一株產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶的菌種及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：：一株產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶的菌種及其應(yīng)用的制作方法一株產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶的菌種及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
一株產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶的菌種及其應(yīng)用，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及用一種變形假單胞菌(i^wtfomo"a;y;^cog/o肌'cWa)CGMCC.2039發(fā)酵生產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶(ADI)的菌種和方法，以及保留此活性的該菌的傳代株、變異株和衍生株生產(chǎn)的酶在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：精氨酸脫亞氨酶(Argininedeiminase)簡(jiǎn)稱ADI。很多微生物利用ADI水解精氨酸以獲得能量，在精氨酸脫亞氨基酶代謝途徑中，第一步反應(yīng)即為ADI水解精氨酸生成瓜氨酸和氮?dú)?。精氨酸?duì)于人類是一種非必需氨基酸。正常的細(xì)胞核組織可通過(guò)瓜氨酸，在尿素循環(huán)酶精氨酸-琥珀酸(ASS)合成酶以及精氨酸-琥珀酸化酶作用下合成。一些人類癌細(xì)胞不表達(dá)ASS，從而不能從瓜氨酸合成精氨酸。因此，精氨酸降解酶有可能從根本上消滅或控制精氨酸缺陷型癌細(xì)胞。1930年，Gilroy第一次論證，使用富含精氨酸的飼料喂養(yǎng)小鼠，與使用通常飼料喂養(yǎng)的小鼠相比，其腫瘤增殖加速以及腫瘤個(gè)體增大。Schimke等發(fā)現(xiàn)支原體產(chǎn)生的精氨酸降解作用是由一種新型酶引起的，稱作ADI,它可以使精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸和氨，而不是像精氨酸酶那樣使精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸和尿素。1992年，Takaku等人第一次從支原體中分離得到ADI并發(fā)現(xiàn)這種酶在體內(nèi)以及體外都存在活性。但是需要大劑量的經(jīng)常的輸入到體內(nèi)以達(dá)到有效的抗癌效果。1999年，HongGong等從M少c印/a^wwg!'m'm'中提取的低濃度精氨酸脫亞氨酶的作用下，可將細(xì)胞周期停止于Gi和S期，以抑制多種細(xì)胞的增殖；在高濃度精氨酸脫亞氨酶作用下，可引起并發(fā)的細(xì)胞凋亡。他們的研究證明了精氨酸脫氨酶對(duì)于細(xì)胞增殖的抑制不僅僅通過(guò)對(duì)精氨酸的降解，也通過(guò)包括細(xì)胞周期和凋亡信號(hào)的相關(guān)機(jī)制。2002年，美國(guó)肯塔基州大學(xué)的CharlesMarkEnsor,等，將聚乙二醇化精氨酸脫亞氨酶(ADI-PEG)用于老鼠實(shí)驗(yàn)，HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ADI只轉(zhuǎn)化精氨酸，同時(shí)證明了黑素瘤以及肝細(xì)胞瘤缺乏精氨(基)琥珀酸合成酶mRNA，沒有合成精氨酸的能力，ADI對(duì)精氨酸缺陷型癌細(xì)胞有抑制效果。2004年，他們將ADI-SSPEG用于臨床實(shí)驗(yàn)，感染了HCC的患者血漿中檢測(cè)不到精氨酸的存在，對(duì)于一些患者，該療法有效。眾所周知的也是臨床上使用最多的抑制腫瘤生長(zhǎng)的天(門)冬酰胺酶，在治療急性淋巴白血病和相關(guān)惡性腫瘤時(shí)該藥得到了成功的應(yīng)用。但是，伴隨天冬酰胺酶治療會(huì)產(chǎn)生如過(guò)敏性休克，凝血紊亂，肝臟和胰腺中毒等嚴(yán)重副作用。天冬酰胺酶在降解天冬酰胺的同時(shí)也降解谷氨酰胺。研究顯示這個(gè)酶的抗癌的活力是由于它降解天冬酰胺，而它的一些副作用是由于時(shí)，表明精氨酸脫氨酶的副作用較少，它在臨床上具有更好的應(yīng)用價(jià)值。在使用天冬氨酰酶產(chǎn)生不良反應(yīng)發(fā)生時(shí)，作為天冬氨酰酶的替代品。目前國(guó)內(nèi)外的報(bào)道中，產(chǎn)ADI酶的有銅綠假單胞菌(尸wwtfo附o"waerag/"oM)(A.Galkin，J.Biol.Chem..279,14001-14008,2004)、惡臭假單胞菌(/^ewcfowo"w(T.Kakimoto，Appl.Microbiol".1971,.992-999)，支原體(Mycop/cw,/zo,/w')(H.GongBiochem.Biophy.Res.Comm.261,10-141999);支原體(Afycop/as,w'"/"/)(C.M.EnsorCancerResearch62,5443-5450,,2002;F.IzzoJ.ClinicalOncology,22,2004)等。