專利名稱：：N-4-羥苯視黃酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬藥物領(lǐng)域，涉及N-4-羥苯視黃酰胺新的藥用用途，具體涉及N-4-羥苯視黃酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的用途。技術(shù)背景N-4-羥苯視黃酰胺[N-4-(hydroxyphenyl)retinamide]，簡稱4-HPR(fenretinide)，為一種人工合成視黃酸衍生物，目前主要作為腫瘤化療藥物，用于多種腫瘤的治療，包括白血病、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、皮膚癌、頭頸部的腫瘤。而且其對人體毒性較小，無肝臟毒性。研究表明，N-4-羥苯視黃酰胺(4-HPR)抗腫瘤的機(jī)制在于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，4-HPR對其它細(xì)胞是否有誘導(dǎo)凋亡的作用是個(gè)未知數(shù)。肝纖維化是指肝組織學(xué)上有廣泛的纖維結(jié)締組織增生、沉積；肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化病變過程中膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的主要生成細(xì)胞，抑制HSC的活化與增殖是目前開發(fā)研究肝纖維化治療藥物的主要靶目標(biāo)，現(xiàn)有技術(shù)不斷有報(bào)道針對肝臟纖維結(jié)締組織增生制備的肝纖維化的中藥制劑。有關(guān)該領(lǐng)域已將肝纖維化的逆轉(zhuǎn)、抑制HSC活化與增殖以及生成、分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，提高間質(zhì)性膠原酶活性作為研究開發(fā)肝纖維化治療藥物的重要目標(biāo)之一。目前，有關(guān)抗肝纖維化的有效的化學(xué)藥物報(bào)道尚未多見。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供N-4-羥苯視黃酰胺新的藥用用途，具體涉及N-4-羥苯視黃酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的用途。本發(fā)明對N-4-羥苯視黃酰(簡稱4-HPR(fenretinide))，進(jìn)行了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，很低劑量的4-HPR就能誘導(dǎo)肝纖維化過程中產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞一肝星狀細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對肝細(xì)胞，則需要很高的劑量才可誘導(dǎo)凋亡，兩者相差十倍。進(jìn)一步采用N-4-羥苯視黃酰胺進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，分別在肝纖維化建模的第1周(預(yù)防)和第5周(治療)用4-HPR進(jìn)行干預(yù)。測得肝組織內(nèi)膠原蛋白含量(肝組織切片天狼猩紅染色結(jié)合圖象分析技術(shù)半定量)的變化，肝組織羥脯氨酸含量的變化及血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血清白蛋白(ALB)和球蛋白(GLO)的變化，結(jié)果表明，4-HPR具有抗肝纖維化的藥理作用，證實(shí)4-HPR對肝纖維化有明顯的干預(yù)作用，而且無明顯加重肝功能異常的副作用。所述的4-HPR購自美國國立癌癥研究院(NCI)腫瘤預(yù)防研究所。本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了N-4-羥苯視黃酰胺新的防治慢性肝病肝纖維化的醫(yī)療用途，所述的N-4-羥苯視黃酰胺可制成注射制劑、緩釋劑或口服制劑，使用方便。有推廣價(jià)值。具體實(shí)施方式實(shí)施例l一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)清潔級(jí)BALB/c雄性小鼠(中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部)，體重18-20g,隨機(jī)分為以下幾組正常對照組(n=10)、正常小鼠37.5mg/kgBW用藥組(11=11)、正常小鼠112.5mg/kgBW用藥組(n-11)、肝纖維化模型組(n42)、肝纖維化模型+溶劑干預(yù)組(11=12)、預(yù)防性干預(yù)作用又分:低劑量(12.5mg/kgBW)組(n=14)、中劑量(37.5mg/kgBW)組(n=15)、高劑量(112.5mg/kgBW)組(n=ll);治療性干預(yù)作用又分低劑量(12.5mg/kgBW)組(n=14)、中劑量(37.5mg/kgBW)組(n=15)、高劑量(112.5mg/kgBW)組(n=13)。正常對照組用生理鹽水代替四氯化碳及4-HPR;肝纖維化模型組用25%四氯化碳橄欖油溶液以5ml/kgBW的劑量進(jìn)行腹腔注射，每周二次，共10周；溶劑采用含1.65mg/ml牛血清白蛋白的生理鹽水制備5%乙醇溶液，預(yù)防性干預(yù)均從實(shí)驗(yàn)第l周開始用藥，均腹腔注射，每周4次，共10周；治療性干預(yù)從實(shí)驗(yàn)第5周開始用藥，方法同上，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第IO周為止。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠在乙醚麻醉下眼球后血管采血，用于肝功能指標(biāo)血清ALT、ALB、及GLO的生化測定。