有關其與肥胖的關系尚未見報道。 該基因cDNA全長1589bp (SEQIDNo.l)，開放閱讀框長369bp，編碼一 122個氨基酸 的蛋白(NCBI登錄號NP一065157.1)。通過與人類基因組序列比對，LYRMl基因定位 于染色體16p11.2，外顯子和內含子序列明確；DAS和TMpred未預測出跨膜區(qū)域，提 示為非跨膜蛋白；SignalP未預測出信號肽，提示為非分泌蛋白；InterPro和Smart工具 對LYRMl基因可能存在的功能域進行分析，發(fā)現(xiàn)在LYRMl上存在一 LYR結構域，LYR 家族蛋白認為是NADH復合物的一個元件，提示其可能參與能量代謝；clustahv軟件比 對，發(fā)現(xiàn)該基因與大鼠、小鼠、狗、雞、牛等高度同源，提示其較為保守，存在一定功 能。
我們驗證了 LYRMl基因在肥胖與正常人脂肪組織中的差異表達，發(fā)現(xiàn)該基因在肥 胖者脂肪組織中核酸及蛋白表達水平均顯著上調，與SSH結果(SSH實驗篩選出426 條肥胖與正常人網膜脂肪組織中的差異表達基因，其中216個特異高表達于肥胖者脂肪組織，210個特異高表達于正常人脂肪組織。LYRM1是其中一條特異高表達于肥胖者脂 肪組織中的基因) 一致。多組織表達結果顯示LYRM1在脂肪組織中的表達量最高。進 一步為分析LYRM1基因的生物學屬性，我們應用能夠表達融合蛋白LYRM1—綠色熒 光蛋白的表達質粒(LYRMl-pEGFP-N2)，轉染不同細胞，根據綠色熒光蛋白在熒光顯 微鏡下可直接觀察的特點，以融合蛋白LYRM1—綠色熒光蛋白的亞細胞定位，初步判 斷LYRM1的亞細胞定位，結果發(fā)現(xiàn)該融合蛋白定位于胞核內，由于核蛋白與生物遺傳 和蛋白質生物合成關系密切，因此有關核蛋白結構與功能的研究十分活躍。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供LYRM1基因在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用。
發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)LYRM1基因能夠促進脂肪細胞增殖，故提出LYRM1基因、 LYRM1基因編碼的蛋白及其融合蛋白在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用。
有益效果
本發(fā)明通過在脂肪細胞中穩(wěn)定表達LYRM1蛋白，與陰性對照相比，明顯促進脂肪 細胞的增殖速度，為制備促進脂肪細胞增殖藥物提供了可用的基因序列，為研究肥胖的 發(fā)生發(fā)展提供了新的研究手段。
圖1:脂肪細胞中穩(wěn)定表達LYRM1蛋白的驗證。在穩(wěn)定表達LYRM1細胞和空載 對照細胞中應用制備的LYRM1特異性抗體驗證LYRM1蛋白的表達。
圖2:穩(wěn)定表達LYRM1蛋白的脂肪細胞和空載對照細胞生長曲線圖。
圖3:穩(wěn)定表達LYRM1蛋白的脂肪細胞和空載對照細胞24小時細胞染色質合成期 分布圖。
圖2、 3中LYRM1代表LYRMl-pcDNA3.1myc/hisa(-))轉染脂肪前體細胞3T3-L1 組，pcDNA3.1代表pcDNA3.1myc/his a(-)空載轉染的脂肪前體細胞3T3-L1組。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不限制本發(fā)明。
實施例1
1材料和方法
1.1試驗材料
本試驗所需的真核表達載體pcDNA3.1myc/his a(-)購自美國invitrogen公司。脂肪前 體細胞3T3-L1購自美國ATCC細胞庫，細胞篩選的新霉素G418購自美國sigma公司。
本試驗過程中所采用的酶，dNTP、感受態(tài)細胞JM109等購自大連寶生物公司。
1.2表達載體的構建
采用Trizol提取人網膜下脂肪組織RNA，經反轉錄成cDNA，利用LYRM1特異性 引物(上游引物5'-AGAATAAACCTCAAGAAACG-3' (SEQIDNo.2);下游引物5'-AATTTTTGCCCCTAATCAAG-3' (SEQIDNo.3))擴增出包含LYRM1蛋白編碼序 列的PCR產物，直接連接入pMD-18T載體(TA克隆的原理是利用Taq酶能夠在PCR 產物的3'末端加上一個非模板依賴的A,而T載體是一種帶有3' T突出端的載體， 在連接酶作用下，可以快速地、 一步到位地把PCR產物直接插入到質粒載體的多克隆 位點(MCS)中，即是說PCR產物末端的A直接與載體上的T連接)。測序驗證無誤 后，以此T/A克隆載體(包含LYRM1蛋白編碼序列的PCR產物連接入pMD-18T載體 所構成的載體)為模版，PCR擴增兩頭帶BamHI和Xhol酶切位點產物。將擴增后產物 與真核表達載體pCDNA3.1myc/hisa(-)采用上述兩種酶進行酶切，酶切后純化連接，轉 化入感受態(tài)細胞JM109，挑克隆送測序。測序無誤后抽提質粒(LYRMl-pcDNA3.1myc/his a(-))待用。