1971年，日本的TKakimoto等人，篩選出惡臭假單胞菌作為生產(chǎn)瓜氨酸的菌種，通過(guò)3(TC搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)，這個(gè)菌種的ADI酶活達(dá)到9.2U/ml。J.B.Jones(1981)首先使用從尸"w必oto"m;w^to中提純的ADI作為一種抗癌制劑。盡管這種酶在體外抑制腫瘤細(xì)胞，但是在體內(nèi)沒有觀察到明顯的活性。1992年，H.Takaku等人第一次從支原體中分離得到ADI并發(fā)現(xiàn)這種酶在體內(nèi)以及體外都存在活性(H.Takaku,etal.J.Cancer,51:244-249,1992.)。隨后，很多研究有關(guān)于支原體產(chǎn)ADI,并且研究證明該菌產(chǎn)ADI有抗癌效果。但是銅綠假單胞菌為致病菌，惡臭假單胞菌為條件致病菌，而支原體是有很高毒性的病原體。目前沒有關(guān)于變形假單胞菌(尸"ittfowo"^p/ecog/oM/c^a)為人類致病菌的報(bào)道，也尚未有變形假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)ADI的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶的菌株和方法，該菌株是一株能有效生產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶的新菌株、我們對(duì)其進(jìn)行鑒定、發(fā)酵產(chǎn)酶以及抗癌活性研究。以下是本發(fā)明技術(shù)方案的詳細(xì)描述。微生物菌株的篩選與鑒定在本發(fā)明中，建立了一個(gè)快速高效的篩選產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶菌株的模型。根據(jù)產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶的菌株催化精氨酸產(chǎn)瓜氨酸和氨的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出以精氨酸為碳源的選擇性平板，篩選出利用精氨酸的菌株。由于精氨酸脫亞氨酶催化精氨酸產(chǎn)氨，因此在含有苯酚紅顯色劑的酸性平板中能夠產(chǎn)生紅色變色圈。本發(fā)明從無(wú)錫惠山、錫惠公園、京杭運(yùn)河無(wú)錫段等處取土樣5份，植物體樣品2份，水樣2份，一共9份樣品。取完后在12h之內(nèi)迅速篩選菌種。篩選的具體方法是將樣品在富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)24h后，再涂布篩選培養(yǎng)基平板。經(jīng)過(guò)平板篩選，共分離獲得54株產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶的菌株。進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)篩，用二乙酰一肟硫氨脲法測(cè)定ADI酶活，最終篩選出目標(biāo)菌株SW-P1。本發(fā)明篩選得到的產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶的菌株SW-P1，經(jīng)16SrRNA基因測(cè)定和按《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》以及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)》生理生化鑒定，認(rèn)為屬假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌屬(尸w"(io附o"as)的變形假單胞菌(i^e"cfomo"fiw/7/ecog/o^/aVfa)。該菌的細(xì)胞呈桿狀，可運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢，電鏡觀察有的有偏端叢毛，有的沒有鞭毛。革蘭氏陰性，好氧。該菌株在LB培養(yǎng)基24h的菌落呈圓形、淡黃色、不透明，表面光滑、邊緣整齊，直徑約lmm;在發(fā)酵培養(yǎng)基菌落也呈淡黃色，直徑約為1.5mm。生物樣品材料保藏本發(fā)明篩選得到的變形假單胞菌(P化^fomo"M/^COg/ow/cWfl)菌株SW-P1已于2007年5月11日保存在中國(guó)北京中關(guān)村中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心，保藏號(hào)CGMCCNo.2039。微生物菌株的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基的組成為酵母膏l(xiāng)-5g/L，蛋白胨l-5g/L,，牛肉膏l(xiāng)-5g/L，NaCll-10g/L，瓊脂15-20g/L，pH6.0-7.5。