脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因疫苗及其制備和應(yīng)用的制作方法

專利名稱：脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因疫苗及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及用于預(yù)防或治療結(jié)核病 的疫苗及其制備方法和應(yīng)用，特別是一種脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝 的結(jié)核基因疫苗及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的結(jié)核病的死灰復(fù)燃是當(dāng)今全球重大的
健康問題，由于人口密集度和流動性日益增加、常規(guī)BCG疫苗的無效 性、結(jié)核耐藥菌株的出現(xiàn)、以及AIDS病導(dǎo)致的結(jié)核并發(fā)感染，目前 結(jié)核發(fā)病及死亡非常嚴(yán)重，全球每年有800萬活動性結(jié)核患者并導(dǎo)致 300萬死亡；我國約有5.5億人口曾經(jīng)感染結(jié)核，每年13萬人死于結(jié)核， 每月約有12萬新發(fā)病人。2006年結(jié)核己一躍成為我國感染性疾病發(fā)病 的首位，研制新型結(jié)核預(yù)防疫苗非常迫切。
結(jié)核研究表明，結(jié)核桿菌主要感染肺部巨噬細(xì)胞。誘導(dǎo)Th1型的 細(xì)胞免疫應(yīng)答對于清除結(jié)核桿菌至關(guān)重要，誘導(dǎo)CD4+Th1及其分泌 的高水平的IFNy，不僅能夠增強巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌能力，還可以 通過促進(jìn)CD8 + CTL的誘導(dǎo)發(fā)揮特異性殺傷結(jié)核感染細(xì)胞，發(fā)揮免疫 保護(hù)作用?；蛞呙缁蚍QDNA疫苗，是將外源目的基因構(gòu)建于真核表 達(dá)質(zhì)粒、直接注射動物的第三代疫苗，由于可在體內(nèi)表達(dá)目的抗原， 通過外源性、內(nèi)源性以及交叉抗原提呈途徑被DC細(xì)胞提呈，有效激 活CD4+Th1禾口CD8+T細(xì)胞，因此特別有利于誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答。
除誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答至關(guān)重要以外，誘導(dǎo)肺粘膜局部的粘 膜T細(xì)胞免疫應(yīng)答同樣非常關(guān)鍵。結(jié)核桿菌主要通過呼吸道粘膜入侵機體，粘膜免疫是人體免疫的第一道防線，可在感染的早期和最初感 染部位有效控制感染，防止感染擴散。誘導(dǎo)呼吸道和肺部特異性粘膜 免疫應(yīng)答，對于有效控制結(jié)核早期感染具有非常重要的意義，因此結(jié) 核特異性粘膜免疫的誘生成為新型結(jié)核疫苗研制的熱點問題。通過呼 吸道給予DNA疫苗可更好地模擬結(jié)核桿菌的天然感染，誘導(dǎo)特異性粘 膜免疫，在粘膜局部感染的第一時間清除病原體，可能會產(chǎn)生更為有 效的抗結(jié)核免疫保護(hù)作用。
然而，通常粘膜部位接種抗原通常很難誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，這是由于
粘膜局部纖毛的頻繁擺動、粘膜局部水解酶、DNA酶的大量存在，使 得外來抗原迅速降解，不足以被APC提呈。因此需要通過粘膜疫苗遞 送系統(tǒng)來對DNA疫苗進(jìn)行組裝，而后在粘膜部位免疫。
因此，應(yīng)用申請人過去申請的脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)(一種含粘 膜佐劑的脫乙酰殼聚糖粘膜遞送系統(tǒng)和其應(yīng)用。專利申請?zhí)?200610147575.1)，根據(jù)這一專利的方法，再以申請人過去申請的基 于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗(基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗及其 制備方法和應(yīng)用。專利申請?zhí)?00710171416.X)為基礎(chǔ)，以特定 性質(zhì)的一種chitosan天然多糖通過共聚沉淀的方法與結(jié)核基因疫苗 形成chitosan-DNA納米顆粒復(fù)合物，而后進(jìn)行滴鼻免疫，誘導(dǎo)結(jié)核 特異性全身和肺部T細(xì)胞應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核 基因疫苗及其制備和應(yīng)用，所述的這種脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的 結(jié)核基因疫苗要解決現(xiàn)有技術(shù)中由于常規(guī)BCG疫苗的無效性、以及結(jié) 核耐藥菌株的出現(xiàn)和AIDS病導(dǎo)致的結(jié)核伴發(fā)感染使得現(xiàn)有疫苗預(yù)防 和治療結(jié)核病的效果不佳的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因疫 苗，由脫乙酰殼聚糖與結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒組成，所述的結(jié)核抗原編碼 質(zhì)粒由一個載體構(gòu)成，在所述的載體中插入有結(jié)核桿菌熱休克蛋白的 全長基因，所述的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65的全長基因中嵌合有
來自結(jié)核桿菌抗原的4個T細(xì)胞表位多肽基因，所述的4個T細(xì)胞 表位分別是結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因，結(jié)核桿菌 Ag85A蛋白的369 405位基因，結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207 位基因，結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因。
進(jìn)一步的，所述的載體為真核表達(dá)質(zhì)粒，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒選 自pcDNA3.1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì)粒。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌的熱休克蛋白HSP65的氨基酸序列 如SEQIDNO: l所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌的熱休克蛋白HSP65基因的DNA序 列如SEQIDNO: 2所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因的氨 基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因的 DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因的氨 基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因的 DNA序列如SEQ ID N0:6所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因的氨 基酸序列如SEQ ID N0:7所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因的氨 基酸序列如SEQ ID N0:9所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因的 DNA序列如SEQ ID NO: 10所示。
進(jìn)一步的，在結(jié)核桿菌的熱休克蛋白HSP65全長基因中的第438 位堿基后插入結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因、第486位堿 基后插入結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因、第1185位堿基 后插入結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因和結(jié)核桿菌Ag85B 蛋白的420 459位基因。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因和所 述的結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因之間以gccgcctac基因 序列相連接。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核基因疫苗，嵌合了結(jié)核桿菌4個T細(xì)胞表 位基因的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65的全長基因所構(gòu)成的外源目的 基因蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:ll所示。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核基因疫苗，嵌合了結(jié)核桿菌4個T細(xì)胞表 位基因的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65的全長基因所構(gòu)成的外源目的 基因的DNA序列如SEQIDNO: 12所示。
進(jìn)一步的，所述的一種以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，所用的脫乙酰殼聚糖的分子量在380000 420000之間，脫 乙酰度為75%-85%。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟-
1) 提取結(jié)核分枝桿菌DNA作為模板，通過PCR方法擴增結(jié) 核桿菌熱休克蛋白HSP65編碼基因；2) 以結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65基因作為模板，分別通過 PCR擴增彼此有17個堿基重疊的雙鏈DNA片段1 、片段 2、片段3，所述的片段l的雙鏈DNA的序列為
taccggttct
gccctcgccg cgggagcggc
ttcttC3CCC
ctggaggatc gacctcctsg
gatgscgtcg ctsctgcsgc
gagggcctgc ctcccggscg
6taggccgtgg ttccggcscc
ctcgtct33C
gcgatttcgg cgctss3gcc
C33ttgcgtai gttsatcgc3t
t3cgccaittt
gtgcccccsc cscgggggtg
cgt3cg3g33 gcatgctctt
ccggtgscgg ggccsctgcc
gc3scgtcgc cgttgcaLgcg
tcttccsgtg
cggccsccga gccggtggct
cgggtg3CC3 gcccactggt
gctgcttctc
ggtg3cattg ccactgtaaic
ctsgtggttg
gstcggcgcc ctsgccgcgg
cscc3cg3cg gtggtgctgc
ggccggcgcc ccggccgcgg
cgagsccctg gctctgggac
cg3Cttgttg
gtccstcg csggtsgc
gcccgtcgcg cgggc3gcgc
ggccccssgg ccggggttcc
gstggtgtgt
Ct3CC3C3C3
gagctggtca ctcgsccagt
gccsccgtgc cggtggcacg
sacccgctcg ttgggcgsgc
ctcsagggcg gsgttcccgc
gcgctgcsga cgcg3cgtct
gcctcgsgcg cgg3gctcgc
gccgcsscgt cggcgttgc3
ccstcgcc33 ggtsgcggtt
3ag3ggt3gc ttctccatcg
tggcccsggc accgggtccg
gtctcs3aicg csgsgtttgc
ccssggsggt ggttcctccs
scctggcgcg tggsccgcgc
gggcttgasc. cccgsscttg
cgtcctggaa gcsggscctt
cctctagctc
gttcttctgg
gttggttcgc caaccsagcg
cggcstcgai3 gccgtagctt
gctctggttc
g3cgatcgc3 ctgct3gcgt
所述的片段2的雙鏈DNA的序列為
gcttcttcgg cgsagssgcc
ctcctcsggt
ggctscstct ccgatgtaga
CCCt3C3tCC
gggstgtsgg
gagasggtca ctcttccsgt
gcgctgtccs cgcgscaggt
gctcccggct cgsgggccgs
ggtc3ggtgs ccagtccact
ggc33ggccc ccgttccggg
gacaccgacg ctgtggctgc
tccg3ctscg 3ggctg3tgc
gtgatcasgg C3ctsgttcc
gtggtgcgct c3cc3cgcg3
gggtg3cc3 ccc3ctggt
cgctgacgct gcgsctgcgs
3cscctttgg tgtgg333cc
cggggt3ctt gcccc3tg33
tgctggtcsg 3cgscc3gtc
tcggagccgg 3gcctcggcc
