專利名稱：：一種白花蛇舌草提取物及其分離制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及天然藥物的分離，具體的說是白花蛇舌草提取物分離制備方法，該組分主要成分是雞矢藤苷甲酯，去乙?；嚾~草苷酸甲酯，車葉草苷酸和車葉草苷四個化合物。
背景技術(shù)：
：中藥白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草i/e辦o他又名OWew/a"^34^"^及ojc6.的全草。始載于《廣西中藥志》，具有清熱解毒、活血化瘀、利水滲濕、消腫止痛、抗腫瘤等作用，廣泛用于腫瘤、黃疸性肝炎、腸炎和肺炎等的治療。主產(chǎn)于廣東、廣西、福建等地。白花蛇舌草的主要成分是環(huán)烯醚萜類、黃酮類和蒽醌類化合物，其次為有機酸類、甾醇類化合物等。白花蛇舌草中常見的環(huán)烯醚蔽類化合物主要有雞矢藤苷甲酯、去乙?；嚾~草苷酸甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷和雞矢藤苷等。藥理研究表明，白花蛇舌草具有抗氧化，消炎抗菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性(LinC.C.，NgL.T.andYangJ.J.，Am.J.Chin.Med.，2004，32:339-349;LinC.C.,NgL.T"YangJ.J.andHsuY.F,Am.J.Chin.Med.，2002,30:225-234;趙浩如等，中國藥科大學學報，2002，33(6):510-513;YoshidaY"WangM.Q.etal"Int.J.Immunopharmaclo.1997，19:359-370)。同時白花蛇舌草中環(huán)烯醚萜類化合物還具有神經(jīng)保護作用(KimY.，ParkE.J.，etal.,J.Nat.Prod.,2001,64:75-78)。由于白花蛇舌草在抗腫瘤方面的功效，越來越引起人們的關(guān)注。白花蛇舌草及其制劑主要用于呼吸系統(tǒng)感染、肝炎、肺炎、腫瘤等的治療。環(huán)烯醚萜類化合物是白花蛇舌草中主要活性成分之一，而目前報道的分離制備烯醚萜類化合物的方法，基本上都是采取傳統(tǒng)的溶劑萃取、硅膠柱層析等方法，這些方法存在重現(xiàn)性差、耗時長、有機殘留嚴重、檢測手段落后、自動化程度低、無法大規(guī)模生產(chǎn)等缺點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種白花蛇舌草提取物及其分離制備方法，其中主要成分為雞矢藤苷甲酯、去乙?；嚾~草苷酸甲酯、車葉草苷酸和車葉草苷四個主要的化合物。本發(fā)明提供一種白花蛇舌草提取物，其中主要成分為雞矢藤苷甲酯、去乙?；嚾~草苷酸甲酯、車葉草苷酸和車葉草苷，所述的四種主要成分總含量在60%~75%。本發(fā)明提供的白花蛇舌草提取物，其中雞矢藤苷甲酯的含量在10°/&—15%，去乙?；嚾~草苷酸甲酯含量在10°/^~20%，車葉草苷酸含量在20%~25%，車葉草苷含量在20%~25%。本發(fā)明提供了一種白花蛇舌草提取物的分離制備方法，分為提取、醇沉、膜分離、非極性大孔樹脂分離和工業(yè)色譜分離等步驟，具體為1)提取稱取白花蛇舌草原藥材，加入其重量6-10倍的水煎煮提取2-3次，每次1-3小時，得到提取液，將提取液濃縮至相對密度為0.9-1.10得浸膏；2)醇沉將浸膏中加入乙醇使乙醇體積濃度達到50-70%，室溫靜置12-24小時，過濾，取濾液濃縮至相對密度1.05-1.10;再加入乙醇使乙醇體積濃度達到75-80%，室溫靜置12-24小時過濾，取濾液濃縮揮發(fā)除去乙醇，樣品溶液經(jīng)過10000-25000轉(zhuǎn)/分鐘的高速