種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為葡萄糖5-20g/L，酵母膏l(xiāng)-5g/L,蛋白胨l-5g/L，L-精氨酸鹽酸鹽5-20g/L，Na2HP04*1211206-15g/L,NaH2P04*2H20l-5g/L，(NH3)2HP04l-5g,pH6.5-7.5;培養(yǎng)基的滅菌溫度為115-121°C,15min。葡萄糖單獨(dú)滅菌后分裝。按常規(guī)方法制作斜面，用篩選得到的CGMCC2039菌株接種，28-35°C，培養(yǎng)20-40小時(shí)。將斜面上的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，250ml三角瓶裝液40-100ml,于28-35。C好氧條件下培養(yǎng)18-28小時(shí)。按1°/。-10%的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度28-35°。，好氧培養(yǎng)20-40小時(shí)。ADI酶活測(cè)定方法ADI酶活測(cè)定是通過(guò)檢測(cè)以L-精氨酸鹽酸鹽為底物的轉(zhuǎn)化液中生成的瓜氨酸的量來(lái)確定的。具體方法取5mL發(fā)酵液，離心收集菌體，生理鹽水洗滌兩次，力B5ml0.1。/。CTAB,于37'C培養(yǎng)箱靜置10min，離心收集沉淀，加入5mL0.1mol/LL-精氨酸鹽酸鹽-磷酸緩沖液pH6.0，混勻，于37。C培養(yǎng)箱靜置0.5h轉(zhuǎn)化，冰浴終止反應(yīng)。于10mL比色管中依次加入混酸3mL，二乙酰一肟硫氨脲0.5mL,將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液稀釋一定倍數(shù)后，加入2mL。沸水浴10min,迅速冷卻，于530nm領(lǐng)!(OD值。酶活定義37'C時(shí)，每分鐘轉(zhuǎn)化lpinol精氨酸鹽酸鹽生成瓜氨酸的酶量。二乙酰一肟硫氨脲溶液1g二乙酰一肟，30mg硫氨脲，蒸餾水定容至100mL;十六烷基三甲基溴化銨溶液(CTAB):lgCTAB,蒸餾水定容至1000mL;混酸:量取70mL濃磷酸,160mL濃硫酸，緩緩加于600mL蒸餾水中,冷卻后加入10mL10g/L的三氯化鐵溶液,加蒸餾水定容至lOOOmL;L-精氨酸鹽酸鹽-磷酸緩沖液0.5mol/LpH6.0磷酸鈉緩沖液1L加0.1molL-精氨酸鹽酸鹽。CGMCC2039菌株的ADI酶基因測(cè)序從該菌株中分離提取染色體的方法，是采用已知的技術(shù)(FrederichMA,RogerB,RobertEK,ShortProtocolsinMolecularBiology.(4thEdition).JohnWiley&Sons,Inc.,1999.)。重組質(zhì)粒的精氨酸脫亞氨酶基因是通過(guò)PCR方法從總的染色體DNA中擴(kuò)增得到的。兩個(gè)引物是根據(jù)已報(bào)道的假單胞菌的精氨酸脫亞氨酶基因序列設(shè)計(jì)的。Primer-F:ATGTCCGCTGAAAAACAGAAGTACG;Primer-R:TTAGTAGTTGATCGGGTCGCGCACG。用PCR方法釣取酶的基因，純化后連接克隆載體，轉(zhuǎn)化迸大腸桿菌JM109,培養(yǎng)后提取質(zhì)粒、純化、測(cè)序。ADI的提取將已培養(yǎng)24hr，約250mL的變形假單胞菌CPww^mo"w/7/ecog/o咖'"Wa)發(fā)酵液于8000rpm離心20min—棄去上清液，菌體加100mL，pH為6.0的磷酸鹽緩沖液洗滌—仍按上述條件離心，并再重復(fù)洗滌一遍—棄去上清液，菌體加50mL，pH為6.0的磷酸鹽緩沖液洗滌，盡量將菌體打散—置于超聲波破碎儀，于10'C,強(qiáng)度10%的條件下破碎5min—將該液體于12000rpm離心20min,取上清液(約45ml)，于4。C冰箱保存，待用檢測(cè)了該提取液的ADI酶活性。取該待用上清液0.5mL，另加入5mL0.2mol/L，pH為6.0的精氨酸鹽酸鹽-磷酸鹽緩沖液，于37'C轉(zhuǎn)化30min，將其稀釋100倍，分別取此液以及純水(做空白)各2mL于lOmL比色管中，各加入0.5mL二乙酰一肟一硫氨脲溶液以及3mL混酸，沸水浴中反應(yīng)10min，于530nm處以上述空白為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)其OD。結(jié)果為5.1U/mL。ADI抗癌活性試驗(yàn)將已復(fù)蘇的HepG2細(xì)胞株與L02細(xì)胞置于1640培養(yǎng)基(添加10%~20%的小牛血清)中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37'C，5%C02。其中L02細(xì)胞生長(zhǎng)約2-3天；HepG2細(xì)胞株生長(zhǎng)一周。細(xì)胞培養(yǎng)期間2天換液一次。將培養(yǎng)好的HepG2細(xì)胞株和作為陽(yáng)性對(duì)照的L02細(xì)胞，加入96孔板，使得每個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)約為7000個(gè)，培養(yǎng)液的體積均為每孔100pL。仍按上述條件培養(yǎng)24hr。將發(fā)酵并提取得到的ADI，以及作為陰性對(duì)照的未接種發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)0.2pm過(guò)濾器過(guò)濾滅菌,配成不同濃度梯度，加入到96孔板中，使得每個(gè)孔的培養(yǎng)液體積最終均為200pL。