ccctggtcgt gggscc3gca
tcggcgsccg egccgctggc
tcdgcgaiags agtcgcttct
gcssggtcgt cgyyccagca
ccstcgccgg ggtagcggcc
3ccgtg3g33 tggcsctctt
ccggtgccgc ggccscggcg
sggttcttcg
gtccstcggt csggtagcca
ggcgstggsc ccgctacctg
gctgcagctc cgdcgtcgag
cgtgsccg3c gcsctggctg
ctcc3sggtg gsggttccsc
tssgccgctg sttcggcgac
caacasgatc gttgttctag
ccgc3aLggcg ggcgttccgc
ggtcggcctg ccsgccggsc
ggtcscc3sg ccsgtggttc
acgagtggcc tgctcaccgg
gctgcsggag cg3cgtcctc
C3ccg3ggtc ggcg€tccgc
3gcc33t33g tcggtt3ttc
g3cctgstcg ctggsctagc
ggccscccgt
gsgctc3ccg ctcgstgtggc
ccggetgcgtc ggcctcgcag
tccactgtca 3ggtgacsgt
ctgstc3tcg gsct3gt3gc
cgcggcscct gcgccgtggs
3tgctgcsgg taicgscgtcc
tgcgscctct
g3cg3g3cc3 ctgctctggt
cagstccgcc gtctsggcgg
cggctggcc3 gccgaiccggt
cttgagttcc
csga3gcsgg gtcttcgtcc
ccgsgggtct ggctccc3g3
scgagggcgt tgctcccgcs
sgggt3tgcg tccc3t3cgc
sggsggcggt tcctccgccs
sggstctgct tcctsgacgs
ccgsggacgt ggctcctgca
tC3sgtcggt 3gttcsgcc3
atatggccat t3tsccggt3
3cgccg3cct tgcggctggs
ccstcgtcgs ggtagcagct
3ggsgatcg3 tcctctagct
agctggccgg tcgatccggcc
tcgcgttcgt
33ctcgccgc ttgsgcggcg
ttcgatggct
catcaccgtc gtsgtggcag
gttcg3c33g casgctgttc
cctggaggsc ggscctcctg
gccgctgctc cggcgacgag
cgsgggcgsg gctcccgctc
ggcggtcasg ccgccsgttc
tctcaccggt sgsgtggccs
gtcgctgcts C3gcgscg3t
gggcgccggt cccgcggcca
gascagcgac cttgtcgctg
tggtgtcgcg 3ccscsgcgc
ccgc3tcgeig ggcgtsgctc
ctscc gstgg
12所述的片段3的雙鏈DNA的序列為
ttcatctacg
gtcgsggaggcsgctcctcc
gscgsgctgsctgctcgsct
gsggccccgccaccggggcg
33ggtgcgca1ttccscgcgt
ctgctcgctg
gcgtccstcgcgcaggt3gc
gsgsaggcttctcttccgss
gg 3sctcgccgc ctaiccsgcsgcc ttgagcggcg gatggtcgtc
csaggccgccgttccggcgg
cccgsccctggggctgggac
ggtggcgctgccaccgcgac
ggtggccgaigcc3ccggcgc
ctscg3gg3tgstgctcct3
gcagaatgcgcgtcttscgc
gccgg3333gcggccttttc
ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcaatgcggccgagcga c6Lgccgggac gacctacgcc aagcgttacg
gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgcsagcggccgtsgcsgcg gccsccccc3 cactgcgaca scgttcgccg
agctcg33gg cgacgsggcg accggcgcca acstcgtgaatcgagcttcc gctgctccgc tggccgcggt tgtagcactt
tgsagcsgat cgccttcaac tccgggctgg sgccgggcgtacttcgtcts gcggssgttg aggcccgscc tcggcccgca
scctgccggc tggcc3cgg3 ctgsscgctc agsccggtgttgg3cggccg accggtgcct gacttgcgag tctggccacs
ccggcgttgc tgscccggtc saggtgaccc gttcggcgctggccgcsscg sctgggccsg ttccactggg cssgccgcga
cggggctgtt cctgaccacc gaggccgtcg ttgccgacaagccccgacss ggsctggtgg ctccggcsgc 3acggctgtt
ccgttcccgg tggcggcgac atgggtggca tggstttcccgaatgggcc accgccgctg tscccaccgt acctssag;
3)將上述的3段片段混合，變性成為單鏈，通過彼此重疊的17個堿基互補連接，以此作為模板，通過PCR方法擴增獲得嵌合了 4個T細(xì)胞表位的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65外源目的基因，將目的基因經(jīng)EcoRI和Hind III雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的載體連接，獲得權(quán)利要求1所述的結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒。
進(jìn)一步的，是以SEQIDNO: 13所示的HSP65上游引物和SEQ
ID NO: 15所示的引物HSP65T1序列通過PCR擴增片段1。
進(jìn)一步的，以SEQIDNO: 16所示的引物HSP65T2序列和SEQ
ID NO: 17所示的引物HSP65E1序列通過PCR擴增片段2。
進(jìn)一步的，以SEQ ID NO: 18所示的引物HSP65E2序列和SEQ
ID NO: 14所示的HSP65下游引物通過PCR擴增片段3。
具體的，是將上述的片段1和片段2混合，熱變性使各自成為
單鏈DNA，由于片段l、 2有17個堿基的重疊DNA序列，因此可互
補成為雙鏈，再通過PCR法可擴增獲得片段(1+2)的片段，再與
片段3混合，熱變性成為單鏈，由于片段2和片段3也有17個堿基的重疊DNA序列，因此可互補成為雙鏈，用SEQIDNO: 13所示的HSP65上游引物和SEQIDNO: 14所示的下游引物經(jīng)PCR可擴增獲得片段(1+2+3)，即嵌合了4個T細(xì)胞表位的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65外源目的基因。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核分枝桿菌DNA自結(jié)核分枝桿菌H37Rv株。
進(jìn)一步的，所述的載體選自pcDNA3.1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種制備上述的一種以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因疫苗的方法，包括以下步驟
(1) 構(gòu)建結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒pECANS;
(2) 將0.01~0.04%濃度、PH5.5-5.7的脫乙酰殼聚糖溶液，與50 400昭/ml pECANS質(zhì)粒溶液在50-60 °C下，以15000-17000rpm速度高速混旋，在所述的脫乙酰殼聚糖溶液中，所述的脫乙酰殼聚糖的分子量在38000 420000之間，脫乙酰度75% 85%，所述的質(zhì)粒DNA溶解在5mM 25mM的Na2S04中，通過共聚交聯(lián)作用，獲得的脫乙酰殼聚糖-pECANS納米顆粒為球形，直徑在50 200nm之間。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，含有有效量的上述的一種以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因疫苗，以及藥學(xué)上可以接受的載體或者賦形劑。
本發(fā)明還提供了上述的一種以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因疫苗在制備預(yù)防或治療結(jié)核病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過DNA預(yù)測軟件，從結(jié)核分枝桿菌的已知的4種關(guān)鍵抗原Ag85A、 Ag85B、 ESAT-6和CFP-10中各自篩選了一個T細(xì)胞表位，共4個T細(xì)胞表位，擬構(gòu)建含有4個T細(xì)胞表位的結(jié)核靶抗原編碼質(zhì)粒。
14由于表位的氨基酸序列僅有8 — 20個，結(jié)構(gòu)太小和簡單，免疫原性很弱，通常不能誘導(dǎo)很強的免疫應(yīng)答。因此擬挑選一種載體基因，將4
個T細(xì)胞表位插入載體基因中，共同構(gòu)成結(jié)核外源目的基因。
本發(fā)明選擇結(jié)核桿菌來源的熱休克蛋白65 (HSP65)作為嵌入T細(xì)胞表位的基因載體。HSP65是熱休克蛋白60家族成員，在細(xì)菌到人體細(xì)胞有很高的同源性。全長1623bp，編碼540個氨基酸，分子量65kD。選擇結(jié)核桿菌來源HSP65作為嵌入T細(xì)胞表位的基因載體的原因有兩點1、 HSP內(nèi)含有多個結(jié)核T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，本身就是重要的免疫保護(hù)性抗原，已證實HSP65作為目的抗原免疫小鼠可產(chǎn)生抗結(jié)核強保護(hù)性免疫應(yīng)答，且與產(chǎn)生IFN-Y的CD8VCD44hi細(xì)胞有關(guān)。2、HSP作為細(xì)胞內(nèi)伴侶蛋白，參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位、折疊和裝配，可幫助嵌入的表位更好地折疊形成空間結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明選擇的4個T細(xì)胞表位來自以下4種結(jié)核抗原
1) Ag85A， 295氨基酸。結(jié)核菌的培養(yǎng)濾液中分泌蛋白的一個主要成分是Ag85復(fù)合體(antigen 85 complex),由Ag85A、 Ag85B、 Ag85C組成的相對分子質(zhì)量為38000蛋白家族。Ag85A可刺激機體產(chǎn)生體液免疫，也可激發(fā)Thl型細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞增殖和IL-2及IFN-y等上升。
2) Ag85B，蛋白質(zhì)全長285氨基酸，分子量34.6KD。又稱MPT59、Rvl886，是一種分枝桿菌轉(zhuǎn)移酶，與細(xì)菌細(xì)胞壁合成有關(guān)，具有多個T細(xì)胞表位，能誘導(dǎo)Thl反應(yīng)、IFN-Y的產(chǎn)生。
3) ESAT-6，又稱Rv3875，全長288bp， 95個氨基酸，分子量9.9KD，僅在強毒株中有這種抗原。含有多個T細(xì)胞表位，能激活CD4+、 CD8+T細(xì)胞，在抗結(jié)核保護(hù)性免疫應(yīng)答中起重要作用。ESAT-6還可刺激Mtb病人的外周血T細(xì)胞增殖，促進(jìn)IFN-Y釋放。用ESAT-6和佐劑制成的亞單位疫苗免疫小鼠具有較好的保護(hù)性。
4) CFP-IO，低分子量結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白，全長303bp， IOO個氨基酸，分子量10000，與結(jié)核分枝桿菌毒力有關(guān)，刺激機體產(chǎn)生強烈
的T細(xì)胞免疫應(yīng)答并釋放高水平的IFN-Y。
BCG傳代過程中ESAT-6和CFP-10基因丟失，而在絕大多數(shù)毒株
中這兩個基因都存在。
本發(fā)明通過BLAST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫比對、DNAstar生物軟件分析以及親疏水性、柔軟性、抗原指數(shù)、表面可及性等參數(shù)的分析，選擇各類參數(shù)均較好的結(jié)構(gòu)區(qū)域作為候選疫苗表位區(qū)段；然后通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(http:〃www.syfpeithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)分析予頁測這些區(qū)段中存在的T細(xì)胞抗原表位、同時與HLAI、 II類分子可高親和力結(jié)合的表位。經(jīng)過計算機分子預(yù)測最后獲得的4個T細(xì)胞表位分別是結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因(EAST-6189—228);結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因(Ag85A369-4()5);結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因(CFP10162_207);結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因(Ag85B42(M59)。分別插入到HSP65基因的第438位堿基、第486位堿基、第1185位堿基后，構(gòu)建結(jié)核靶抗原編碼質(zhì)粒。
