專利名稱：一株可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更確切地說，涉及一株可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌及 其用途
背景技術(shù)：
百菌清作為農(nóng)業(yè)用殺菌劑，主要用于防治各種真菌病害，據(jù)美國USGS (United States Geological Survey)統(tǒng)計，百菌清近年在美國的年使用量超過4. 8X 106公斤。我國百菌清的 年生產(chǎn)能力已突破8000噸。雖然百菌清的主要應(yīng)用對象是作物的葉部病害，但當作物冠層較 薄和過量施用時，其大部分進入土壤并造成嚴重的污染(Cisar and Snyder, 1996; Petrovic etal., 1996)。有證據(jù)表明，百菌清可以遠距離遷移，己在北極圈內(nèi)監(jiān)測到了百菌清的存在 (Chernyak et al. ， 1996)。百菌清具有明顯的蓄積毒性，可致動植物發(fā)生遺傳性突變，能 誘發(fā)小鼠骨髓淋巴細胞姊妹染色單體交換率(SCE)的增加。同時也是環(huán)境激素類似物，對人和 動物內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾作用，影響人和動物的生殖繁衍，造成雌性化、腺體病變和后代生 命力退化等，而成為人們關(guān)注的焦點。因此研究其微生物降解具有重要的意義。
減少農(nóng)藥的使用以及去除農(nóng)藥殘留是減輕農(nóng)藥危害的有效途徑。有機氯殺菌劑的消除方 法有很多，包括物理、化學(xué)和生物方法。同物理化學(xué)方法相比，生物修復(fù)具有可基本保持土 壤的理化特性，污染物降解完全、處理成本低和應(yīng)用廣泛的特點。農(nóng)藥殘留微生物降解技術(shù) 是通過在土壤中接種高效降解性微生物，原位消除土壤中的農(nóng)藥殘留，降低土壤中農(nóng)藥污染 物的含量，從而減少進入作物體內(nèi)的農(nóng)藥。本技術(shù)投入低、效率高，己經(jīng)在無公害農(nóng)產(chǎn)品生 產(chǎn)中得到應(yīng)用，是一項已經(jīng)獲得農(nóng)民認可的、可操作性強的無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)。應(yīng)用微 生物或無細胞制品來削減農(nóng)藥污染的生物修復(fù)技術(shù)顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌，該降解菌從河南省受百菌 清嚴重污染的土壤中分離獲得，能夠以百菌清為唯一碳源，具有高效降解百菌清的能力。
本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明的可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌的用途，其用途是 降解殺菌劑百菌清。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供的一株可高效降解百菌清的降解菌，其特征在于，該降解菌的分類命名為蒼
白桿菌(Oc/ ra^"n/m于2007年6月28日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No. 2098。 該降解菌(TP-D1)經(jīng)形態(tài)、生理生化特性分析和16S rRNA基因序列同源性分析，鑒定 為蒼白桿菌屬中的OcZ/ra6a"n^ /w; /m'， TP-D1株在pH7.0至8.0、溫度30至35。C生長良好， 能以百菌清為唯一碳源生長。
采用氣相色譜法測定菌株TP-D1對百菌清的降解率，3(TC培養(yǎng)4天對對百菌清的降解率 達到90.4%。采用液相色譜法測定菌株TP-D1對土壤中百菌清的降解率，結(jié)果表明TP-Dl與 百菌清在土壤中室溫共培養(yǎng)l周，百菌清的殘留可降低99.7%。采用薄板層析(TLC)、高壓 液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MC)技術(shù)分析了菌株TP-D1降解百菌清的中間產(chǎn)物。結(jié)果表明，主 要代謝中間產(chǎn)物是4-羥基-三氯苯二腈(TPN-0H)和1,3-二酰胺-四氯苯，其中1,3-二酰胺-四氯苯為新發(fā)現(xiàn)的純培養(yǎng)微生物降解百菌清的中間產(chǎn)物。