其中，陽(yáng)性對(duì)照中，于L02細(xì)胞培養(yǎng)液各加入稀釋過(guò)的ADI，使其最終濃度為1/10，1/100,1/1000，1/10000;陰性對(duì)照中，于HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中各加入lOOiaL空白培養(yǎng)基；于H鄰G2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入稀釋過(guò)的ADI,使其最終濃度為1/10,1/20，1/40......1/163840，1/327680。仍按上述條件培養(yǎng)72hr。將上述加藥并培養(yǎng)72hr后的96孔板取出，采用常規(guī)SRB法測(cè)定，測(cè)540nmOD。結(jié)果表明，ADI對(duì)HepG2的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制能力，這也驗(yàn)證了HepG2不能自身合成生長(zhǎng)所必需的精氨酸。而對(duì)于正常肝細(xì)胞L02而言，由于自身具備合成精氨酸的能力，ADI對(duì)其的抑制能力就沒有如此強(qiáng)烈，這說(shuō)明ADI可作為一種新型的治療肝癌的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。有益效果本發(fā)明的特點(diǎn)是從大量微生物中篩選得到產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶的變形假單胞菌CGMCC2039，其在適合條件下，能產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶，酶活最高達(dá)到1.6U/ml發(fā)酵液以上。變形假單胞菌CGMCC2039為一種新的產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶菌株，目前國(guó)內(nèi)外的報(bào)道中，產(chǎn)ADI酶的有銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌，支原體等。但是銅綠假單胞菌為致病菌，惡臭假單胞菌為條件致病菌，而支原體是有很高毒性的病原體，而且它在大腸桿菌中表達(dá)的ADI形成包含體，因此重組ADI還需要再折疊；目前沒有關(guān)于變形假單胞菌為人類致病菌的報(bào)道。我們將變形假單胞菌產(chǎn)ADI用于抗肝癌細(xì)胞HEPG2實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，肝癌細(xì)胞HEPG2對(duì)該菌產(chǎn)ADI極為敏感，說(shuō)明該菌產(chǎn)的ADI可作為一種新型的治療肝癌的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。以下是變形假單胞菌(/^ewtfowoMosp/ecog/oM/c/必)CGMCC2039篩選、鑒定及發(fā)酵生產(chǎn)ADI以及ADI抗癌活性研究的實(shí)施例。但本發(fā)明并不限于所列出的幾個(gè)實(shí)例。具體實(shí)施方式實(shí)施例l產(chǎn)ADI菌種的篩選從無(wú)錫惠山、錫惠公園、京杭運(yùn)河無(wú)錫段等處取土樣5份，植物體樣品2份，水樣2份，一共9份樣品。取完樣后在12h之內(nèi)迅速篩選菌種。將樣品接種于富集培養(yǎng)基中,3(TC,160rpm,培養(yǎng)24hr后，稀釋，涂布于篩選平板，3(TC,培養(yǎng)72hr后,挑選有紅色變色圈的菌落。共挑出54株有紅色變色圈的菌株。挑選變色圈大的菌落18株，接種至裝有5mL發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中，3CTC,160rpm培養(yǎng)24小時(shí)，采用二乙酰一肟-硫氨脲法對(duì)初篩出來(lái)的菌株進(jìn)行ADI酶活測(cè)定，挑選出酶活高的菌株。富集培養(yǎng)基L-精氨酸鹽酸鹽15g/L，生物素3mg/L，硫胺素20mg/L，混合鹽溶液10mL,pH6.0。平板篩選培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏2g/L，蛋白胨2g/L,NaCl1g/L，L-精氨酸鹽酸鹽10g/L，苯酚紅O.lg/L，NH4Cl1.5g/L，K2HP04lg/L，混合鹽溶液10mL，瓊脂20g/L，pH6.0。初篩發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏2g/L，蛋白胨2g/L，NaCllg/L,L-精氨酸鹽酸鹽10g/L，NH4C11.5g/L,K2HP04lg/L,混合鹽溶液lOmL，pH7.0。其中混合鹽溶液MgS04*7H205%，MnS04'4H201%，F(xiàn)eS04*7H200.05%,NaCl0.2%。初篩復(fù)篩結(jié)果見表l，菌株SW-P1變色圈出現(xiàn)最快，變色圈數(shù)最多，該菌株來(lái)源于運(yùn)河水樣。