本發(fā)明在pcDNA3.1或pVAX1質(zhì)粒中，插入一段結(jié)核外源目的基因，作為靶抗原編碼質(zhì)粒，該結(jié)核外源目的基因由4個結(jié)核T細(xì)胞表位嵌合到結(jié)核HSP65蛋白的3個非關(guān)鍵結(jié)構(gòu)位置所共同構(gòu)成，經(jīng)分析，4個表位的嵌入不會影響HSP65本身的正常三級、四級空間結(jié)構(gòu)，因此將這一嵌合有4個T細(xì)胞表位的HSP65基因的靶抗原編碼質(zhì)粒稱為ECANS (Epitope Cast in ANatural Structure, ECANS)。
本發(fā)明的疫苗可以以滴鼻、口服或經(jīng)生殖道方式實施粘膜部位接種。
進(jìn)一步的，所述的結(jié)核基因疫苗的粘膜免疫方法如下
1) 首先對動物進(jìn)行輕度麻醉；
2) 在鼻腔、口腔或生殖道內(nèi)逐滴注入脫乙酰殼聚糖-pECANS納
16米顆粒，
3) 二周后重復(fù)1) +2)的免疫過程，
4) 共免疫3 4次，pECANS DNA總量在150 200兇。
本發(fā)明采用的脫乙酰殼聚糖(chitosan，化學(xué)名為P-(l—4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖)是甲殼類動物來源的天然生物多糖，是幾丁質(zhì)(chitin)的脫乙酰衍生物，完全無毒，具有生物可容性和生物可降解性。更重要的是脫乙酰殼聚糖天然帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的粘膜天然靜電吸附，因此具有增強粘膜黏附吸收作用；此外還具有促進(jìn)胞間運輸、緩釋和生物可降解等多種良好特性，已被廣泛用于藥物賦形劑與緩釋劑。
以合適分子量和脫乙酰度的脫乙酰殼聚糖與質(zhì)粒DNA在特定的濃度、溫度、pH值、振蕩速度條件下，可形成大小不一的共聚復(fù)合物。本發(fā)明以特定性質(zhì)的脫乙酰殼聚糖制備特定溶液，與特定的DNA溶液，以共凝聚方法成功制備了直徑在50-200nm的納米顆粒復(fù)合物。具體選擇0.02。/。濃度、PH.5.7的脫乙酰殼聚糖(分子量約400000，脫乙酰度75% 85%)溶液，與400iLig/ml編碼靶抗原的質(zhì)粒DNA(pcDNA3.1載體構(gòu)建)溶液(5mM Na2S04),在55。C下，以15000rpm速度高速混旋，通過共聚交聯(lián)作用，制備了脫乙酰殼聚糖-結(jié)核耙抗原DNA納米顆粒。
本發(fā)明中，將chitosan-pECANS結(jié)核基因疫苗免疫小鼠的方法采用滴鼻方式，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行以常規(guī)小鼠麻醉方法輕度麻醉小鼠，將小鼠鼻孔向上，以槍頭吸取<20|11液體直接逐滴滴入鼻腔內(nèi)，待液滴隨小鼠呼吸自主進(jìn)入呼吸道后，再滴下一滴液體?？山惶娴稳雰蓚€鼻孔。液體總體積不宜超過5CVI。
本發(fā)明中，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒的載體，包括任何可以轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的高效真核表達(dá)質(zhì)粒載體，包括但不限于pcDNA3.1 、pVAX以及常見和市售的真核質(zhì)粒載體。本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的"成分是適用于人和動物而無過度 不良副反應(yīng)(如毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng))、有合理效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。
本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的載體"成分是用于將具有活性的有 效成分傳送給人或動物的藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑和賦形劑。所 述的載體可以是液體、固體或半固體。載體包括但不限于水、PBS 緩沖液、生理鹽水、葡萄糖、甘油、疊氮鈉及其組合。
本發(fā)明的藥物組合物，含有上述有效成分和藥學(xué)上可接受的載 體。通常將其配制于無毒、中性、惰性和藥學(xué)上可接受的水性載體介
質(zhì)中，pH值通常約6—8。
綜上所述，本發(fā)明公開的一種脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的多表
位ECANS結(jié)核粘膜基因疫苗，具有以下三大特性
1 )其核心是一種已申請專利的pECANS多表位靶抗原編碼質(zhì)粒 (基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗及其制備方法和應(yīng)用。專利申請 號200710171416.X)，其中編碼的結(jié)核耙抗原包括結(jié)核桿菌HSP65 蛋白基因，和嵌入其中的4個結(jié)核桿菌優(yōu)勢抗原來源的4個T細(xì)胞 表位，理論上含有至少5種結(jié)核抗原，可誘導(dǎo)多抗原特異性的、更有 效的抗結(jié)核免疫保護(hù)作用。
2) 通過已申請專利的脫乙酰殼聚糖粘膜遞送系統(tǒng)chitosan ( — 種含粘膜佐劑的脫乙酰殼聚糖粘膜遞送系統(tǒng)和其應(yīng)用。專利申請?zhí)?200610147575.1 )，與上述pECANS質(zhì)粒DNA形成共聚復(fù)合物后， 再通過粘膜途徑接種DNA疫苗，具有安全無毒性、緩釋性、親粘膜 性等多種優(yōu)勢，可促進(jìn)粘膜局部特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。
3) 該結(jié)核粘膜基因疫苗通過優(yōu)化免疫途徑、免疫程序、免疫劑 量、間隔時間，能更有效地誘導(dǎo)全身和粘膜T細(xì)胞和抗體應(yīng)答。
本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明的 chitosan-pECANS結(jié)核粘膜疫苗通過滴鼻途徑免疫小鼠，有效誘導(dǎo)針 對多個結(jié)核抗原的特異性抗體應(yīng)答；更重要的是，能誘導(dǎo)全身及肺臟
18粘膜局部很強的結(jié)核特異性T細(xì)胞殺傷應(yīng)答，同時可誘導(dǎo)分泌高水平
IFNy的Thl免疫應(yīng)答，效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)BCG結(jié)核疫苗。


圖1顯示了 chitosan-pECANS結(jié)核粘膜疫苗的構(gòu)建示意圖。圖 A顯示了 pECANS結(jié)核基因疫苗的構(gòu)建圖；圖B顯示了 chitosan與 pECANS形成共聚復(fù)合物示意圖；圖C顯示了 chitosan-pECANS納 米顆粒的電鏡圖。
圖2顯示了通過HSP65上游引物/T1、 T2/E1、 E2/HSP65下游引 物三對引物分別擴增得到的雙鏈DNA片段1 (l-508bp)、片段 2(491-1315bp)、片段3(1298-1788bp)，而后通過彼此重疊的17個堿 基互補相連得到嵌合4個T細(xì)胞表位的HSP65全長基因，其中，粗 體帶下劃線的序列是插入的4個T細(xì)胞表位序列。
圖3顯示了本發(fā)明中嵌合4個T細(xì)胞表位的HSP65全長基因的 質(zhì)粒PCR (圖3A)、酶切(圖3B)及部分測序鑒定結(jié)果(圖3C)。
圖4顯示了 chitosan-pECANS結(jié)核粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠誘生 結(jié)核特異性抗體血清IgG水平。圖A顯示HSP65抗原特異性IgG的 水平；圖B顯示Ag85A抗原特異性IgG效價；圖C顯示EAST6特 異性IgG效價。
圖5顯示了 chitosan-pECANS結(jié)核粘膜疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的特 異性淋巴細(xì)胞殺傷活性。
圖6顯示了免疫小鼠脾細(xì)胞經(jīng)結(jié)核抗原刺激后分泌IFN-y的水平。
圖7顯示了 chitosan-pECANS結(jié)核粘膜疫苗滴鼻免疫誘生脾臟 特異性IFN-y+T細(xì)胞數(shù)量。圖A顯示HSP65抗原特異性IFN-y+T的 水平；圖B顯示Ag85A抗原特異性IFN-y+T數(shù)量；圖C顯示EAST6 特異性IFN-y+T數(shù)量。
19圖8顯示了 chitosan-pECANS結(jié)核粘膜疫苗滴鼻免疫誘生肺局 部特異性IFN-y+T細(xì)胞數(shù)量。
具體實施例方式
以下是本發(fā)明的具體實施例，所述的實施例是用于描述本發(fā)明的 使用和用途，而不是限制本發(fā)明。
實施例中采用的質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、動物及試劑如下
結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)H37Rv株(上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)防科 提供)。質(zhì)粒pcDNA3.1(-)、 pVAX、 pET32a、宿主細(xì)菌DH5a 、 BL21(lnvitrogen公司)?；蚝铣晌猩虾Ｙ惏偈⒐?。chitosan (分 子量在380000 420000之間，脫乙酰度為75%-85%)購自sigma 公司、CFSE和PI染料購自sigma公司、小鼠IFN-y ELISA檢測試 劑盒購自R&D公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG多克隆抗體(Sant Clous 公司)；。HSP65蛋白為本實驗室自行表達(dá)(見200610027572.4號 專利)、Ag85A及ESAT-6蛋白由上海市海歸生物科技公司李忠明教 授惠贈、Ag85A 、 ESAT-6多肽委托上海吉爾公司合成、 Upofectamin-2000購自invitrogen公司。限制性核酸內(nèi)切酶EcoR /、 MA7d/// (TaKaRa公司)、T4DNA連接酶(MBI公司)；TaqDNA聚 合酶(Promega公司)；RNase A(Ameresco公司)；dNTP(Promega 和華美生物公司)；LB培養(yǎng)基(英國OXOID公司)，瓊脂粉、瓊脂糖、 SDS、 EB (上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站)，Tris(USB公司)，瓊脂糖膠回 收試劑盒(上海華舜公司)，大量質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen)。 6-8周 齡雌性BALB/c(H-2d)小鼠購自上海斯萊克實驗動物中心，清潔級飼 養(yǎng)。動物詞養(yǎng)及操作符合國家相關(guān)規(guī)定。
實施例l: pcDNA3.1-ECANS結(jié)核基因疫苗的構(gòu)建 1、 ECANS結(jié)核基因疫苗的目的T細(xì)胞表位的預(yù)測
20通過BLAST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫、DNAstar生物軟件、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫 (http:〃www.syfJ5eithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)分析，綜 合親疏水性、柔軟性、抗原指數(shù)、表面可及性、與HLAI、 II類分子 結(jié)合、等參數(shù)，預(yù)測獲得的4個T細(xì)胞表位結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白 的189 228位基因(EAST-6189-228);結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因(Ag85A滿5);結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基 因(CFP10162-207);結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因 (Ag85B420—459)。
以pcDNA3.1或pVAX為質(zhì)粒載體，以結(jié)核分枝桿菌HSP65基 因作為嵌合表位的基因載體，在計算機預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，在 其中不影響關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的位置第438位堿基后插入ESAT-6189 228表 位基因、第486位堿基后插入Ag85A369 405、第1185位堿基后插 入CFP-10162 207和Ag85B420 459， CFP-10和Ag85B之間以 gccgcctac相連接，如圖1A所示。
實施例2 pcDNA3.1-ECANS結(jié)核基因疫苗的構(gòu)建
為了不在HSP65基因和T細(xì)胞表位基因之間引入酶切位點，本 發(fā)明利用DNA引物直接合成和PCR的方法，從5 '和3'端依次擴 增三段彼此部分重疊的包含部分HSP65基因和T細(xì)胞表位的基因片 段，變性后通過彼此重疊的互補序列連接，最后用5'和3'兩端HSP65 引物PCR擴增出嵌合有4個T細(xì)胞表位的HSP65全長基因。同時在 基因兩端分別帶上J5coR /和歷>^///酶切位點，經(jīng)雙酶切后可連接入 載體pcDNA3.1(-)或原核表達(dá)載體pET32a。
