專利名稱：一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域或獸醫(yī)生物制品領(lǐng)域，具體是一種對豬體 核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序。
2背景技術(shù)：
近年來由于分子生物學(xué)的發(fā)展，使得疫苗學(xué)進入了一個嶄新的分子免疫時 代，其標志是各種分子免疫增強劑的研究和應(yīng)用。如何進一步提高傳統(tǒng)疫苗的免 疫效果是今后努力的方向。高效免疫增強劑的應(yīng)用，能全面提高機體的整體免疫 水平，增強抗病防御和免疫應(yīng)答能力，提高疫苗保護率。其中，CpG基序(CpG寡聚 脫氧核苷酸)的研究是其中的焦點。CpG序列已被證實能作為疫苗的高效免疫增 強劑，使用得當能夠大幅度提高疫苗的免疫保護率和機體的免疫水平。近來大量 免疫學(xué)研究證實含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果(l)誘導(dǎo)B細胞增 殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗誘生的細胞凋亡；(3)誘導(dǎo)單核細胞 分泌IL-12及其他細胞因子；(4)活化自然殺傷(NK)細胞的裂解活性和干擾素 (IFN-Y)分泌。
使用CpG寡核苷酸作佐劑要面臨的一個較復(fù)雜的問題就是對于不同的物種 其最佳的CpG序列不同，比如對鼠免疫刺激效果最好的序列是5' -GACGTT-3'
(Zina et al, 1998)，對人的刺激作用最強的是5， -GTCGTT-3，。目前開發(fā) CpG佐劑要解決的問題是確定不同的DNA疫苗所需要的含CpG寡核苷酸的最合適 的劑量以及對不同物種具有特異性的寡核苷酸序列。
我國是世界養(yǎng)豬大國，2002年以來生豬飼養(yǎng)量在11億頭以上，在畜牧業(yè)生 產(chǎn)中占有較大的比重，同時養(yǎng)豬業(yè)也是我國部分省區(qū)的主要生產(chǎn)支柱和新的經(jīng) 濟增長點。但面對當前養(yǎng)豬業(yè)重大疫病發(fā)生和流行愈加復(fù)雜的形勢——舊病未 除，新病又起，疫情不斷，這就要求我們必須運用新的科學(xué)理論和生產(chǎn)技術(shù)來 發(fā)展豬用安全、高效疫苗預(yù)防和控制各種疫病的發(fā)生和流行，而免疫增強劑的 研制是疫苗研究的主要組成部分。
3
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序，可使DNA疫苗產(chǎn)生更有效的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的人工合成一種CpG基序，其引物序 列如下
7-A: CTCAT^ATCCTAT，TCCTAT^ATCCTAT靜TCCTAT，TCCTAT^ATGGGCC 7-B: CATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC 注a、加黑部分需硫代修飾
CpG基序的免疫增強作用檢驗步驟如下
1 )選擇15頭健康豬(長白X大白二元雜交)，120日齡左右，體重90 —115kg，
經(jīng)檢疫，健康狀況良好。
2)外周血淋巴細胞的分離培養(yǎng)
采集肝素抗凝血，用PBS(ra7.4)稀釋液l: l稀釋，小心疊加于2倍體積孵 育至室溫的淋巴細胞分離液上，以1500rpm水平離心25min。將收集血漿層與淋 巴細胞分離液層之間的淋巴細胞層，放入含PBS(ra7. 4)洗滌液5ml的試管中， 充分混勻后，以1000rpm離心10min。棄上清液沉淀用5mlPBS(PH7. 4)洗滌液以 1000rpm離心10min洗兩次，所得即是淋巴細胞。細胞沉淀用5ml含10%犢牛血 清的RPMI1640營養(yǎng)液懸浮。進行活力檢測與計數(shù)。 3)脾臟免疫細胞的分離
取豬脾臟，剪碎，然后用研磨器勻漿。勻漿液經(jīng)150目銅網(wǎng)過濾，濾液經(jīng) 2000rpm離心10 min收集細胞泥。用2ml紅細胞裂解液懸浮，室溫處理5min， 然后用10ml GKN溶液中和混勻后2000rpm離心10min。將細胞沉淀用PBS離心 洗滌3-4次，至細胞沉淀純白色。細胞沉淀用5ml含10%犢牛血清的RPMI1640 營養(yǎng)液懸浮，進行活力檢測與計數(shù)。
4) 活力檢測與計數(shù)
取10ul細胞懸液加90 1%的臺盼藍溶液，混勻，滴加到血球計數(shù)板上， 進行淋巴細胞活力檢測及計數(shù)。用1(m犢牛血清的RPMI1640細胞營養(yǎng)液調(diào)整至 2Xl()7細胞/ml。
5) 外周血淋巴細胞和脾臟免疫細胞增殖試驗(MTT法)
將96孔細胞培養(yǎng)板分成12組，每組三孔；將懸浮細胞的細胞培養(yǎng)液加入 細胞培養(yǎng)板(從第一組至陰性對照，每組三個重復(fù)，每孔150pL);空白對照孔 加入150^iL無細胞的細胞培養(yǎng)液(三個重復(fù))；將CpG-0DN(100^ig/mL)樣品分 別加入第1組至第9組(每組三個重復(fù)，每孔lOpL);陽性對照加入ConA(100iiig/mL)(三個重復(fù)，每孔lOpL);空白對照加入細胞培養(yǎng)液(三個重復(fù)，每孔10|lL); 將細胞培養(yǎng)板放入置37°C， C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每孔加入10ulMTT(5pg/|LiU ， 繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后每孔加入100^iL的DMS0，使紫黑色結(jié)晶完全溶解，測定0049。 的值。同時設(shè)不加細胞的營養(yǎng)液對照。以待測樣品0D，減去培養(yǎng)液對照孔0D49。， 即為試驗孔A值；以刺激指數(shù)(SI)作為判斷淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度的參數(shù)。應(yīng)用方 差分析進行差異顯著性檢驗。 6)數(shù)據(jù)處理
以刺激指數(shù)(SI)作為判斷淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度的參數(shù)。SI大于2具有刺激 效果。應(yīng)用公式計算如下
