細(xì)皺香薷中主要化學(xué)成分及有效組份的抗流感用途的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：：細(xì)皺香薷中主要化學(xué)成分及有效組份的抗流感用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥細(xì)皺香薷的主要化學(xué)成分及有效組份的制備方法、新的藥理作用以及其在預(yù)防和治療流感疾病中的應(yīng)用，屬中藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：流感是由流感病毒引起的對(duì)人類(lèi)健康威脅最大的呼吸道傳染病之一，具有傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，流行面廣等特點(diǎn)。在兒童、老人及高危人群中死亡率很高，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。流感病毒屬于正粘病毒科，根據(jù)病毒核蛋白和基質(zhì)蛋白抗原決定簇的不同，分為A,B,C三種類(lèi)型，其中只有A和B型可以引起大規(guī)模的流行，B和C兩型僅能對(duì)人致病，A型可對(duì)人、豬、馬和禽等致病。目前世界流行的H5N1型禽流感(avianinfluenza)即屬于A型的一種亞型病毒，該亞型流感病毒是人與動(dòng)物共患的流感病毒病原體，很容易引起世界大流行。據(jù)報(bào)道，目前世界流行的H5N1型禽流感病毒很可能變異產(chǎn)生一種新型、可以致人死亡的流感病毒，并且該病毒的變異速度極快，而人類(lèi)對(duì)該病毒并沒(méi)有免疫能力。流感病毒之所以易于流行是因?yàn)樗目乖嘧冃允沟萌梭w不能對(duì)其永久性免疫。在發(fā)現(xiàn)神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)抑制劑之前，流感的治療僅限于金剛烷胺/金剛乙胺和病毒疫苗，但其不足之處在于(1)由于流感疫苗的有效性是建立在疫苗的病毒株與將要流行或環(huán)境中存在的流感病毒株相類(lèi)似基礎(chǔ)上的，而流感病毒抗原的高度易變性大大降低了人們對(duì)流感病毒爆發(fā)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，這就使常規(guī)的流感疫苗對(duì)預(yù)防流感爆發(fā)與流行的有效性受到了嚴(yán)重影響，并對(duì)新產(chǎn)生的不可預(yù)見(jiàn)的流感病毒株束手無(wú)策。(2)流感病毒M2蛋白抑制劑金剛垸胺和金剛乙胺只對(duì)A型流感病毒有效，且很快會(huì)出現(xiàn)耐藥病毒株和比較嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用，使這類(lèi)藥物的臨床應(yīng)用受到極大限制。值得慶幸是，所有A、B型流感病毒神經(jīng)氨酸酶的活性位點(diǎn)的氨基酸殘基是高度保守的，這對(duì)于尋找廣譜抗流感病毒藥物提供了新的機(jī)遇。神經(jīng)氨酸酶在變異中的相對(duì)保守性為篩選、設(shè)計(jì)和合成有效的抗流感藥物提供了重要的靶標(biāo)。神經(jīng)氨酸酶(EC3.2.1.18)又稱(chēng)唾液酸酶，它可促進(jìn)新生的流感病毒從宿主細(xì)胞的唾液酸殘基釋放，并加速流感病毒轉(zhuǎn)染其它的宿主細(xì)胞，因此神經(jīng)氨酸酶抑制劑可以有效地阻斷流感病毒的復(fù)制過(guò)程。神經(jīng)氨酸酶晶體結(jié)構(gòu)的解析，使一類(lèi)新型抗流感病毒藥物一一神經(jīng)氨酸酶抑制劑的研發(fā)取得了成功，并引起世界各國(guó)對(duì)研發(fā)神經(jīng)氨酸酶抑制劑的熱潮。與其它類(lèi)型的抗流感藥物相比，神經(jīng)氨酸酶抑制劑具有更高的療效和更好的安全性和耐受性，對(duì)所有的流感病毒亞型均有效，且很少出現(xiàn)病毒抗藥性。目前臨床應(yīng)用的MA抑制劑奧塞米韋(oseltamivir)是公認(rèn)的抗流感和禽流感病毒的有效藥物。但由于技術(shù)原因，藥物的制備工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，價(jià)格昂貴，限制了它的廣泛應(yīng)用。而國(guó)內(nèi)在防治流感方面進(jìn)行了疫苗的研究，取得一定進(jìn)展，但在藥物研究方面，還沒(méi)有有效的藥物研究成果。
發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一了一類(lèi)新的神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)抑制齊U。為實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案。從流感病毒的重要靶點(diǎn)神經(jīng)氨酸酶建立NA抑制劑篩選模型，篩選評(píng)價(jià)中藥提取物的活性，然后基于活性評(píng)價(jià)結(jié)果，進(jìn)一步分離得到有效組份及活性化學(xué)成分。因流感病毒感染常常引起許多炎性癥狀及過(guò)氧化損傷癥狀，為了綜合評(píng)價(jià)活性組份與活性化合物的生物活性，除了評(píng)價(jià)其N(xiāo)A抑制活性及活性特異性，還需評(píng)價(jià)其抗炎免疫活性及抗氧化活性，以便找到新型有效的抗流感藥物。本發(fā)明公開(kāi)了細(xì)皺香薷(Efcto/te;an/g"/oMHemsl.)的有效組份的制備方法，包括如下步驟:(a)細(xì)鈹香薷(a^o/te,'arwgwto。