首先提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv株(上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié) 防科)DNA，作為模板，用HSP65上游引物(SEQIDNO: 13)和 下游引物(SEQIDNO: 14)通過PCR方法擴增獲得HSP65片段，回收并純化PCR產(chǎn)物(華舜公司小量膠回收試劑盒)。
以HSP65基因作為模板，分別以引物HSP65上游引物(SEQID NO: 13)和T1引物(SEQIDNO: 15)通過PCR擴增片段1 (如圖 2所示HSP65上游引物和Tl相對，經(jīng)PCR擴增得到的1 一508bp雙 鏈DNA片段)，所述的片段1的雙鏈DNA的序列為
3tggcc3sga t3ccggttct
gccctcgccg cgggagcggc
a^g^gtggg
ttCttC3CCC
ctggagg3tc gacctcctsg
gatgacgtcg ctactgcagc
gsgggcctgc ctcccggscg
asggccgtgg ttccggcscc
gsgcsgsttg ctcgtctssc
gcgatttcgg cgctsaagcc
caaittgcgts gttsacgc3t
tacgccattt
gtgccccc己c cscgggggtg
cgt3cgatg33 gcatgctctt
ccggtgscgg ggccactgcc
gcaacgtcgc cgttgcsgcg
sgaaggtcsc tcttccagtg
cggccsccgs gccggtggct
cgggtg3cc3 gccc3ctggt
gctgcttctc
ggtgscattg ccactgtaac
ctagtggttg
gaitcggcgcc ctagccgcgg
C3cc3cgaicg gtggtgctgc
ggccggcgcc ccggccgcgg
cgsgsccctg gctctgggac
gctgascssc cgacttgttg
gtccatcg csggtagc
gcccgtcgcg cgggcsgcgc
ggcccc33gg ccggggttcc
gatggtgtgt
gaigctggtc己 ctcgaccsgt
gccaiccgtgc cggtggcacg
ascccgctcg ttgggcgsgc
ctcs3gggcg gagttcccgc
gcgctgcsgs cgcgscgtct
gcctcgsgcg cggsgctcgc
gccgcs3cgt cggcgttgca
ccstcgccs3 ggtsgcggtt
ttctccatcg
tggcccaggc accgggtccg
gtctc3aacg csgagtttgc
ccaaggaggt ggttcctcca
scctggcgcg tggaccgcgc
gggcttg3ac cccgsscttg
cgtcctggaa gcsggscctt
cctctsgctc
gttcttctgg
gttggttcgc casccasgcg
gccgtagctt
cgaig5icc33g gctctggttc
gacgaitcgca ctgctsgcgt
，以T2引物(SEQIDNO: 16)禾C1E1弓1物(SEQIDNO: 17)通過 PCR擴增片段2 (如圖2所示T2引物和E1相對，經(jīng)PCR擴增得到 的491 一 1315bp雙鏈DNA片段)，所述片段2的雙鏈DNA的序列為
gggtgacca gtccatcggt ccc3ctggt csggtagccs
gcttcttcgg cga3g33gcc
g3gg3gtcc3 ctcctcsggt
ggctsc3tct ccg3tgt3g3
CCCt3C3tCC
gggstgtagg
ctcttccsgt
gcgctgtcca cgcgscsggt
gctcccggct cgagggccga
ggtcsggtg3 ccagtccact
ggcaaggccc ccgttccggg
gscsccgscg ctgtggctgc
cgctgscgct gcgactgcga
3C3cctttgg tgtggs3scc
cggggtsctt gccccstgs3
tgctggtcag 3cgsccsgtc
tcggsgccgg sgcctcggcc
ccctggtcgt gggscc3gc3
tcggcgsccg sgccgctggc
tcsgcgaags 3gtcgcttct
gcasggtcgt cgyycc6Lgcs
ccstcgccgg ggtaigcggcc
ggcgatggsc ccgctscctg
gctgcsgctc cgscgtcgsg
cgtgsccgsc gcsctggctg
ctccssggtg gsggttccac
tasgccgctg attcggcg3c
gttgttctsg
ggcgttccgc
ggtcggcctg ccagccggsc
ggtcscc33g ccsgtggttc
3cg3gtggcc tgctc3ccgg
gaicctgstcg ctggactagc
33ggtgggc3 ggccscccgt
gsgctcaccg ctcgagtggc
ccggagcgtc ggcctcgcsg
tccactgtc3 sggtgscaigt
ctgatcatcg gsct3gtsgc
cgcggcscct gcgccgtggs
atgctgcagg tscgscgtcc
scgctggaga tgcgscctct
g3cg3gscc3 ctgctctggt
csgstccgcc gtctsggcgg
ccgsgggtct ggctcccsga
3cg3gggcgt tgctcccgca
agggtstgcg tcccst3cgc
aggsggcggt tcctccgcca
aggatctgct tcctsgscg3
ccgaggscgt ggctcctgca
tcasgtcggt 3gttC3gccs
st3tggcc3t tataccggta
acgccgacct tgcggctgga
ccstcgtcga ggtsgc3gct
3gg3g3tcg3 tcctctsgct
ttcgstggct asgctaccga
cstcsccgtc gtsgtggcsg
gttcgsc6L3g csagctgttc
cctggsggsc ggacctcctg
gccgctgctc cggcgacgag
cgsgggcgsg gctcccgctc
ggcggtcssg ccgccsgttc
tctcsccggt agagtggcca
gtcgctgct3 cagcgacgat
gggcgccggt cccgcggccs
ga3C3gcgsc cttgtcgctg
22tccg3Ctacg accgtgsgss gctgcsggsg cggctggccai sigctggccgg tggtgtcgcg 3ggctgstgc tggcsctctt cgacgtcctc gccgaccggt tcgaccggcc sccacsgcgc
gtgatcaagg ccggtgccgc caccgaggtc gaactcaagg agcgcaagca ccgcatcgag csctsgttcc ggccscggcg ggcgttccgc cttgagttcc tcgcgttcgt ggcgt3gctc
gtggtgcgct tcc33gaagc agccaataag cag3agc3gg ssctcgccgc ctscc C3ccscgcgai sggttcttcg tcggttattc gtcttcgtcc ttgsgcggcg gaitgg
以E2引物(SEQIDNO: 18)和HSP65下游引物(SEQ ID NO: 14) 通過PCR擴增片段3 (如圖2所示E2引物和HSP65下游引物相對， 經(jīng)PCR擴增得到的1298 —1788bp雙鏈DNA片段)，所述的片段3 的雙鏈DNA的序列為
gg ei己ctcgccgc Ct3cc3gc3g cc ttgagcggcg gatggtcgtc
ttcatctacg ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcaatgc csaggccgcc asgtagstgc ggccg3gcgs csgccgggsc gacctacgcc 33gcgttscg gttccggcgg
gtcgsggsgg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgscgctgt tgcasgcggc cccgsccctg cagctcctcc cgt3gcsgcg gccsccccc3 C3ctgcgac3 3cgttcgccg gggctgggsc
gscgsgctgs sgctcgssgg cgscgaggcg accggcgccs 3c3tcgtg33 ggtggcgctg ctgctcgact tcgagcttcc gctgctccgc tggccgcggt tgtagcactt ccaccgcgac
gaggccccgc tgaagcagat cgccttcaac tccgggctgg agccgggcgt ggtggccgag C3ccggggcg acttcgtct3 gcggasgttg sggcccgacc tcggcccgcs ccaccggcgc
aaggtgcgca acctgccggc tggccacgga ctgaacgctc agaccggtgt ctacgaggat ttccacgcgt tggacggccg accggtgcct gacttgcg3g tctggccscs g3tgctccts
ctgctcgctg ccggcgttgc tg3cccggtc a3ggtg3ccc gttcggcgct gc3g33tgcg gacgagcgac ggccgcaacg sctgggccsg ttccsctggg c36Lgccgcg己cgtcttacgc
gcgtccatcg cggggctgtt cctgaccacc gaggccgtcg ttgccgacsa gccggaaaag cgcsggtsgc gccccgdcss ggsctggtgg ctccggcsgc sscggctgtt cggccttttc
gagasggctt ccgttcccgg tggcggcgsc atgggtggcs tggstttc ctcttccgaa ccgsagggcc sccgccgctg tscccaccgt acct3aag;
將上述的片段1和片段2混合，變性使各自成為單鏈DNA，由 于片段l、 2有17個堿基的重疊DNA序列，因此可互補成為雙鏈， 再以HSP65上游引物和E1引物通過PCR法可擴增獲得片段(1+2) 的片段，再與片段3混合，變性成為單鏈，由于片段2和片段3也有 17個堿基的重疊DNA序列，因此可互補成為雙鏈，以HSP65上游 引物(SEQIDNO: 13)和HSP65下游引物(SEQIDNO: 14)作 為引物，通過PCR方法擴增獲得獲得片段(1+2+3)，即嵌合了 4 個T細(xì)胞表位的HSP目的基因即ECANS編碼基因(如圖2所示)。 PCR鑒定結(jié)果顯示產(chǎn)物為1807bp，如圖3A所示。再將擴增產(chǎn)物經(jīng)/和歷'wd ///雙酶切，回收酶切片段，與經(jīng)相應(yīng)酶切的載體
pcDNA3.1(-)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，氨芐青霉素篩選 轉(zhuǎn)化菌落。經(jīng)酶切(圖3B)及測序鑒定(圖3C)，成功構(gòu)建了 pcDNA3-ECANS真核表達(dá)質(zhì)粒。4段表位基因就以沒有酶切位點的 方式插入HSP65基因了。
將重組質(zhì)粒ECANS轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆，經(jīng)LB (AmplOO嗎/ml)液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)15h，收集菌體，按照QIAGEN PlasmidMegaKit去除雜蛋白、細(xì)菌內(nèi)毒素，得到純化質(zhì)粒。
實施例3 pET32a-ECANS原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化
將擴增得到的ECANS編碼基因片段或者HSP65基因用￡"7 / 和/// "http:///雙酶切，與經(jīng)相應(yīng)酶切的原核表達(dá)載體pET32a連接，構(gòu) 建了 pET32a-ECANS和pET32a-HSP65原核表達(dá)質(zhì)粒。
以pET32a-ECANS轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3 )感受態(tài)細(xì)胞，37°C 培養(yǎng)過夜，篩選陽性克隆。經(jīng)LB (AmplOOpg/ml)液體培養(yǎng)基振蕩 培養(yǎng)至A600達(dá)到0.75左右，加入異丙基硫代半糖苷(IPTG)至終 濃度為0.5mM。繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3小時，4000r/min離心20min收集菌 體，lxPBS重懸后超聲破碎，12000r/min于4i:離心20min，分別收 獲上清和沉淀。上清過親和層析柱，以不同濃度洗脫液洗脫，收集每 lml洗脫液，保存A280大于1.0的洗脫液，最后經(jīng)12% SDS-PAGE 電泳鑒定表達(dá)的蛋白。最后得到純化融合蛋白ECANS或HSP65。
實施例4 chitosan-pECNAS結(jié)核基因疫苗的制備
1) 質(zhì)粒DNA的大量制備依照QIAGEN Plasmid Mega Kit進(jìn)行。
2) 分別制備chitosan溶液和pcDNA3.1-pECANS溶液，方法如 下首先制備0.02。/。、 pH5,7的chitosan溶液，稱取0.02g chitosan