本發(fā)明的可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌的篩選
采集河南省受百菌清嚴重污染的土壤，取污染土樣1. 0g加入到含有50mg/L百菌清的牛 肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，28°C， 180轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)4天，然后以5% (V/V)的接種量轉(zhuǎn)接到較 高濃度的含藥培養(yǎng)液中，百菌清的加藥濃度依次為50mg/L、 100mg/L、 150tng/L、依次類推， 至600mg/L，即可得到不同濃度的富集培養(yǎng)液。取0. lmL富集液涂布到相應(yīng)含藥濃度的平板 上，28°C，培養(yǎng)48小時。發(fā)現(xiàn)了一株生長速度最快而且菌落周圍出現(xiàn)透明圈的菌株。將該菌 株接種到含有50mg/L百菌清的無機鹽培養(yǎng)基上，菌落周圍可出現(xiàn)清晰的透明圈，將該菌株定 名為TP-Dl。認為該菌株可利用百菌清為唯一碳源，不同于前人的研究報道，是一株很有潛 力的降解菌。氣相色譜法測定了在無機鹽培養(yǎng)液中該菌株對百菌清的降解能力，培養(yǎng)液中菌 體的含量為每毫升培養(yǎng)液中107個，百菌清的濃度為50mg/L，于3(TC、 180轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)4 天，百菌清的降解率為90.4%。應(yīng)用所分離到的蒼白桿菌TP-Dl經(jīng)發(fā)酵后將該菌的發(fā)酵液處 理添加了 50mg/L百菌清的無菌土， 土壤中菌體含量為每克土壤107個菌體，室溫共培養(yǎng)1周， 液相色譜法測定百菌清的殘留可降低99. 7%。
所述的富集培養(yǎng)基的組分及配比為牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，瓊脂18.0g，葡萄糖IO.O g，酵母浸膏1.0g， H2O 1000mL，調(diào)pH值至7.0， 121。C高壓滅菌30min。
所述的無機鹽培養(yǎng)基的組分及配比為NH4N03 l.Og， MgS04'7H20 0.5g， (NH4)2S04 0.5g， KH2PO40.5g， NaCI0.5g， K2HP04 1.5g， H20 lOOOmL，用lmol/LHCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至 7.0， 121。C高壓滅菌30min。
該菌株的特征在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成菌落為乳白色、圓形、邊緣整齊，濕潤， 表面凸起、直徑2.0mm左右；革蘭氏陰性，菌體桿狀，大小約為1.6x0.75nm，極生鞭毛，氧 化酶、過氧化氫酶陽性。甲基紅試驗和V-P試驗均為陰性。精氨酸、尿氨酸、賴氨酸水解陽 性，枸櫞酸鹽、尿素、蔗糖、麥芽糖、木糖、乳糖發(fā)酵陽性。七葉靈、靛基質(zhì)、硝酸鹽還原、硫化氫、ONPG測定為陰性。能利用山梨醇、果糖、木糖、甘露醇、肌醇作為其碳源，不能
利用乳糖、甘露糖、麥芽糖、甘油。測定了該菌株的16S rDNA序列，測序結(jié)果已經(jīng)登錄在 Genebank中，登錄號為EF998851。通過與Genebank中其他菌株16S rRNA序列的比對，認 為菌株TP-D1屬于Oc^ra6a"n/m spp.。結(jié)合其生理生化特征將其鑒定為O. Zwp/m'。
對該菌株降解百菌清的代謝產(chǎn)物進行了檢測，其主要的降解中間產(chǎn)物是TPN-0H和1,3-二酰胺-四氯苯，說明TP-Dl可通過氰基水合作用進行降解，目前該途徑尚未在純培養(yǎng)微生物 中被發(fā)現(xiàn)和報道，其發(fā)現(xiàn)對實現(xiàn)百菌清的定向降解具有重要的意義，具有潛在的應(yīng)用前景。 從而本發(fā)明提供了一株生物降解百菌清的細菌菌株。該菌株已保藏于《中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No. 2098。
與其他百菌清降解菌相比，本發(fā)明的優(yōu)點是l.該菌能夠以百菌清為唯一碳源進行降解， 前人的報道需要外加碳源才能實現(xiàn)降解菌對百菌清的降解。2.該菌對百菌清具有高效降解能 力，在無機鹽液體培養(yǎng)液中對百菌清的降解能力可達到90.4%，在土壤中對百菌清的降解能 力可達到99.7%。 3.該菌可通過氰基的水合作用降解百菌清，可利用該菌的降解酶以及工程 菌株實現(xiàn)百菌清的定向降解，避免降解代謝主要產(chǎn)物TPN-OH帶來的二次污染問題。