SI二( ODs - ODb)/( ODn - ODb) ODs:樣品(samole)孔OD值； ODb:空白(blank)孔OD值； ODn:陰性(negative)孔OD值。 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件對所測的SI值進行方差分析多重比較。 本發(fā)明CpG基序作為免疫增強劑的優(yōu)越性對淋巴細胞增殖能力和對豬脾 臟免疫細胞的刺激作用較好，可以用作核酸疫苗的佐劑進一步提高核酸疫苗的 免疫效果；易規(guī)?；a(chǎn)，成本低廉，易于保存和運輸；安全性好。細胞因子 是機體內(nèi)本身存在的免疫調(diào)節(jié)分子，對人體無毒副作用，同時也受機體免疫調(diào) 節(jié)網(wǎng)絡(luò)的控制；易于構(gòu)建和改造，利用分子生物學(xué)技術(shù)在基因水平可實現(xiàn)人們 所期望的免疫應(yīng)答強度和類型。SEQUENCE LISTING
〈110>.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
〈120〉 一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序
〈160〉 2
〈210〉 1
〈211〉 59
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈222〉 (6， 15， 24， 33， 42， 51) 〈223> s2c
<400> 1
ctcatcgatc ctatcgatcc tatcgatcct atcgatccta tcgatcctat cgatgggcc 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA <213>人工序列
<220>
〈222〉 (4， 13， 22， 31, 40， 49) 〈223〉 s2c
〈400〉 2
catcgatagg atcgatagga tcgataggat cgataggatc gataggatcg atgagggcc 59
權(quán)利要求
1、一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序，用于其合成的引物序列為7-ACTCAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATGGGCC7-BCATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC。
2、 一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序，其免疫增強作用的檢測步驟如下1) 選擇120日齡健康豬15頭為原料備用；2) 外周血淋巴細胞的分離培養(yǎng)；3) 脾臟免疫細胞的分離；4) 活力檢測與計數(shù)；5) 外周血淋巴細胞和脾臟免疫細胞增殖試驗，即MTT法；步驟如下a將96孔細胞培養(yǎng)板分成12組，每組三孔；將懸浮細胞的細胞培養(yǎng)液加入 細胞培養(yǎng)板，從第一組至陰性對照，每組三個重復(fù)，每孔150(aL; b空白對照孔加入150pL無細胞的細胞培養(yǎng)液，三個重復(fù)； c將CpG基序調(diào)整為100pg/mL，樣品分別加入第1組至第9組，每組三個 重復(fù)，每孔10iiL;d陽性對照加入ConA 100pg/ mL，三個重復(fù)，每孔lOpL;空白對照加入細 胞培養(yǎng)液，三個重復(fù)，每孔10iiiL;e將細胞培養(yǎng)板放入置37°C， C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每孔加入10ulMTT， 5pgAiL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后每孔加入100)LiL的DMS0，使紫黑色結(jié)晶完全溶解， 測定OD，的值，同時設(shè)不加細胞的營養(yǎng)液對照，以待測樣品0D49。減去培養(yǎng)液對 照孔0D49。，即為試驗孔A值；以刺激指數(shù)"SI"作為判斷淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度的 參數(shù)，應(yīng)用方差分析進行差異顯著性檢驗；6) 數(shù)據(jù)處理以刺激指數(shù)(SI)作為判斷淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度的參數(shù)，SI大于2具有刺激 效果，應(yīng)用公式計算如下SI=( ODs - 0Db)/( ODn - ODb) ODs:樣品(samole)孔OD值； ODb:空白(blank)孔OD值； ODn:陰性(negative)孔0D值。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序。人工合成系列CpG基序免疫豬體，通過測定其細胞免疫水平和體液免疫水平確定了一種對豬最適的CpG基序，該CpG基序可以用作核酸疫苗的佐劑進一步提高核酸疫苗的免疫效果。本發(fā)明CpG基序作為免疫增強劑的優(yōu)越性制備方法簡單，易于保存和運輸；質(zhì)量易于控制，易規(guī)模化生產(chǎn)，成本低廉，易于保存和運輸；安全性好。細胞因子是機體內(nèi)本身存在的免疫調(diào)節(jié)分子，對人體無毒副作用，同時也受機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的控制；易于構(gòu)建和改造，利用分子生物學(xué)技術(shù)在基因水平可實現(xiàn)人們所期望的免疫應(yīng)答強度和類型。
文檔編號A61K39/39GK101423832SQ200810014059
公開日2009年5月6日 申請日期2008年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日
發(fā)明者任慧英, 吳家強, 順 周, 張秀美, 朱新產(chǎn), 俊 李, 溫建新, 王金寶 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所