Hemsl.)以85%乙醇提取，合并提取液，減壓蒸干，得細(xì)皺香薷乙醇總提物(ER-乙醇總提物)，(b)細(xì)皺香薷乙酵總提物溶于水中，以石油醚萃取得細(xì)皺香薷石油醚部位(ER-石油醚層)，(c)剩余部分分別以醋酸乙酯、正丁醇萃取分別得到細(xì)皺香薷醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層)和細(xì)皺香薷正丁醇部位(ER—正丁醇層)，最后得細(xì)皺香薷水層部位(ER-水層)；本發(fā)明還公開(kāi)了另一種細(xì)皺香薷(^^/ofe^n^/waHemsl.)的有效組份的制備方法，包括如下步驟(a)細(xì)鈹香薷(E/Wo/te/arag"/o^Hemsl.)用水提取，合并提取液，減壓蒸干得細(xì)皺香薷水總提物(ER-水總提)，(b)加入水一乙醇溶液(85%的乙醇)至乙醇含量為75%，得細(xì)皺香薷沉淀物(ER-水提醇沉)，(c)將沉淀物溶于水后，用大孔樹(shù)脂進(jìn)一步分離，用不同比例的水一乙醇洗脫液洗脫后得到不同組份細(xì)皺香薷水洗組份(ER-水洗組份)，細(xì)皺香薷乙醇洗脫組份(ER-30X乙醇洗脫組份)，細(xì)皺香薷乙醇洗脫組份(ER-50X乙醇洗脫組份)和細(xì)皺香薷70%乙醇洗脫組份(ER-70X乙醇洗脫組份)。原藥材經(jīng)干燥并適當(dāng)?shù)姆鬯椋岳龃笈c溶劑的接觸面積提高效率。原藥材的提取溶劑使用水、醇類(lèi)、或水與醇類(lèi)的混合物。優(yōu)選的醇類(lèi)包括甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等，最優(yōu)選的是乙醇，乙醇濃度為體積比50100%;優(yōu)選的濃度為體積比7095%。提取時(shí)溶劑量為原藥重量的414倍。提取可以在靜態(tài)或動(dòng)態(tài)下，優(yōu)選在動(dòng)態(tài)條件下。為了提高提取的效率，可以使用超聲波等。提取的溫度是從室溫(例如2(TC)到溶劑回流溫度的范圍內(nèi)，優(yōu)選在回流的溫度下。提取可連續(xù)或間歇進(jìn)行，間歇提取時(shí)可重復(fù)25次。提取時(shí)間是1小時(shí)到4小時(shí)，優(yōu)選為2.5到3小時(shí)。本發(fā)明還公開(kāi)了一類(lèi)細(xì)皺香薷有效組份，所述的細(xì)皺香薷有效組份由上述方法制備，選自(a)細(xì)皺香薷乙醇總提物(ER-乙醇總提物)，(b)細(xì)皺香薷石油醚部位(ER-石油醚層)，(c)細(xì)皺香薷醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層)，(d)細(xì)皺香薷正丁醇部位(ER—正丁醇層)，(e)細(xì)皺香薷水層部位(ER-水層)；以及(al)細(xì)皺香薷水總提物(ER-水總提)，，(bl)細(xì)皺香薷沉淀物(ER-水提醇沉)，(cl)細(xì)皺香薷水洗組份(ER-水洗組份)，(dl)細(xì)皺香薷30%乙醇洗脫組份(ER-30X乙醇洗脫組份)，(el)細(xì)皺香薷50%乙醇洗脫組份(ER-50。/。乙醇洗脫組份)，(fl)細(xì)皺香薷70%乙醇洗脫組份(ER-70X乙醇洗脫組份)。本發(fā)明還公開(kāi)了由細(xì)鈹香薷獲得的樺木酸(betulinicacid)，齊墩果酸(oleanolicacid)禾口熊果酸(ursolicacid)，存菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3,陽(yáng)glycuronicmethylester)和木月旨素等成分。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，含有至少一種上述細(xì)皺香薷有效組份和藥效學(xué)上可接受的載體本發(fā)明還提供另一種藥物組合物，含有藥效學(xué)上可接受的載體和至少作為有效成分的化合物，所述的化合物選自芹菜素(apigenin),木犀草素(luteolin),芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester)。本發(fā)明涉及的藥物組合物以本發(fā)明有效組份和化合物作為活性成份。該藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備?？赏ㄟ^(guò)將本發(fā)明有效組份和化合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成適于人或動(dòng)物使用的任何劑型。本發(fā)明有效組份和化合物在其藥物組合物中的含量通常為0.1-95重量％。本發(fā)明有效組份和化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮膚、陰道、直腸等。—給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w型、w/o型和復(fù)乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠齊IJ、糊劑等。'