表l18株較大酚紅變色圈菌株的復(fù)篩結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(注SW為發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室的編號(hào)，P為假單胞菌代號(hào)，19為流水號(hào))。實(shí)施例2SW-P1菌株的鑒定對(duì)實(shí)施例1篩選得到的菌株SW-P1按《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)》，以及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化特性鑒定(見表2)，并按精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南方法提取染色體DNA,委托大連寶生物科技公司對(duì)該菌16SrDNA擴(kuò)增及測(cè)序，得到該菌株的16SrDNA序列后，在NCBI網(wǎng)站上用BLAST檢索GenBank中相關(guān)菌株的16SrRNA基因序列，并進(jìn)行同源性比對(duì)(表3)?；谛螒B(tài)、生理生化特征和16SrDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析等方面的鑒定，將菌株SW-P1鑒定為變形假單胞菌，擬命名為變形假單胞菌(尸ww&mo"Mp/ecog/ow/cW")SW-Pl,此株菌已保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.2039。表2菌株CGMCC2039與假單胞菌屬部分成員生理生化特性鑒定結(jié)果對(duì)照<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注+90%以上陽(yáng)性，一90°/。以上陰性，d10%-89%為陽(yáng)性CGMCC2039菌株的16SrDNA序列(1457bp)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>表316SrDNA序列同源性(或相似性)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例3CGMCC2039菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶斜面培養(yǎng)按培養(yǎng)基配方蛋白胨2.5g/L，酵母膏2.5g/L，牛肉膏2.5g/L，NaCl5g/L，瓊脂20g，pH7.0。按常規(guī)方法制作斜面，用實(shí)施例1篩選得到的CGMCC2039菌株接種，30°C，培養(yǎng)24小時(shí)。種子與發(fā)酵培養(yǎng)基配方葡萄糖15g/L，酵母膏3g/L，蛋白胨3g/L，L-精氨酸鹽酸鹽5g/L，Na2HP04'12H2012g/L，NaH2P04'2^03g/L，(NH3)2HP042g/L，pH7.0;種子培養(yǎng)基裝液量60ml/250ml三角瓶。接一環(huán)培養(yǎng)好的斜面菌種于三角瓶中，30°C，190轉(zhuǎn)/分，搖瓶培養(yǎng)14-18小時(shí)。采用5升發(fā)酵罐，將己培養(yǎng)好的搖瓶種子接入發(fā)酵罐中，接種量為2%，3(TC，轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分，風(fēng)量l:2體積/體積/分，消泡劑0.02%的條件下，培養(yǎng)20小時(shí)；發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵效價(jià)為1.67U/ml。表4為發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表4CGMCC2039菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例4CGMCC2039菌株的ADI酶基因測(cè)序(1)引物設(shè)計(jì)和用PCR方法釣取酶基因制備重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒的精氨酸脫亞氨酶基因是通過(guò)PCR方法從總的染色體DNA中擴(kuò)增得到的。兩個(gè)引物是根據(jù)己報(bào)道的假單胞菌的精氨酸脫亞氨酶基因序列設(shè)計(jì)的。Primer-F:ATGTCCGCTGAAAAACAGAAGTACGPrimer-R:TTAGTAGTTGATCGGGTCGCGCACG方法如下染色體DNA模板200ng，2.5單位Tag聚合酶，100nmol引物，lOmmoldNTP1.25uL，終體積50uL，PCR程序94。C變性5min,每循環(huán)94。C變性lmin，52。C退火lmin，72°C延伸2min,最后一次循環(huán)延伸10min，共30個(gè)循環(huán)。我們選用PGEM-T-easy作為克隆載體，將釣取的酶基因連接到該載體上，方法參照該載體使用說(shuō)明。(2)轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆培養(yǎng)大腸桿菌JM109，采用鈣鹽法制備感受態(tài)細(xì)胞；采用熱轉(zhuǎn)化法將克隆載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109,藍(lán)白篩選挑選出陽(yáng)性克隆。