離心機離心；3)膜分離此醇沉組分再通過3000-6000Da的膜分離，得到膜分離組分；4)非極性大孔樹脂分離將膜分離組分上樣于非極性大孔樹脂柱，上樣量與分離材料體積比為1:100~500，分別采用流動相體積濃度10-30%的乙醇和70-95%乙醇洗脫，每次洗脫的體積為3-5個柱體積，流速為1-3個柱體積/小時；循環(huán)洗脫，洗脫液濃縮，即為白花蛇舌草大孔樹脂分離組分；5)工業(yè)色譜分離以粒徑5-20微米的OEG系列硅膠鍵合固定相為色譜填料，以甲醇和水為流動相，梯度洗脫，甲醇的體積濃度從2-100%變化，收集目標組分，干燥處理即為白花蛇舌草提取物。本發(fā)明提供的白花蛇舌草提取物的分離制備方法，所述色譜柱效為5000-20000塔板/米。本發(fā)明提供的白花蛇舌草提取物的分離制備方法，所述色譜柱長為200毫米_600毫米，色譜柱內(nèi)徑為20毫米一300毫米。本發(fā)明的優(yōu)點1.主要成分的含量高。本發(fā)明采用了最先進的工業(yè)色譜填料和分離制備技術(shù)。利用工業(yè)色譜的高分離能力，可以保證主要成分的純度達到70%以上。2.重現(xiàn)性好。本發(fā)明利用工業(yè)色譜系統(tǒng)和OEG系列硅膠鍵合固定相分離材料穩(wěn)定的性能，可以保證分離制備的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。3.周期短。本發(fā)明從原藥材的粉碎提取到制備得到白花蛇舌草提取物的產(chǎn)品，只需要10天的時間。4.有機殘留低。由于本發(fā)明摒棄了傳統(tǒng)工藝中溶劑萃取、硅膠柱層析等工藝，采用了有機溶劑使用量較少的工業(yè)色譜方法，而且最終產(chǎn)品采用真空離心干燥處理，所以最終產(chǎn)品的有機溶劑殘留特別小。5.能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明所采用工藝非常容易實現(xiàn)標準化，自動化，適于進行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。圖1本發(fā)明實施例1工業(yè)色譜制備白花蛇舌草提取物的制備色譜圖。圖2本發(fā)明中白花蛇舌草提取物的HPLC色譜圖a=254nm)具體實施方式白花蛇舌草提取物的制備方法實施例1:將白花蛇舌草原藥材粉碎，定量稱取2千克，置于20升提取罐中，加入20升水煎煮1小時，過濾，濾液保存?zhèn)溆?，濾渣中再加入20升水煎煮1小時，過濾，濾液與第一次合并，濾渣棄去。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至500毫升，得到白花蛇舌草水提取組分。在濃縮液中加入710毫升95%乙醇，充分攪拌，室溫靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至300毫升，在濃縮液中加入1600毫升95%乙醇，充分攪拌，室溫靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至無醇味，濃縮液經(jīng)過高速離心機(20000轉(zhuǎn)/分鐘)離心，得到白花蛇舌草醇沉組分300毫升。此醇沉組分再過6000Da膜，得到膜分離組分。取白花蛇舌草膜分離組分，進樣到已處理好的羅門哈斯XAD-4型大孔樹脂層析系統(tǒng)(20L)中，。首先用5倍柱體積100L3(^乙醇洗脫柱體，洗脫液濃縮備其它用，再用5倍柱體積100L95。/。乙醇洗脫，洗脫液保存，并濃縮，得到白花蛇舌草大孔樹脂組分。