24(Fluka, MW約400000，脫乙酰度75%—85%)，先以500|jl-1 ml 1% HAc溶液將其緩慢溶解，37T:放置1hr。而后稱取0.042g NaAc，以 80mlH2O溶解，加入上述已徹底溶解的chitosan溶液，混勻后，以 1NNaOH調(diào)節(jié)pH值至5.7，此即0.02%、 pH5.7的chitosan溶液。 pcDNA3.1-pECANS質(zhì)粒以5mM閃32504溶解，DNA濃度為 1mg/ml， -20^保存?zhèn)溆谩?br> 3)采用共沉淀法(共凝聚法)制備chitosan-DNA納米顆粒， 方法如下在55"水浴中，將0.02%、 pH5.7的chitosan溶液逐滴 滴入400ug/ml質(zhì)粒DNA溶液中，同時15000rpm高速振蕩20秒， 即可形成均一略帶混濁的chitosan-DNA納米顆粒(圖1B、圖1C)。
實施例5 chitosan-pECNAS結(jié)核粘膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠
將6-8周BALB/c雌鼠分為9組，其中滴鼻免疫5組，分別為 chitosan-pECANS、 chitosan-pHSP65、 pcDNA3,1-ECANS (簡稱 pECANS)、 pcDNA3.1畫pHSP65 (簡稱pHSP65)、 chitosan;肌注 免疫3組，分別為pECANS、 pHSP65、 pcDNA3.1;皮下免疫組 BCG，每組6只小鼠。滴鼻免疫程序如下以0.75%戊巴比妥鈉 80-120|jI經(jīng)腹腔注射小鼠，使輕微麻醉。以含有50|jg質(zhì)粒DNA的 chitosan-pECANS疫苗溶液逐滴滴入小鼠兩惻鼻腔。肌注免疫程序 如下以0.75。/。戊巴比妥鈉80-120ijl經(jīng)腹腔注射小鼠，使輕微麻醉。 于小鼠脛骨前肌接種50ijgpECANS質(zhì)粒DNA疫苗，每腿50|jl。每 兩周免疫1次，共4次，質(zhì)?？偭繛?00pg。皮下免疫程序如下小 鼠麻醉后，以含有BCG (1x105CFU)的PBS于小鼠背部皮下多點 接種，總量100jjl。每兩周經(jīng)眼眶后眥靜脈采血，37。c靜置30min， 6000rpmx10min，收集血清，分裝凍存于-70。c。
實施例6 chitosan-pECANS滴鼻免疫可誘導(dǎo)結(jié)核特異性抗體應(yīng)答
25間接ELISA法檢測免疫小鼠血清中特異的抗結(jié)核抗原IgG。以 5嗎/mlHSP65蛋白、Ag85A蛋白、ESAT-6蛋白包被聚苯乙烯微孔板 (包被液0.1M Na2C03， pH9.6) 4。C過夜。以5% milk-PBS封閉板， 200ijI/孔，37。C化。依次加1: 50稀釋血清、湖口l/孔，37。C1h，洗 板后加HRP-羊抗小鼠IgG 37。C1h，洗板后以鄰苯二胺顯色30min， 2N H2S04終止反應(yīng)后測A49o值。
如圖4A顯示chitosan-pECANS結(jié)核粘膜基因疫苗免疫三次以 后在小鼠體內(nèi)誘生了 HSP65特異性IgG，在免疫第4周即可檢測到 HSP65特異性血清IgG，其水平隨時間不斷增高，于第10周達(dá)到 OD值1.03，抗體滴度為1:4200，顯著高于對照組。但I(xiàn)gG水平低 于chitosan-pHSP65、 pECANS、 pHSP65滴鼻組和pECANS、 pHSP65肌注組。此外，chitosan-pECANS結(jié)核粘膜基因疫苗還誘 導(dǎo)了另外兩種結(jié)核抗原Ag85A和ESAT-6特異性抗體應(yīng)答。其中， Ag85A特異性IgG于第10周達(dá)到最高，但不高于其他組(圖4B); 但其誘導(dǎo)的ESAT-6特異性IgG水平顯著高于其他各組，效價達(dá)4000 (圖4C)?？傊琧hitosan-pECANS疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)了較強的結(jié) 核多個抗原特異性抗體應(yīng)答。
實施例5 chitosan-pECANS滴鼻免疫可誘導(dǎo)脾臟T細(xì)胞的特異性 CTL殺傷和IFNy分泌
1)小鼠脾細(xì)胞CTL功能檢測
以瞬轉(zhuǎn)pcDNA3.1國HSP65的SP2/0 (SP2/0-HSP65)作為耙細(xì) 胞，制備方法如下取5ijg純化pcDNA3.1-HSP65加入245pl無血 清1640中；取10pl Lipofectamin-2000加入2,1無血清1640中， 分別小心混勻，將DNA逐滴加入到Lipofectamin-2000中，輕輕混 勻，室溫靜置20min，逐滴加入2x106 SP2/0細(xì)胞表面，收集24hr 細(xì)胞作為靶細(xì)胞。
26取末次免疫后10天小鼠脾臟細(xì)胞，重懸于含20U/ml IL-2的完 全1640中，以5"07細(xì)胞/孔接種6孔板，加入HSP65蛋白 (200|jg/ml)， 37°C， 5%002體外培養(yǎng)7天作為效應(yīng)細(xì)胞，并以1pm CFSE進(jìn)行標(biāo)記。將2x10S個效應(yīng)細(xì)胞/孔接種入96孔圓底板中，同 時以100: 1、 50: 1、 10: 1的比例加入相應(yīng)數(shù)量耙細(xì)胞，37°C， 5 %002共孵育4小時，收集細(xì)胞，以20|jg/ml Pl進(jìn)行染色，4。C染色 30分鐘后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行CTL檢測，計算被殺傷的靶細(xì)胞 (CFSEPI+)的百分比。
結(jié)果顯示，效靶比為50:1時，chitosan-pECANS組特異性殺傷 率達(dá)79.66%，高于其他疫苗免疫組和陽性對照BCG組(圖5)，提 示chitosan-pECANS基因疫苗有效誘生了較強的結(jié)核特異性細(xì)胞免 疫應(yīng)答，有抵抗結(jié)核分枝桿菌感染的潛能。 2)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-Y水平檢測
取末次免疫后10天小鼠脾臟細(xì)胞，以HSP65蛋白(200ijg/ml)， 體外刺激培養(yǎng)(同上)，取48hr、 96hr、 144hr培養(yǎng)上清1ml，用小 鼠IFN-y ELISA試劑盒(R&D)檢測脾臟T細(xì)胞分泌IFN-y水平。
ELISA方法以4pg/ml大鼠抗小鼠IFN-y抗體(PBS)包被4°C 過夜；以1。/。BSA-PBS封閉；依次加100lJl細(xì)胞培養(yǎng)上清或標(biāo)準(zhǔn)品、 0.4ng/ml生物素標(biāo)記羊抗小鼠IFN-y抗體，100pl HRP標(biāo)記鏈親和素 (Str印tavidin-HRP),以O(shè)PD顯色，2NH2S04終止，OD柳nm讀數(shù), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算培養(yǎng)上清中IFN-Y表達(dá)量。
如圖6所示，與其他疫苗免疫組相比，chitosan-pECANS滴鼻 免疫小鼠脾臟T細(xì)胞經(jīng)抗原特異性刺激后，分泌最高水平的IFN-y， 48hr最高，隨后逐漸下降，但至144hr時仍高達(dá)1700pg/ml，提示 該疫苗能夠有效激活分泌IFN-y的脾臟T細(xì)胞，有利于打破因結(jié)核桿 菌感染而引起的免疫耐受或免疫抑制狀態(tài)。 (3)小鼠脾細(xì)胞IFN-Y+T細(xì)胞的ELISPOT檢測以ELISPOT方法直接檢測脾臟T細(xì)胞中分泌IFNy的T細(xì)胞。 以5pg/ml IFN-y包被抗體100ijI/孔4'c包被過夜，吸去孔內(nèi)液體，用 200|J|完全1640 37°c封閉2hr。去液體，取末次免疫后10天小鼠脾 臟，重懸于含20U/ml IL-2的完全1640中，以1"06細(xì)胞/孔加入 ELISPOT板，隨后分別加入特異性抗原HSP65蛋白(200|jg/ml)、 表位多肽Ag85A 、 ESAT-6(20|jg/ml)或非特異性抗原 ConA(10(jg/ml),37。c， 5XCO2培養(yǎng)60hr，吸棄各孔液體，加200|jl 冰預(yù)冷的去離子水，在冰上放置10min， pbst洗3次。加100ijI生 物素標(biāo)記的抗小鼠IFN-Y檢測抗體(2yg/ml)， 37'c放置1 hr。去液 體，PBST洗3次。加100|j| HRP標(biāo)記鏈親和素(Str印tavidin-HRP)， 37°C1 hr， PBST洗4次，PBS洗2次，拍干。力Q 100|jl AEC底物 避光顯色30min，用自來水沖洗終止反應(yīng)，室溫下干燥板，在免疫斑 點成像分析儀下計數(shù)斑點。
結(jié)果顯示，chitosan-pECANS結(jié)核粘膜疫苗經(jīng)滴鼻免疫后，脾 臟hsp65特異性分泌IFN-y的t細(xì)胞較其他組最高，達(dá)550/106脾 細(xì)胞(圖7A)。此外，表位Ag85A、 ESAT-6特異性IFN-y+T細(xì)胞 數(shù)量也最高，分別為400、 280/106脾細(xì)胞(圖7B、圖7C)。提示 chitosan-pECANS可誘生強烈的結(jié)核特異性IFN-y+T細(xì)胞的產(chǎn)生。
實施例6 chitosan-pECANS滴鼻免疫可誘導(dǎo)肺粘膜局部T細(xì)胞的 特異性CTL殺傷和IFNy分泌
1)小鼠肺臟局部淋巴細(xì)胞細(xì)胞的分離
分離免疫小鼠肺臟局部淋巴細(xì)胞，分離方法如下取末次免疫后
10天小鼠肺組織，稱重約100 mg/只，剪碎置于消化液中(膠原酶 (1mg/ml)、 DNA酶(5U/ml)、完全1640)， 300mg/10ml消化液，于 37°C搖床180 rpm振搖60min。將混懸液過尼龍指套去除碎塊， 1500rpm離心5mjn,細(xì)胞重懸于4ml 40% Percoll中，輕柔加至等
28體積70% Percoll上方，2400rpm離心30 min，吸取淋巴細(xì)胞，10 ml PBS洗滌1次，重懸于含有20U/ml IL-2的完全1640中，調(diào)整濃度 為5xl06/ml備用。
2)小鼠肺臟局部淋巴細(xì)胞IFN-y ELISPOT檢測 以ELISPOT方法直接檢測肺臟T細(xì)胞中分泌IFNy的T細(xì)胞， 方法同實施例5: IFN-y包被抗體包板，加入5"05末次免疫后10 天小鼠肺臟淋巴細(xì)胞，再加入特異性抗原HSP65蛋白(200jjg/ml)、 表位Ag85A、 ESAT-6(20ijg/ml)或ConA(10ijg/ml)刺激培養(yǎng)60hr，加 抗小鼠IFN-y抗體和HRP標(biāo)記鏈親和素，最后AEC底物避光顯色。 如圖8所示，chitosan-pECANS免疫小鼠肺臟局部HSP65特 異性IFN-y+T細(xì)胞數(shù)量顯著高于其他各組，達(dá)到280個IFN-y+ SFC/106肺淋巴細(xì)胞。在表位Ag85A、 ESAT-6特異性IFN-y+T細(xì)胞 方面，chitosan-pECANS粘膜疫苗同樣誘導(dǎo)了最高數(shù)目的IFN-y+丁 細(xì)胞，分別達(dá)290、330個IFN-Y+SFC/1()6肺淋巴細(xì)胞；肌注pECANS 組也誘導(dǎo)了的IFN-y+T細(xì)胞，分別為160、 170。結(jié)果提示， chitosan-pECANS通過呼吸道粘膜給入后，可誘導(dǎo)肺局部特異性分 泌IFNy的功能性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，提示其可能在感染早期和感染 局部有效清除結(jié)核桿菌，有效預(yù)防結(jié)核發(fā)生的潛力。序列表
<110〉 復(fù)旦大學(xué)
<120>脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因疫苗及其制備和應(yīng)用 <160> 18
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1 <211> 540 <212> PRT
<213>結(jié)核桿菌熱休克蛋白65 <400> 1
Met Ala Lys Thr lie Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu 1 5 10 15
Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro
20 25 30
Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr lie
35 40 45
Thr Asn Asp Gly Val Ser He Ala Lys Glu lie Glu Leu Glu Asp Pro
50 55 60
Tyr Glu Lys lie Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr 65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gin
85 90 95
Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro
100 105 no
Leu Gly Leu Lys Arg Gly He Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu
115 120 125
Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gin lie Ala
130 135 140
Ala Thr Ala Ala lie Ser Ala Gly Asp Gin Ser lie Gly Asp Leu lie 145 150 155 160
Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val lie Thr Val Glu
165 170 175
Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gin Leu Glu Leu Thr GIu Gly Met Arg
30180 185 190
Phe Asp Lys Gly Tyr lie Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg
195 200 205
Gin Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr lie Leu Leu Val Ser Ser Lys
210 215 220
Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val lie Gly 225 230 235 240
Ala Gly Lys Pro Leu Leu lie He Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala
245 250 255
Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ik Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val
260 265 270
Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gin
275 280 285
Asp Met Ala lie Leu Thr Gly Gly Gin Val lie Ser Glu Glu Val Gly
2卯 295 300
Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys 305 310 315 320
Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr lie Val Glu Gly Ala Gly Asp
325 330 335
Thr Asp Ala lie Ala Gly Arg Val Ala Gin lie Arg Gin Glu lie Glu
340 345 350
Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gin Glu Arg Leu Ala
355 360 365
Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val He Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu
370 375 380
Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg He Glu Asp Ala Val Arg Asn 385 3卯 395 400
Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly He Val Ala Gly Gly Gly Val Thr
405 410 415
Leu Leu Gin Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp
420 425 430
Glu Ala Thr Gly Ala Asn lie Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu
435 440 445
Lys Gin lie Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu
450 455 460
Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gin Thr Gly 465 470 475 480
Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val485 490 495
Thr Arg Ser Ala Leu Gin Asn Ala Ala Ser lie Ala Gly Leu Phe Leu
500 505 510
Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser
515 520 525
Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe 530 535 540
<210> 2 <211> 1620 <212> DNA
<213〉結(jié)核桿菌熱休克蛋白65 <400> 2
atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac 60
gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa 120
aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag 180
ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc 240
gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc 300
gagggcctgc gcaacgtegc ggceggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa 360
aaggccgtgg agaaggtoac cgagaccctg cteaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag 420
gagcagattg cggccaccgc agcgatttcg gcgggtgacc agtccatcgg tgacctgatc 480
gccgaggcga tggacaaggt gggcaacgag ggcgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc 540
tttgggctgc agctcgagct caccgagggt atgcggttcg acaagggcta catctcgggg 600
tacttcgtga ccgacccgga gcgtcaggag gcggtcctgg aggaccccta catcctgctg 660
32gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat ctgctgccgc tgctcgagaa ggtcatcgga 720
gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggcgct gtccaccctg 780
gtcgtcaaca agatccgcgg caccttcaag tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggc 840
gaccgccgca aggcgatgct gcaggatatg gccattctca ccggtggtca ggtgatcagc 900
gaagaggtcg gcctgacgct ggagaacgcc gacctgtcgc tgctaggcaa ggcccgcaag 960
gtcgtggtca ccaaggacga gaccaccatc gtcgagggcg ccggtgacac cgacgccatc 1020
gccggacgag tggcccagat ccgccaggag atcgagaaca gcgactccga ctacgaccgt 1080
gagaagctgc aggagcggct ggccaagctg gccggtggtg tcgcggtgat caaggccggt 1140
gccgccaccg aggtcgaact caaggagcgc aagcaccgca tcgaggatgc ggttcgcaat 1200
gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtgggg gtgtgacgct gttgcaagcg 1260
gccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa ggcgacgagg cgaccggcgc caacatcgtg 1320
aaggtggcgc tggaggcccc gctgaagcag atcgccttca actccgggct ggagccgggc 1380
gtggtggccg agaaggtgcg caacctgccg gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt 1440
gtctacgagg atctgctcgc tgccggcgtt gctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg 1500
ctgcagaatg cggcgtecat cgcggggctg ttcctgacca ccgaggccgt cgttgccgac 1560
aagccggaaa鄉(xiāng)aga鄉(xiāng)c ttccgttccc ggtggcggcg acatgggtgg catggatttc 1620
<210> 3 <211> 13 <212> PRT
<213> 結(jié)核桿菌EAST-6189-228抗原 <400> 3
33Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gin Asn Leu Ala Arg Thr lie 1 5 10
<210> 4 <211> 39 <212> DNA
<213> 結(jié)核桿菌EAST-6189-228抗原 <400> 4
gagctgaaca acgcgctgca gaacctggcg cggacgatc 39
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 結(jié)核桿菌Ag85A369-405抗原
<400> 5
Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu 1 5 10
<210> 6 <211> 36 <212> DNA
<213> 結(jié)核桿菌Ag85A369-405抗原 <400> 6
ggtctttcga tggctgcttc ttcggcgctg acgctg 36
<210> 7 <211〉 15 <212> PRT
<213> 結(jié)核桿菌CFP-10162-207抗原 <400> 7
Val Val Arg Phe Gin Glu Ala Ala Asn Lys Gin Lys Gin Glu Leu1 5 10 15
<210> 8 <211> 45 <212> DNA
<213>結(jié)核桿菌CFP-10162-207抗原 <400> 8
gtggtgcgct tccaagaagc agccaataag cagaagcagg aactc 45
<210〉 9
<211> 13
<212> PRT
<213>結(jié)核桿菌Ag85B420-459抗原
<400> 9
Gin Gin Phe lie Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu 1 5 10
<210> 10 <2U> 39 <212> PRT
<213〉結(jié)核桿菌Ag85B420-459抗原 <400> 10
Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr Ala Cys Gly
15 10 15
Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Gly Cys Thr Gly Thr Cys Gly Gly Cys
20 25 30
Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly 35
<210> 11 <211> 596 <212> PRT
35<213>嵌合了 4個T細(xì)胞表位的結(jié)核桿菌熱休克蛋白65外源目的基因蛋白 <400> 11
Met Ala Lys Thr lie Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu 1 5 10 15
Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro
20 25 30
Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr lie
35 40 45
Thr Asn Asp Gly Val Ser lie Ala Lys Glu lie Glu Leu Glu Asp Pro
50 55 60
Tyr Glu Lys He Gly Ala Giu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr 65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gin
85 90 95
Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro
100 105 110
Leu Gly Leu Lys Arg Gly lie Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu
115 120 125
Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gin lie Ala
130 135 140
Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gin Asn Leu Ala Arg Thr He Ala 145 150 155 160
Ala lie Ser Ala Gly Asp Gin Ser lie Gly Asp Leu lie Ala Glu Gly
165 170 175
Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Met Asp Lys Val
180 185 l卯
Gly Asn Glu Gly Val lie Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu
195 200 205