1.3 LYRM1穩(wěn)定表達細胞的篩選與建立
將構建好的LYRM1真核表達載體(LYRMl-pcDNA3.1myc/his a(-))轉染脂肪前體 細胞3T3-L1， pcDNA3.1myc/his a(-)空載轉染的脂肪前體細胞作為對照。轉染后24小時， 用新霉素G418 (濃度為800ng/ml)進行篩選。篩選維持兩周，含有LYRM1表達的陽 性細胞株存活，其余無表達的細胞死亡，G418降至200wg/ml維持，細胞繁殖擴增。 將轉染LYRM1 、空載轉染的3T3-L1細胞抽提蛋白，應用LYRM1特異性抗體進行Western 免疫印跡(Western—Blot)實驗，驗證LYRMl蛋白的表達。結果見圖l。
1.4脂肪細胞增殖的測定
A. 將LYRMl穩(wěn)定表達細胞、空載轉染的陰性對照細胞，接種于96孔細胞培養(yǎng)板， 接種密度約為每孔500個細胞，以DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)一周。每天取細胞進行細胞 生長活力(MTT)測定，連續(xù)7天后，根據MTT吸光度值畫出生長曲線。結果見圖2。
B. 將LYRMl穩(wěn)定表達細胞、空載轉染的陰性對照細胞，培養(yǎng)于75ci^的細胞培養(yǎng) 瓶。以無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時后，使細胞同步化，停留于G0期?；?復正常培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并在恢復正常培養(yǎng)基培養(yǎng)后的第0、 6、 12、 18、 24小時收取 細胞，70%冰乙醇固定后經流式細胞儀檢測細胞周期分布，計算不同時間點S期細胞(染 色質合成期)分布(代表細胞增殖能力)。結果見圖3。
2結果顯示，通過MTT試驗發(fā)現(xiàn)，在7天中，穩(wěn)定表達LYRM1的細胞增殖速度 明顯快于空載轉染的對照細胞，細胞個數(shù)明顯增加。通過細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，在恢復含 血清的培養(yǎng)基后第12、 18、 24小時，穩(wěn)定表達LYRM1的細胞中S期細胞組分明顯大 于對照組，表明染色質合成期細胞增多，細胞增殖速度變快。說明LYRM1基因及其編 碼的LYRM1蛋白、融合蛋白能顯著促進脂肪細胞增殖，可用于制備促進脂肪細胞增殖 藥物。
序 列 表
〈110〉郭錫熔劉峰邱潔彭宇竹
〈120〉 LYRM1基因在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用
〈160〉 3
<210〉 1
〈211〉 1589
〈212〉 DNA
〈213〉天然序列，來源人類組織細胞
〈400〉1<sequence>see original document page 7</sequence>
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212〉DNA
<213>人工序列，上游引物<400> 2
agaataaacc tcaagaaacg 20
<210> 3 <211> 20 〈212〉 DNA
〈213〉人工序列，下游引物 〈400> 3
aatttttgcc cctaatcaag 20
權利要求
1、LYRM1基因在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用。
2、 LYRM1基因編碼的蛋白及其融合蛋白在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領域，公開了LYRM1基因在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用。本發(fā)明的技術方案為LYRM1基因、LYRM1基因編碼的蛋白及其融合蛋白在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用。本發(fā)明為制備促進脂肪細胞增殖藥物提供了可用的基因序列，為研究肥胖的發(fā)生發(fā)展提供了新的研究手段。
文檔編號A61K48/00GK101342371SQ20081002188
公開日2009年1月14日 申請日期2008年8月26日 優(yōu)先權日2008年8月26日
發(fā)明者倪毓輝, 峰 劉, 季晨博, 敏 張, 張春梅, 彭宇竹, 霞 池, 玢 王, 潔 邱, 郭錫熔, 陳曉慧 申請人:郭錫熔;劉 峰;邱 潔;彭宇竹