工業(yè)色譜柱柱長400毫米，內(nèi)徑80毫米，色譜填料為10-20微米的OEG-4鍵合固定相，柱效為15000塔板/米，設定紫外檢測波長為254nm(可為230-260nm)，流速200分鐘/毫升，設定洗脫梯度(見表l)，初始流動相(5%甲醇水)平衡色譜柱20分鐘，取白花蛇舌草大孔樹脂組分樣品5ml，進樣，按設定梯度洗脫，收集2分鐘至8分鐘組分。洗脫結(jié)束，再次平衡柱子，進樣，收集洗脫組分(見圖1)。將收集得到的切割組分，合并，濃縮，再通過真空離心干燥得到白花蛇舌草提取物產(chǎn)品2.3克，經(jīng)高效液相色譜分析(圖2)，其提取物的總含量>71%。表1實施例1白花蛇舌草提取物的工業(yè)色譜制備梯度設置表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例2將白花蛇舌草原藥材粉碎，定量稱取5千克，置于100升提取罐中，加入40升水煎煮2小時，過濾，濾液保存?zhèn)溆茫瑸V渣中再加入40升水煎煮2小時，過濾，濾液與第一次合并，濾渣棄去。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1000毫升，得到白花蛇舌草水提取組分。在濃縮液中加入1710毫升95%乙醇，充分攪拌，室溫靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至500毫升，在濃縮液中加入2670毫升95%乙醇，充分攪拌，室溫靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至無醇味，濃縮液經(jīng)過高速離心機(10000轉(zhuǎn)/分鐘)離心，得到白花蛇舌草醇沉組分500毫升。此醇沉組分再過6000Da膜，得到膜分離組分。取白花蛇舌草膜分離組分，進樣到已處理好的羅門哈斯XAD-4型大孔樹脂層析系統(tǒng)(60L)中，。首先用3倍柱體積30%乙醇洗脫柱體，洗脫液濃縮備其它用，再用3柱體積的95%乙醇洗脫，洗脫液保存，并濃縮，得到白花蛇舌草大孔樹脂組分。工業(yè)色譜柱柱長400毫米，內(nèi)徑80毫米，色譜填料為10-20微米的OEG-4鍵合固定相，柱效為15000塔板/米，設定紫外檢測波長為254nm，流速200分鐘/毫升，設定洗脫梯度(見表l)，初始流動相(5%甲醇水)平衡色譜柱20分鐘，取白花蛇舌草大孔樹脂組分樣品5ml，進樣，按設定梯度洗脫，收集2分鐘至8分鐘組分。洗脫結(jié)束，再次平衡柱子，進樣，收集洗脫組分。將收集得到的切割組分，合并，濃縮，再通過真空離心干燥得到白花蛇舌草提取物產(chǎn)品5.8克，經(jīng)高效液相色譜分析，其提取物的總含量>71%。實施例3將白花蛇舌草原藥材粉碎，定量稱取10千克，置于100升提取罐中，加入60升水煎煮3小時，過濾，濾液保存?zhèn)溆茫瑸V渣中再加入60升水煎煮3小時，過濾，濾液與第一次合并，濾渣棄去。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2000毫升，得到白花蛇舌草水提取組分。在濃縮液中加入3420毫升95%乙醇，充分攪拌，室溫靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至1500毫升，在濃縮液中加入8000毫升95%乙醇，充分攪拌，室溫靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至無醇味，濃縮液經(jīng)過高速離心機(25000轉(zhuǎn)/分鐘)離心，得到白花蛇舌草醇沉組分1800毫升。此醇沉組分再過3000Da膜，得到膜分離組分。取白花蛇舌草膜分離組分，進樣到已處理好的羅門哈斯XAD-4型大孔樹脂層析系統(tǒng)中，。首先用3倍柱體積30%乙醇洗脫柱體，洗脫液濃縮備其它用，再用3倍柱體積95%乙醇洗脫，洗脫液保存，并濃縮，得到白花蛇舌草大孔樹脂組分。