Gin Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys Gly Tyr lie Ser
210 215 220
Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gin Glu Ala Val Leu Glu Asp 225 230 235 240
Pro Tyr lie Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp Leu
245 250 255
Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val lie Gly Ala Gly Lys Pro Leu Leu lie
260 265 270
lie Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn
36<formula>formula see original document page 37</formula>580 585 590
Gly Met Asp Phe 595
<210> 12 <211> 1788 <212> DNA
<213>嵌合了4個T細(xì)胞表位的結(jié)核桿菌熱休克蛋白65外源目的基因 <400> 12
atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac 60
gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa 120
aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag 180
ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc 240
gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc 300
gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa 360
aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag 420
gagcagattg cggccaccga gctgaacaac gcgctgcaga acctggcgcg gacgatcgca 480
gcgatttcgg cgggtgacca gtccatcggt gacctgatcg ccgagggtct ttcgatggct 540
gcttcttogg cgctgacgct ggcgatggac aaggtgggca acgagggcgt catcaccgtc 600
gaggagtcca acacctttgg gctgcagctc gagctcaccg agggtatgcg gttcgacaag 660
ggctacatct cggggtactt cgtgaccgac ccggagcgtc aggaggcggt cctggaggac 720
ccctacatcc tgctggtcag ctccaaggtg tccactgtca aggatctgct gccgctgctc 780
gagaaggtca tcggagccgg taagccgctg ctgatcatcg ccgaggacgt cgagggcgag 840gcgctgtcca ccctggtcgt caacaagatc cgcggcacct tcaagtcggt ggcggtcaag 900
gctcccggct tcggcgaccg ccgcaaggcg atgctgcagg atatggccat tcteaccggt 960
ggtcaggtga tcagcgaaga ggtcggcctg acgctggaga acgccgacct gtcgctgcta 1020
ggcaaggccc gcaaggtcgt ggtcaccaag gacgagacca ccatc.gtcga gggcgccggt 1080
gacaccgacg ccatcgccgg acgagtggcc cagatccgcc aggagatcga gaacagcgac 1140
tccgactacg accgtgagaa gctgcaggag cggctggcca agctggccgg tggtgtcgcg 1200
gtgatcaagg ccggtgccgc caccgaggtc gaactcaagg agcgcaagca ccgcatcgag 1260
gtggtgcgct tccaagaagc agccaataag cagaagcagg aactcgccgc ctaccagcag 1320
ttcatctacg ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcaatgc caaggccgcc 1380
gtcgaggagg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgcaagcggc cccgaccctg 1440
gacgagctga agctcgaagg cgacgaggcg accggcgcca acatcgtgaa ggtggcgctg 1500
gaggccccgc tgaagcagat cgccttcaac tccgggctgg agccgggcgt ggtggccgag 1560
aaggtgcgca acctgccggc tggccacgga ctgaacgctc agaccggtgt ctacgaggat 1620
ctgctcgctg ccggcgttgc tgacccggtc aaggtgaccc gttcggcgct gcagaatgcg 1680
gcgtccatcg cggggctgtt cctgaccacc gaggccgtcg ttgccgacaa gccggaaaag 1740
gagaaggctt ccgttcccgg tggcggcgac atgggtggca tggatttc 1788
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> HSP65上游引物
<400> 13gaagaattca tggccaagac aattgcg
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> HSP65下游引物
<柳> 14
cataagcttt cagaaatcca tgccacc
<210> 15 <211> 88 <212> DNA <213> Tl引物 <400> 15
cgatggactg gtcacccgcc gaaatcgctg cgategtccg cgccaggttc tgcagcgcgt tgtteagctc ggtggccgca atctgctc
<210〉 16 <211> 88 <212> DNA <213> T2引物 <400> 16
gggtgaccag tccatcggtg acctgatcgc cgagggtctt tcgatggctg cttcttcggc gctgacgctg gcgatggaca aggtgggc
<210> 17 <211> 73 <212〉 DNA <213> El引物 <400> 17
ggtaggcggc gagttcctgc ttctgcttat tggctgcttc ttggaagcgc accacctcgatgcggtgctt gcg
<210> 18 <211> 73 <212> DNA <213> E2弓l物 <400> 18
ggaactcgcc gcctaccagc agttcatcta cgccggctcg ctgtcggccc tgctggatgc 60 ggttcgcaat gcc 7權(quán)利要求
1. 一種以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因疫苗，其特征在于所述的結(jié)核基因疫苗由脫乙酰殼聚糖與結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒組成，所述的結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒由一個載體構(gòu)成，在所述的載體中插入有結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65的全長基因，所述的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65的全長基因中嵌合有來自結(jié)核桿菌抗原的4個T細(xì)胞表位多肽基因，所述的4個T細(xì)胞表位分別是結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189～228位基因，結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369～405位基因，結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162～207位基因，結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420～459位基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于所述的載體為真核表達(dá)質(zhì)粒，所述的真核表達(dá)質(zhì) 粒選自pcDNA3.1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì)粒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于所述的結(jié)核桿菌的熱休克蛋白HSP65的氨基酸序 列如SEQIDNO: l所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于所述的結(jié)核桿菌的熱休克蛋白HSP65基因的DNA 序列如SEQIDNO: 2所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于所述的結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因 的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于所述的結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因 的DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因疫苗，其特征在于所述的結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因 的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于所述的結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因 的DNA序列如SEQ ID NO:6所示。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于所述的結(jié)核桿菌CFP-IO蛋白的162 207位基因 的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于所述的結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因 的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于所述的結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因 的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于所述的結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因 的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于在結(jié)核桿菌的熱休克蛋白HSP65全長基因中的第 438位堿基后插入結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228位基因、第486 位堿基后插入結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因、第1185位堿 基后插入結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因和結(jié)核桿菌Ag85B 蛋白的420 459位基因。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基 因疫苗，其特征在于所述的結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因和所述的結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因之間以gccgcctac 基因序列相連接。
15. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于嵌合了結(jié)核桿菌4個T細(xì)胞表位基因的結(jié)核桿菌 熱休克蛋白HSP65的全長基因所構(gòu)成的外源目的基因蛋白的氨基酸序 列如SEQIDNO:ll所示。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因 疫苗，其特征在于嵌合了結(jié)核桿菌4個T細(xì)胞表位基因的結(jié)核桿菌 熱休克蛋白HSP65的全長基因所構(gòu)成的外源目的基因的DNA序列如 SEQIDNO: 12所示。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基 因疫苗，其特征在于所用的脫乙酰殼聚糖的分子量在380000 420000之間，脫乙酰度為75%-85%。