本發(fā)明有效組份和化合物可以制成普通制劑、也制成是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將本發(fā)明有效組份和化合物制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤(rùn)劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹(shù)脂、卡波姆、聚乙」瞎吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯垸酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二垸基磺酸鈉等；潤(rùn)滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將有效成分本發(fā)明有效組份和化合物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明有效組份和化合物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆粒或微丸，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發(fā)明有效組份和化合物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發(fā)明有效組份和化合物的膠囊劑。為將本發(fā)明有效組份和化合物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領(lǐng)域常用的增溶劑、助溶劑、pH調(diào)劑劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-e-環(huán)糊精等；pH調(diào)劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。>本發(fā)明提供了細(xì)皺香薷(E&toto'an/g"/oMHemsl,)的有效組份在制備預(yù)防和X或治療流感藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選的是醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層)、50%乙醇洗脫部位(ER-50X醇洗脫組分)。本發(fā)明提供了一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物在制備預(yù)防和\或治療流感藥物中的應(yīng)用，所述的黃酮類(lèi)化合物選自芹菜素(apigenin),木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester)。本發(fā)明提供了細(xì)皺香薷(五&to/te/。n^/amHemsl.)的有效組份在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選的是ER-50X醇洗脫組分、ER-醋酸乙酯層、ER-水總提。本發(fā)明提供了一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用，所述的黃酮類(lèi)化合物選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin),芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester)，優(yōu)選的是斧菜素(叩igenin)。本發(fā)明提供了細(xì)皺香薷(E狄ofe/an/gw/waHemsl.)的有效組份在制備抗炎藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選的是乙醇總提物(ER-乙醇總提物)、乙酸乙酯部位(ER-乙酸乙酯層)、正丁醇部位(ER-正丁醇層)和水溶性部位(ER-水層)本發(fā)明提供了一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用，所述的黃酮類(lèi)化合物選自選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethyl6Ster)0本發(fā)明提供了細(xì)皺香薷(孤tote/an/gw/oraHemsl.)的有效組份在制備增強(qiáng)免疫藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選的是細(xì)皺香薷ER-水層。本發(fā)明提供了一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物在制備增強(qiáng)免疫藥物中的應(yīng)用，所述的黃酮類(lèi)化合物選自芹菜素(叩igenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethyl<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)皺香薷主要化學(xué)成分芹菜素，芹苷，木犀草素，木犀草苷以及木犀草素-3-葡糖醛酸甲酯對(duì)甲、乙型流感病毒神經(jīng)氨酸酶均具有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)對(duì)細(xì)胞水平的流感病毒具有抑制作用，表明它們是細(xì)鈹香薷中藥抗流感病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)它們還具有一定的抗氧化抗炎作用，其中芽菜素具有較強(qiáng)的細(xì)胞水平流感病毒抑制作用和抗氧化作用。細(xì)皺香薷的粗提物ER-醋酸乙酯層、ER-50X醇洗脫組份對(duì)甲、乙型流感病毒神經(jīng)氨酸酶具有較強(qiáng)的抑制活性以及自由基清除作用，ER-醋酸乙酯層、ER-正丁醇層和ER-水層還具有抑制腫瘤壞死因子分泌作用，ER-水層具有促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分化，增強(qiáng)免疫作用?？傊?，細(xì)皺香薷對(duì)流感的治療作用可以通過(guò)其主要化學(xué)成分及有效部位抑制流感病毒的復(fù)制、清除自由基以及抗炎免疫作用等多種途徑發(fā)揮治療作用，因此具有良好的抗流感藥物開(kāi)發(fā)前景。