繼而處死，準(zhǔn)確稱取0.5g肝組織兩份，液氮速凍后-70'C保存，用于羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量測定；部分肝組織置于10%中性福爾馬林固定后，常規(guī)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切成5um連續(xù)切片，用于HE和天狼猩紅染色，后者染色結(jié)果在Axiophot-2數(shù)碼圖象分析儀(Zeiss)上，用隨機(jī)分析軟件KS400進(jìn)行相對定量。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.肝組織內(nèi)膠原蛋白的變化天狼猩紅可特異地與組織內(nèi)膠原蛋白反應(yīng)而染成猩紅色，在偏振光下，還可大致區(qū)分I型和III型膠原，因此肝臟組織切片經(jīng)天狼猩紅染色后進(jìn)行圖象分析可以對組織內(nèi)膠原含量進(jìn)行半定量。各組小鼠肝組織內(nèi)膠原蛋白含量變化如表1所示。正常小鼠單用不同劑量4-HPR后，肝內(nèi)膠原蛋白含量與正常小鼠無差別，說明4-HPR不會(huì)增加正常肝臟膠原蛋白含量。四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化的小鼠肝臟膠原蛋白明顯增加，說明肝纖維化模型建立成功。統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果是純粹使用溶劑與模型組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義，說明溶劑對肝纖維化無干預(yù)作用；而無論是預(yù)防性還是治療性干預(yù)，4-HPR均能明顯降低肝纖維化小鼠肝臟內(nèi)膠原的含量中劑量時(shí)平均降低66%，且呈現(xiàn)劑量依賴性。表l.是各組小鼠肝臟膠原蛋白及羥脯氨酸含量。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*與正常對照組比較，/<0.05;A與肝纖維化模型組比較，；<0.052.肝組織羥脯氨酸含量的變化羥脯氨酸是膠原蛋白特有的氨基酸，與膠原分子內(nèi)交聯(lián)有關(guān)，故羥脯氨酸含量可以間接反映膠原蛋白的含量。用生化方法測得的各組小鼠肝臟內(nèi)羥脯氨酸的含量見表l。正常小鼠單用不同劑量4-HPR后，肝內(nèi)羥脯氨酸含量與正常小鼠無差別，說明4-HPR不會(huì)增加正常肝臟膠原蛋白含量。四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化的小鼠肝臟羥脯氨酸含量明顯增加，說明肝臟內(nèi)膠原含量明顯增多，肝纖維化模型建立成功。純粹使用溶劑與模型組相比，羥脯氨酸含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義，說明溶劑對肝纖維化無干預(yù)作用。而無論是預(yù)防性還是治療性干預(yù)，4-HPR均能明顯降低肝纖維化小鼠肝臟內(nèi)羥脯氨酸的含量中劑量時(shí)平均降低39.7%,且呈現(xiàn)劑量依賴性。從另一個(gè)方面證實(shí)4-HPR的確可以明顯減輕肝纖維化。3.血清ALT、ALB、及GLO的變化各組小鼠血清ALT、ALB和GLO的測定結(jié)果如表2所示。和正常小鼠比，肝纖維化組小鼠血清ALT有升高，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性意義，使用4-HPR的各組血清ALT與對照組比統(tǒng)計(jì)學(xué)上也無顯著性意義。說明長期使用4-HPR對肝細(xì)胞無明顯損傷。但使用高劑量4-HPR后，與模型組相比血清白蛋白水平有所下降，大量使用該藥時(shí)可能會(huì)影響肝臟中白蛋白代謝。表2.是各組小鼠血清肝功能測定結(jié)果。表2,<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)N-4-羥苯視黃酰胺(4-HPR)對四氯化碳所致的肝纖維化有明顯的干預(yù)作用。同時(shí)無明顯加重肝功能異常的副作用。權(quán)利要求1、N-4-羥苯視黃酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的用途。2、按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的用途是預(yù)防性或治療性干預(yù)。3、按權(quán)利要求2所述的用途，其中所述的預(yù)防性或治療性干預(yù)呈劑量依賴性。4、一種預(yù)防或治療肝纖維化的藥物，其特征是含權(quán)利要求l所述的N-4-羥苯視黃酰胺。5按權(quán)利要求4所述的預(yù)防或治療肝纖維化的藥物，其特征是制成注射制劑、緩釋劑或口服制劑。全文摘要本發(fā)明屬藥物領(lǐng)域，涉及N-4-羥苯視黃酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的用途。本發(fā)明對N-4-羥苯視黃酰進(jìn)行了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，低劑量的4-HPR能誘導(dǎo)肝纖維化過程中產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞—肝星狀細(xì)胞發(fā)生凋亡；采用四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行預(yù)防或治療干預(yù)，結(jié)果表明，4-HPR具有抗肝纖維化的藥理作用，證實(shí)4-HPR對肝纖維化有明顯的干預(yù)作用，而且無明顯加重肝功能異常的副作用。證實(shí)了N-4-羥苯視黃酰胺新的防治慢性肝病肝纖維化的醫(yī)療用途，可進(jìn)一步制成注射制劑、緩釋劑或口服制劑，使用方便，有推廣價(jià)值。文檔編號(hào)A61P1/16GK101229147SQ200710172980公開日2008年7月30日申請日期2007年12月24日優(yōu)先權(quán)日2007年12月24日發(fā)明者張錦生,朱虹光,瑾錢申請人:復(fù)旦大學(xué)