18. —種如權(quán)利要求1所述的結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟1) 提取結(jié)核分枝桿菌DNA作為模板，通過PCR方法擴增 結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65編碼基因；2) 以結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65基因作為模板，分別通過 PCR擴增彼此有17個堿基重疊的雙鏈DNA片段1、片段2、 片段3，所述的片段1的雙鏈DNA的序列為3tggcc3sgs cssttgcgt3 cg3cg33gag gcccgtcgcg gcctcg3gcg gggcttg3sc taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggsgctcgc cccgsacttggccctcgccg stgcggtsss ggtgac3ttg ggccccssgg gccgcsscgt cgtcctggss cgggagcggc tacgccsttt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggaccttaagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctcctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtsgc cssgssgsLCC gacctcctsg gcstgctctt ctagccgcgg ctcgsccsgt ttctccstcg gttcttctgggatgacgtcg ccggtgacgg caccscgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcggagggcctgc gcsacgtcgc ggccggcgcc sscccgctcg gtctc333cg cggcstcgsa ctcccggscg cgttgcsgcg ccggccgcgg ttgggcgsgc csgsgtttgc gccgtaigcttssggccgtgg ttccggcsccgagcsgattg ctcgtctascgcgstttcgg cgct333gccag33ggtc3c cg3g3ccctg ctcssgggcg ccssggsggt cg3g3cc33g tcttccsgtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttccggccaccg3 gctgaacaac gcgctgcags scctggcgcg gacgatcgca gccggtggct cgacttgttg cgcgacgtct tggaccgcgc ctgctagcgtcgggtgscc3 gtcc3tcg gcccectggt caggtsgc ，所述的片段2的雙鏈DNA的序列為gcttcttcgg cg33g33gccg3gg3gtcc3 ctcctcaggtggctacatct ccgstgtagaCCC七3C3tCCgggstgtagggag33ggtca ctcttccagtgcgctgtccs cgcgsc3ggtgctcccggct cgsgggccgsggtcaggtga ccsgtccsctggcssggccc ccgttccggggaic3ccg3cg ctgtggctgctccgactacg sggctgstgcgtgstcasgg csct3gttccgtggtgcgct C3ccscgcg3gggtgaicc3 cccsctggtcgctgscgct gcgsctgcgs3cscctttgg tgtggsaacccggggt3ctt gcccc3tgastgctggtcag 3cgaccsgtctcggagccgg sgcctcggccccctggtcgt gggaccagcatcggcg3ccg agccgctggctcsgcgaaga agtcgcttctgcssggtcgt cgyyccagcaccstcgccgg ggtsgcggccaccgtgsg33 tggcsctcttccggtgccgc ggcc3cggcgtcc5L3ga6igc sggttcttcggtccatcggt caggtagccaggcgstggsc ccgct己cctggctgcsgctc cgscgtcgagcgtgsccgac gcsctggctgctcceiaiggtg gaggttccact33gccgctg aittcggcg3cgttgttctagccgcasggcg ggcgttccgcggtcggcctg ccsgccggscggtc己ccaeig ccsgtggttcscgsgtggcc tgctcsccgggctgcaggag cgscgtcctccsccg3ggtc ggcgttccgcagccaataag tcggttsttcgaicctgstcg ctggsctagc3sggtgggcs ggccscccgtgagctcaccg ctcgsgtggcccggsgcgtc ggcctcgcsgtccsctgtC3 aggtgacsgtctgatc3tcg g3ctsgtsgccgcggc3cct gcgccgtggsstgctgc3gg tacgacgtccacgctggsgai tgcgacctctgacgagaccs ctgctctggtcsgstccgcc gtct3ggcggcggctggccs gccgsccggtg6Lactcasgg cttgagttccc3g33gc3gg gtcttcgtccccgsgggtct ggctcccaga3cg3gggcgt tgctcccgcssgggtatgcg tcccstacgcaggaggcggt tcctccgccs3gg3tctgct tcctsgaLcgsccg3gg3cgt ggctcctgc3tcasgtcggt 3gttcsgcc3at3tggccst tataccggtaacgccgscct tgcggctggacc3tcgtcga ggtagcagcttcctctsgctagctggccgg tcgsccggcctcgcgttcgt3sctcgccgc ttgsgcggcgttcgstggctC3tc3ccgtc gtagtggcaggttcgac33g caagctgttccctggsggac ggacctcctggccgctgctc cggcgscgagcgagggcgag gctcccgctcggcggtcsag ccgccagttctctC3ccggt sgagtggccagtcgctgct3 csgcgscg3tgggcgccggt cccgcggccsg33csgcgsc cttgtcgctgtggtgtcgcg scc3csgcgcccgcatcgag ggcgt3gctcctscc gstgg ，所述的片段3的雙鏈DNA的序列為gg ssctcgccgc ctsccsgcag cc ttgagcggcg gatggtcgtcttc3tct3cg ccggctcgct gtcggccctg ctggstgcgg ttcgcsetgc cssggccgccaagtagstgc ggccgsgcg3 csgccgggac g3cctacgcc 33gcgttacg gttccggcgggtcgaggagg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgcssgcggc cccgaccctgcsgctcctcc cgtsgcsgcg gccacccccs csctgcg3C3 3cgttcgccg gggctgggacgacgagctga 3gctcgssgg cgscgaggcg accggcgcca acatcgtgaa ggtggcgctgctgctcgact tcgagcttcc gctgctccgc tggccgcggt tgtagc3ctt ccaccgcgacgsggccccgc tgaagcagat cgccttcaac tccgggctgg agccgggcgt ggtggccgagcaccggggcg acttcgtcts gcggsagttg aggcccgacc tcggcccgca ccaccggcgc3aggtgcgc3 scctgccggc tggccscgga ctgascgctc 3gsccggtgt ct3cgsggstttccacgcgt tggacggccg accggtgcct gacttgcgag tctggccaca gatgctcctactgctcgctg ccggcgttgc tgacccggtc aaggtgaccc gttcggcgct gcagaatgcggacgagcgac ggccgcaacg actgggccag ttccactggg caagccgcga cgtcttacgcgcgtccatcg cggggctgtt cctgacc己cc gaggccgtcg ttgccgacaa gccggaaaagcgcaggtagc gccccgacaa ggactggtgg ctccggcagc aacggctgtt cggccttttcgsgasggctt ccgttcccgg tggcggcgsc 3tgggtggc3 tggstttcctcttccgsa ccgaisgggcc sccgccgctg t3cccaccgt 3cct333g 3) 將上述的3段片段混合，變性成為單鏈，通過彼此重疊的17個堿基互補連接，以此作為模板，通過PCR方法擴增獲 得嵌合了 4個T細(xì)胞表位的結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65外源目 的基因，將目的基因經(jīng)EcoRI和Hind III雙酶切后與經(jīng)同樣雙 酶切的載體連接，獲得權(quán)利要求1所述的結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征 在于所述的結(jié)核分枝桿菌DNA來自結(jié)核分枝桿菌H37Rv株。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征 在于所述的載體選自pcDNA3.1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì)粒。
21. —種制備如權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的 結(jié)核基因疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟(1) 構(gòu)建結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒pECANS;(2) 將0.01~0.04%濃度、PH5.5-5.7的脫乙酰殼聚糖溶液，與 50 400jig/ml編碼結(jié)核抗原的質(zhì)粒pECANS溶液在50-60。C下，以 15000-17000rpm速度高速混旋，在所述的脫乙酰殼聚糖溶液中，所述 的脫乙酰殼聚糖的分子量在38000 420000之間，脫乙酰度75% 85%，所述的質(zhì)粒DNA溶解在5mM 25mM的Na2S04中，通過共 聚交聯(lián)作用，獲得的脫乙酰殼聚糖-結(jié)核抗原質(zhì)粒納米顆粒為球形，直 徑在50 200nm之間。
22. —種藥物組合物，其特征在于含有有效量的權(quán)利要求1所述的一種以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因疫苗，以及藥學(xué)上可以 接受的載體或者賦形劑。
23. —種權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基 因疫苗的應(yīng)用方法，其特征在于，以滴鼻、口服或經(jīng)生殖道方式實施粘膜部位接種。
24. 如權(quán)利要求23所述的結(jié)核基因疫苗的粘膜部位接種方法如下1) 首先對動物進(jìn)行輕度麻醉；2) 在鼻腔、口腔或生殖道內(nèi)逐滴注入脫乙酰殼聚糖-pECANS納 米顆粒，3) 二周后重復(fù)1) +2)的免疫過程，4) 共免疫3 4次，pECANS DNA總量在150 200jug。
25. 權(quán)利要求1所述的以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因疫 苗在制備預(yù)防或治療結(jié)核病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種以脫乙酰殼聚糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核基因疫苗，由脫乙酰殼聚糖與結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒組成，結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒中插入有結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65的全長基因，HSP65全長基因中插入4個來自結(jié)核桿菌抗原中的T細(xì)胞表位基因EAST-6_189-228、Ag85A_369-405、CFP10_162-207和Ag85B_420-459。本發(fā)明還公開了這種結(jié)核基因疫苗的應(yīng)用，通過將本發(fā)明的基因疫苗滴鼻免疫小鼠，證實可誘導(dǎo)針對多個結(jié)核抗原的特異性抗體應(yīng)答，能誘導(dǎo)全身及肺臟粘膜局部較強的結(jié)核特異性T細(xì)胞殺傷應(yīng)答，同時可誘導(dǎo)分泌高水平IFNγ的Th1免疫應(yīng)答，效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)BCG疫苗，是一種優(yōu)良的預(yù)防和治療結(jié)核病的疫苗。
文檔編號A61K48/00GK101455846SQ20071017204
公開日2009年6月17日 申請日期2007年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月11日
發(fā)明者艷 岳, 薇 徐, 熊思東, 高海峰 申請人:復(fù)旦大學(xué)