為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。本發(fā)明有效組份、化合物、藥物組合物的給藥劑量依照所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的個(gè)體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來(lái)講，本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍為0.001-150mg/Kg體重，優(yōu)選為0.1-100mg/Kg體重，更優(yōu)選為1-60mg/Kg體重，最優(yōu)選為2-30mg/Kg體重。上述劑量可以一個(gè)劑量單位或分成幾個(gè)劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。本發(fā)明有效組份、化合物、藥物組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用。當(dāng)本發(fā)明的化合物與其它治療藥物存在協(xié)同作用時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整它的劑量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)所有A、B型流感病毒神經(jīng)氨酸酶的活性位點(diǎn)的氨基酸殘基是高度保守的，因此本發(fā)明的神經(jīng)氨酸酶抑制劑具有對(duì)抗不同類(lèi)型流感病毒的活性，具有廣譜性。本發(fā)明的神經(jīng)氨酸酶抑制劑包括其有效組份及活性成分具有抗病毒靶點(diǎn)明確，毒性低，提取工藝簡(jiǎn)單等特點(diǎn)；藥材資源豐富，具有很好的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景,是一種比較理想的新型預(yù)防和治療流感疾病的中藥。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明尋找神經(jīng)氨酸酶抑制劑的過(guò)程、細(xì)皺香薷有效組份及主要化學(xué)成分制備方法、體外抗炎免疫作用及其在體內(nèi)預(yù)防和治療流感的作用，更詳細(xì)地舉例說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1:建立神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選模型(參考文獻(xiàn):Potier,M.,L.Mameli，M.Belislem，L.Dallaire，andS.B.Melanxon.Fluorometricassayofneuraminidasewithasodium(4-methylumbelliferyla-D-N-acetylneuraminate)substrate.Anal.Biochem.，1979，94:287-296.)，通過(guò)對(duì)樣品庫(kù)中10萬(wàn)個(gè)樣品的神經(jīng)氨酸酶抑制活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)細(xì)皺香薷水提部位具有較高的神經(jīng)氨酸酶抑制活性，其IC50為l~4ug/ml。實(shí)施例2:將30kg細(xì)皺香薷全草陰干并粉碎后，以85%乙醇提取3次(2h,1hX2)，合并提取液，減壓蒸干，得乙醇總提物(ER-乙醇總提物，1.675kg)，之后溶于水中，以石油醚萃取得石油醚部位(ER-石油醚層，0.012kg)，剩余部分分別以醋酸乙酯、正丁醇萃取分別得到醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層，0.040kg)和正丁醇部位(ER—正丁醇層，0.057kg),最后得水層部位(ER-水層，0.725kg)。實(shí)施例3:石油醚部位經(jīng)進(jìn)一步分離得到樺木酸(betulinicacid)，齊墩果酸(oleanolicacid)和熊果酸(ursolicacid)，醋酸乙酯部位(235.3克)經(jīng)進(jìn)一步分離得到芹菜素(apigeniii，55mg)，木犀草素(luteolin，113mg)，芹苷(apiin，15mg),木犀草苷(galuteolin,35mg)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester,19mg)，和木脂素(27mg)等成分。實(shí)施例3的分離提純結(jié)果表明，3個(gè)三萜類(lèi)化合物，5個(gè)黃酮類(lèi)化合物和1個(gè)木脂素是該中藥的主要化學(xué)成分。實(shí)施例4:將7.5kg細(xì)皺香薷全草陰干并粉碎后，用水提取3次(2h,1.5X2h)，合并提取液，減壓蒸干得總提物(ER-水總提，0.826kg)，加入水一乙醇溶液(85%的乙醇)至乙醇含量為75%，得沉淀物(ER-水提醇沉，0.710kg),將沉淀物溶于水后，用大孔樹(shù)脂進(jìn)一步分離，用不同比例的水一乙醇洗脫液洗脫后得到不同組份ER-水洗組份，ER-30X乙醇洗脫組份，ER-50X乙醇洗脫組份(0.026kg)和ER-70。/。乙醇洗脫組份。藥理實(shí)驗(yàn)不同組份經(jīng)神經(jīng)氨酸酶抑制活性評(píng)價(jià)，確定其中的有效組份及其制備方法。