本發(fā)明的可高效降解百菌清的降解菌的用途
該菌株可降解殺菌劑百菌清，可用于受百菌清污染的水體、土壤或農(nóng)產(chǎn)品的生物凈化。
具體實施例l:菌株TP-Dl以百菌清為碳源生長以及對百菌清的降解作用
將0. 5mL的TP-D1菌懸液(lxl()S個/mL)接入到含50mg/L百菌清的無機鹽培養(yǎng)液中，設(shè)3 次重復(fù)，以不接種細菌但含相同濃度百菌清的無機鹽培養(yǎng)液為對照。3CTC， 180轉(zhuǎn)/分振蕩培 養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、 48、 72、 96小時，氣相色譜法檢測百菌清的含量。結(jié)果表明接種TP-Dl 后百菌清在培養(yǎng)基中的殘留逐漸減少，96小時其殘留只有4.5mg/L，對百菌清的降解率達到 90.4% (表一)。
_表一 菌株TP-Dl在無機鹽培養(yǎng)液中對百菌清的降解率_
培養(yǎng)時間_百菌清的殘留濃度(mg/L)_巫化隊m宏,。/、
對照 處理
2447.9±2. 134.9±1.827.2
4847.4 ±0. 326.7 ±0.253.6
7247.4 ±0. 69.1±2. 180.7
9647.0 ±0.94.5±1. 190.4具體實施例2:菌株TP-D1對土壤中百菌清的降解作用
將土壤過0.2mm篩，160'C干熱滅菌1.5小時后，稱取10g放在90mm的培養(yǎng)皿中，噴 灑百菌清母液，使土壤中的百菌清的初始濃度為50mg/L，向土壤中均勻拌入培養(yǎng)36小時的 TP-D1菌液，使其濃度為107個/克土壤，土壤濕度20%，設(shè)3次重復(fù)，以加藥但不加菌的土 壤為對照。將各處理土壤置于室溫培養(yǎng)，于處理后1、 3、 7天分別取樣檢測土壤中百菌清的 殘留量，同時，應(yīng)注意隔天噴灑水分，使其濕度保持在20%左右。結(jié)果表明，菌株在土壤中 培養(yǎng)7天后，對百菌清的降解率可達到99.7%，降解效果較好(表二)。
表二菌株TP-Dl在土壤中對百菌清的降解效果
時間(天)
百菌清殘留濃度(mg/L)
平均降解率(0/。)
對照
處理
1 42.28±2.01 3 47.41 ±0.56
7 46.37±0.41
12. 53±3.81 2. 37±2. 43 0. 14±0. 06
71.4 95.0 99.權(quán)利要求
1、一株可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌純培養(yǎng)物，其特征在于，它是蒼白桿菌(Ochrobactrum lupini)(CGMCC No.2098)。主要生物學(xué)特性為G-，菌體桿狀，大小約1.6×0.75μm，極生鞭毛，氧化酶、過氧化氫酶陽性、甲基紅試驗和V-P試驗均為陰性。精氨酸、尿氨酸、賴氨酸水解陽性，枸櫞酸鹽、尿素、蔗糖、麥芽糖、木糖、乳糖發(fā)酵陽性。七葉靈、靛基質(zhì)、硝酸鹽還原、硫化氫、ONPG測定為陰性。該菌株的16S rDNA序列在Genebank登錄號為EF998851。
2、 如權(quán)利要求書l所述的殺菌劑百菌清高效降解菌的用途。該菌株用于受到百菌清污染的水 體、土壤和農(nóng)產(chǎn)品的凈化。
3、 如權(quán)利要求書1和權(quán)利要求書2所述的百菌清降解菌的與降解相關(guān)的基因及關(guān)鍵酶在生物 修復(fù)和凈化及工業(yè)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌，該降解菌的分類命名為蒼白桿菌(Ochrobactrum lupini)，于2007年6月28日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.2098。用途為該菌株用于降解殺菌劑百菌清，可用于受百菌清污染的水體、土壤或農(nóng)產(chǎn)品的生物凈化。
文檔編號A61K48/00GK101338284SQ20071012283
公開日2009年1月7日 申請日期2007年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日
發(fā)明者史秀珍, 李世東, 郭榮君 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所