工業(yè)色譜柱柱長400毫米，內(nèi)徑80毫米，色譜填料為10-20微米的OEG-4鍵合固定相，柱效為15000塔板/米，設定紫外檢測波長為254nm(可為230-260nm)，流速200分鐘/毫升，設定洗脫梯度(見表l),初始流動相(5%甲醇水)平衡色譜柱20分鐘，取白花蛇舌草大孔樹脂組分樣品3ml，進樣，按設定梯度洗脫，收集2分鐘至8分鐘組分。洗脫結(jié)束，再次平衡柱子，進樣，收集洗脫組分。將收集得到的切割組分，合并，濃縮，再通過真空離心干燥得到白花蛇舌草提取物產(chǎn)品10.8克，經(jīng)高效液相色譜分析，其提取物的總含量>70%。權(quán)利要求1、一種白花蛇舌草提取物，其中主要成分為雞矢藤苷甲酯、去乙酰基車葉草苷酸甲酯、車葉草苷酸和車葉草苷，其特征在于所述的四種主要成分總含量在60％—75％。2、按照權(quán)利要求l所述的白花蛇舌草提取物，其特征在于雞矢藤苷甲酯的含量在10°/tl5%。3、按照權(quán)利要求l所述的白花蛇舌草提取物，其特征在于去乙?；嚾~草苷酸甲酯含量在10%—20%。4、按照權(quán)利要求l所述的白花蛇舌草提取物，其特征在于車葉草苷酸含量在20%~25%。5、按照權(quán)利要求l所述的白花蛇舌草提取物，其特征在于車葉草苷含量在15°A~~25°/o。6、一種如權(quán)利要求l所述的白花蛇舌草提取物的分離制備方法，其特征在于分為提取、醇沉、膜分離、非極性大孔樹脂分離和工業(yè)色譜分離等步驟，具體為1)提取稱取白花蛇舌草原藥材，加入其重量6-10倍的水煎煮提取2-3次，每次1-3小時，得到提取液，將提取液濃縮至相對密度為0.9-1.10浸膏；2)醇沉將浸膏中加入乙醇使乙醇體積濃度達到50-70%,室溫靜置12-24小時，過濾，取濾液濃縮至相對密度1.05-1.10;再加入乙醇使乙醇體積濃度達到75-80%，室溫靜置12-24小時過濾，取濾液濃縮揮發(fā)除去乙醇，樣品溶液經(jīng)過10000-25000轉(zhuǎn)/分鐘的高速離心機離心；3)膜分離此醇沉組分再通過3000-6000Da的膜分離，得到膜分離組分；4)非極性大孔樹脂分離將膜分離組分上樣于非極性大孔樹脂柱，上樣量與分離材料體積比為1:100~500，分別采用流動相體積濃度10-30%的乙醇和70-95%乙醇洗脫，每次洗脫的體積為3-5個柱體積，流速為1-3個柱體積/小時；循環(huán)洗脫，洗脫液濃縮，即為白花蛇舌草大孔樹脂分離組分；5)工業(yè)色譜分離以粒徑5-20微米的OEG系列硅膠鍵合固定相為色譜填料，以甲醇和水為流動相，梯度洗脫，甲醇的體積濃度從2-100%變化，收集目標組分，干燥處理即為白花蛇舌草提取物。7、一種如權(quán)利要求6所述的白花蛇舌草提取物的分離制備方法，其特征在于所述色譜柱效為5000-20000塔板/米。8、一種如權(quán)利要求6所述的白花蛇舌草提取物的分離制備方法，其特征在于所述色譜柱長為200毫米~600毫米，色譜柱內(nèi)徑為20毫米一300全文摘要一種白花蛇舌草提取物及其分離制備方法，其中主要成分為雞矢藤苷甲酯、去乙?；嚾~草苷酸甲酯、車葉草苷酸和車葉草苷，所述的四種主要成分總含量在60％-75％。白花蛇舌草藥材經(jīng)提取、醇沉、膜分離、非極性大孔樹脂分離和工業(yè)色譜分離等步驟，獲得提取物。本制備方法可有效的去除糖蛋白、多糖、氨基酸等雜質(zhì)，提高了主要活性成分的含量。制備過程重復性高和可操作性好，易于實現(xiàn)標準化和產(chǎn)業(yè)化，同時對于白花蛇舌草藥材的質(zhì)量控制也有一定的指導意義。文檔編號A61P1/16GK101496845SQ200810010309公開日2009年8月5日申請日期2008年2月1日優(yōu)先權(quán)日2008年2月1日發(fā)明者豐加濤,青徐,李存滿,梁鑫淼,章飛芳,薛興亞申請人:中國科學院大連化學物理研究所