實(shí)驗(yàn)例1:細(xì)皺香薷提取部位及主要成分的神經(jīng)氨酸酶活性評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)中使用的流感病毒A型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和A/Jinan/15/90(H3N2)和B型流感病毒B/Jiangsu/10/2003，在神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)體系中，各種濃度的待測(cè)物質(zhì)與病毒神經(jīng)氨酸酶懸浮于32.5mmo1L"MES緩沖液-4mmo1L1CaCI2(pH6.5)，室溫孵育30—60min，加底物圖NANA啟動(dòng)反應(yīng)體系，37oC孵育30—120min后(不同病毒的神經(jīng)氨酸酶需孵育的時(shí)間不同)，加150uL0.034MNaOH終止液終止反應(yīng)。在激發(fā)波長(zhǎng)360nm和發(fā)射波長(zhǎng)為450nm的參數(shù)條件下，測(cè)定熒光強(qiáng)度值。根據(jù)抑制活性與抑制劑的濃度計(jì)算ICs。值。有效組份、主要化學(xué)成分及陽(yáng)性對(duì)照藥奧塞米韋(oseltamivir)的半數(shù)抑制率ICso值列于表1中。表1細(xì)皺香薷的化學(xué)成分與提取物的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制作用檢測(cè)物質(zhì)_IC50a(pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ER-醋酸乙酯層、ER-50^乙醇洗脫組份、芹菜素(apigenin)、木犀草素(luteolin)、芹苷(apiin)、木犀草苷(galuteolin)和木犀草素-3-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3-glycuronicmethylester)是細(xì)皺香薷抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶的活性物質(zhì)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)例2:細(xì)皺香薷有效組份及主要化學(xué)成分的體外抗流感病毒活性評(píng)價(jià)。本實(shí)施例采用MDCK(狗腎細(xì)胞)進(jìn)行藥物的MDCK細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和藥物對(duì)流感病毒的抑制實(shí)驗(yàn)。病毒為甲型(粵防72—243)流感病毒，10—5感染，病毒感染相當(dāng)于316個(gè)TCID5Q。實(shí)驗(yàn)方法采用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)法，每毫升2030萬(wàn)個(gè)MDCK細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.1ml，37oC,5XC02培養(yǎng)24小時(shí)，棄培養(yǎng)液，加入適量病毒，吸附2小時(shí)后，棄病毒液，加入藥物，藥物濃度均小于最大無(wú)細(xì)胞毒性濃度TC。。藥物作3倍系列稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度，每濃度設(shè)2孔，37oC,5%C02培養(yǎng)。24小時(shí)觀察細(xì)胞病變，完全破壞為4*75%為3，50%為2，25%為1，無(wú)病變?yōu)?。設(shè)無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照，病毒對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照藥為奧韋(oseltamivir)和利巴韋林(ribavirin)。計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(IC幼)。體外抗流感病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2藥物抗流感病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果_<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>aTD5Q:對(duì)MDCK細(xì)胞的半數(shù)有毒藥物濃度。bTDo:無(wú)MDCK細(xì)胞毒性的最大濃度。eIC5o:藥物對(duì)甲型流感病毒(粵防72—243)的半數(shù)抑制濃度。dSI(SelectiveIndex):選擇性指數(shù)為T(mén)D50/IC50。結(jié)果表明細(xì)鈹香薷的醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層)、50^乙醇洗脫部位(ER-50X醇洗脫組分)以及分離得到的黃酮均具有抑制流感病毒的作用，其中芹菜素表現(xiàn)出較強(qiáng)的流感病毒抑制作用。芹菜素的流感病毒半數(shù)抑制濃度IC50比奧塞米韋的3倍，但比利巴韋林的小4倍，即其抑制病毒的活性比奧塞米韋的小3倍，比利巴韋林的大4倍，其選擇性指數(shù)為7,48?？梢?jiàn)，細(xì)皺香薷的醋酸乙酯部位、50%乙醇洗脫部位及黃酮化學(xué)成分均為其抗流感病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中并菜素為其抗流感病毒的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)例3:細(xì)皺香薷有效組份及主要化學(xué)成分的抗氧化活性評(píng)價(jià)。本實(shí)施例采用DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)研究其抗氧化活性。在反應(yīng)體系中，含有65uMDPPH溶液190ul，待測(cè)樣品10wl，總體積為200u'l，陽(yáng)性對(duì)照組加入維生素C，空白對(duì)照組以去離子水代替待測(cè)樣品，室溫下避光靜置30分鐘后，于515nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度計(jì)算DPPH清除率，并計(jì)算SC幼值.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，表3細(xì)皺香薷的化學(xué)成分及提取物的DPPH自由基清除作用<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3.61結(jié)果表明化學(xué)成分芹菜素(apigenin)、ER-50X醇洗脫組分、ER-醋酸乙酯層、ER-水總提等具有較強(qiáng)的抗氧化作用，其他成分也具有一定的抗氧化作用。說(shuō)明該中藥有效部位及活性成分在疾病治療中還具有自由基清哮作用和自由基損傷保護(hù)作用。實(shí)施例4:細(xì)皺香薷有效組份及主要成分的抗炎作用評(píng)價(jià)。本實(shí)施例應(yīng)用抗腫瘤壞死因子實(shí)驗(yàn)研究其抗炎作用。該實(shí)驗(yàn)利用巨噬細(xì)胞在誘導(dǎo)劑刺激后可分泌大量炎性細(xì)胞因子，觀察樣品對(duì)腫瘤壞死因子分泌水平的影響。在反應(yīng)體系中，含有約5X10Vml巨嗜細(xì)胞，待測(cè)樣品10ul，刺激劑190ul，總體積為200u1,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照？L，以去離子水代替待測(cè)樣品，37°C、5%C02孵育6h,取上清90ul，加入到濃度為2X105/ml的L929細(xì)胞中，并加入10ul放線(xiàn)菌素D(終濃度5ug/ml)，37°C、5%C02孵育24h，加入MTT后繼續(xù)孵育4小時(shí)，于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度計(jì)算TNF-a抑制率，陽(yáng)性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)抑制率大于50%(參考文獻(xiàn)徐叔云，卞如濂，陳修主編?！端幚韺?shí)驗(yàn)方法學(xué)》。北京人民衛(wèi)生出版社2005。)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表4)表4細(xì)鈹香薷的化學(xué)成分及提取物對(duì)腫瘤壞死因子的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表明中藥的乙醇總提物(ER-乙醇總提物)、乙酸乙酯部位(ER-乙酸乙酯層)、正丁醇部位(ER-正丁醇層)和水溶性部位(ER-水層)具有較強(qiáng)的抑制巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子作用，其他部位及主要化學(xué)成分也具有一定的活性。說(shuō)明該中藥各提取部位及主要化學(xué)成分具有抗炎作用。實(shí)驗(yàn)例5:細(xì)皺香薷提取物促T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例利用純系小鼠脾臟進(jìn)行T/B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，觀察樣品對(duì)細(xì)胞的影響。在反應(yīng)體系中，含有約1X106/ml脾細(xì)胞，待測(cè)樣品10&1，加ConA(終濃度5ug/ml)，總體積為200ul，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔，以去離子水代替待測(cè)樣品，陽(yáng)性對(duì)照組加入環(huán)孢素A，37°C、5%C02孵育72h，加入MTT后繼續(xù)孵育4小時(shí)，于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(參考文獻(xiàn)徐叔云，卞如濂，陳修主編?！端幚韺?shí)驗(yàn)方法學(xué)》。2005，北京人民衛(wèi)生出版社)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表5)。表5細(xì)皺香薷提取物促T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表明細(xì)皺香薷ER-水層在所檢測(cè)的濃度范圍均具有穩(wěn)定的促T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用，說(shuō)明有效部位具有增強(qiáng)免疫的作用。權(quán)利要求1、細(xì)皺香薷(ElsholtziarugulosaHemsl.)的有效組份的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(a)細(xì)皺香薷(ElsholtziarugulosaHemsl.)以85％乙醇提取，合并提取液，減壓蒸干，得細(xì)皺香薷乙醇總提物(ER-乙醇總提物)，(b)細(xì)皺香薷乙醇總提物溶于水中，以石油醚萃取得細(xì)皺香薷石油醚部位(ER-石油醚層)，(c)剩余部分分別以醋酸乙酯、正丁醇萃取分別得到細(xì)皺香薷醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層)和細(xì)皺香薷正丁醇部位(ER—正丁醇層)，最后得細(xì)皺香薷水層部位(ER-水層)；或(a)細(xì)皺香薷(ElsholtziarugulosaHemsl.)用水提取，合并提取液，減壓蒸干得細(xì)皺香薷水總提物(ER-水總提)，(b)加入水—乙醇溶液(85％的乙醇)至乙醇含量為75％，得細(xì)皺香薷沉淀物(ER-水提醇沉)，(c)將沉淀物溶于水后，用大孔樹(shù)脂進(jìn)一步分離，用不同比例的水—乙醇洗脫液洗脫后得到不同組份細(xì)皺香薷水洗組份(ER-水洗組份)，細(xì)皺香薷乙醇洗脫組份(ER-30％乙醇洗脫組份)，細(xì)皺香薷乙醇洗脫組份(ER-50％乙醇洗脫組份)和細(xì)皺香薷70％乙醇洗脫組份(ER-70％乙醇洗脫組份)。2、根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法獲得的細(xì)皺香薷有效組份，其特征在于，所述的細(xì)皺香薷有效組份選自(a)細(xì)皺香薷乙醇總提物(ER-乙醇總提物)，(b)細(xì)皺香薷石油醚部位(ER-石油醚層)，(c)細(xì)皺香薷醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層)，(d)細(xì)皺香薷正丁醇部位(ER—正丁醇層)，(e)細(xì)皺香薷水層部位(ER-水層)；以及(al)細(xì)皺香薷水總提物(ER-水總提)，(bl)細(xì)鈹香薷沉淀物(ER-水提醇沉)，(cl)細(xì)皺香薷水洗組份(ER-水洗組份)，(dl)細(xì)皺香薷30%乙醇洗脫組份(ER-30X乙醇洗脫組份)，(el)細(xì)皺香薷50%乙醇洗脫組份(ER-50X乙醇洗脫組份)，(fl)細(xì)皺香薷70%乙醇洗脫組份(ER-70X乙醇洗脫組份)。3、一種藥物組合物，其特征在于，含有至少一種選自權(quán)利要求2的細(xì)皺香薷有效組份和藥效學(xué)上可接受的載體。4、一種藥物組合物，其特征在于，含有藥效學(xué)上可接受的載體和至少作為有效成分的化合物，所述的化合物選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin),木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester)o5、權(quán)利要求2的細(xì)皺香薷(E/Ao/feZan/g"/cwaHemsl.)的有效組份在制備預(yù)防和、或治療流感藥物中的應(yīng)用。6、一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物在制備預(yù)防和\或治療流感藥物中的應(yīng)用，所述的黃酮類(lèi)化合物選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin),芹苷(apiin),木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester7、權(quán)利要求2的細(xì)皺香薷(EMofe/an/gwforaHemsl.)的有效組份在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。8、一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用，所述的黃酮類(lèi)化合物選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin),木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester)。9、權(quán)利要求2的細(xì)皺香薷(幼to/te/arwgw/(waHemsl.)的有效組份在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。10、一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用，所述的黃酮類(lèi)化合物選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester)。11、權(quán)利要求2的細(xì)皺香薷(孤to/te/an/g"foMHemsl.)的有效組份在制備增強(qiáng)免疫藥物中的應(yīng)用。12、一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物在制備增強(qiáng)免疫藥物中的應(yīng)用，所述的黃酮類(lèi)化合物選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethyl全文摘要本發(fā)明涉及中藥細(xì)皺香薷(ElsholtziarugulosaHemsI.)的有效組份及主要活性成分的制備方法，含有有效組份及主要活性成分的藥物組合物，以及活性組分在預(yù)防和治療流感疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于從細(xì)皺香薷中提取的有效組份及分離得到的活性成分對(duì)所有類(lèi)型流感病毒均具有神經(jīng)氨酸酶抑制作用；具有抗氧化、抗炎免疫作用。文檔編號(hào)A61P39/06GK101385776SQ200710121740公開(kāi)日2009年3月18日申請(qǐng)日期2007年9月13日優(yōu)先權(quán)日2007年9月13日發(fā)明者何國(guó)榮,波劉,劉艾林,杜冠華,秦海林,胡娟娟申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所