(3)質(zhì)粒提取、純化、測(cè)序?qū)⒖寺￡?yáng)性菌單菌落，接入LB/Amp5ml培養(yǎng)基中，37°C,200rpm過(guò)夜培養(yǎng)。.收集菌體，提取質(zhì)粒，并純化。采用T7與SP6為測(cè)序引物(PrimerT7:TAATACGACTCACTATAGGG;PrimerSP6:ATTTAGGTGACACTATAGAA)，由上?；瞪锟萍脊具M(jìn)行測(cè)序，測(cè)得該酶基因?yàn)?254bp。CGMCC2039產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶基因序列(1254bp)161121181241301361421481541601661721781841卯l9611021讓11411201其中20.4%A;33.2%C;31.3%G;15.1%T;實(shí)施例5CGMCC2039菌株的ADI抗癌活性初步實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞(1)正常細(xì)胞L02(人體正常肝細(xì)胞株)(2)腫瘤細(xì)胞HepG2(肝癌細(xì)胞株)在含有10%小牛血清的1640培養(yǎng)基中，分別添加作為陰性對(duì)照的空白培養(yǎng)基，以及經(jīng)超聲波處理后，懸浮于磷酸緩沖溶液(PBS)的變形假單胞菌制劑，使得該制劑稀釋至一定濃度，添加到已于37'C(5%C02)的環(huán)境中生長(zhǎng)24小時(shí)的所用細(xì)胞中(最終每孔細(xì)胞個(gè)數(shù)約為7000個(gè)/300微升)，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，采用SRB法為細(xì)胞染色，并在酶標(biāo)儀上530nm處測(cè)其OD值。結(jié)果見表5。表5ADI對(duì)不同細(xì)胞的抑制率細(xì)胞株L02HepG2酶活(U/mL)0.50.050.0050細(xì)50.0430.0870.1300.1730.217抑制率(％)39.624.32.99,463.498,096,396.293.1由表5表明，使用本發(fā)明中實(shí)驗(yàn)劑量的變形假單胞菌ADI第U劑，經(jīng)72小時(shí)引起了HepG2腫瘤細(xì)胞相當(dāng)明顯的抑制，而對(duì)正常L02肝細(xì)胞則無(wú)顯著影響。權(quán)利要求1、一株產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶的微生物菌株，其分類屬假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌屬(Pseudomonas)的變形作i單胞菌Pseudomonasplecoglossicida)，^呆藏號(hào)為CGMCCNo.2039，以及保留此活性的該菌的傳代株、變異株和衍生株。2、一種微生物發(fā)酵產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶的方法，其特征是(1)發(fā)酵菌株為CGMCCNo.2039;(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為葡萄糖5-20g/L、酵母膏l(xiāng)-5g/L、蛋白胨l-5g/L、L-精氨酸鹽酸鹽5-20g/L、Na2HP04*12H206-15g/L、NaH2P04*2H20l-5g/L、(NH3)2HP04l-5g,pH6.5-8.0;(3)發(fā)酵培養(yǎng)按1%-5%的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度28-35°C，好氧條件，培養(yǎng)18-28小時(shí)。3、如權(quán)利要求1所述變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)CGMCC2039的ADI基因?yàn)?254bp，其重組質(zhì)粒PGEM-T-ADI，由以下方法構(gòu)建(1)從CGMCC2039菌株中分離提取染色體DNA;(2)用PCR方法從上述染色體DNA中釣取酶的基因；(3)將酶的基因連接在質(zhì)粒PGEM-Teasy上。4、如權(quán)利要求1所述的變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)CGMCC2039以及保留此活性的該菌的傳代株、變異株和衍生株生產(chǎn)的酶在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。全文摘要一種篩選產(chǎn)精氨酸脫亞氨酶(ADI)菌株及其應(yīng)用，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種快速篩選產(chǎn)ADI菌株的方法，發(fā)酵產(chǎn)ADI的微生物變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)CGMCCNo.2039，以及利用該微生物生產(chǎn)ADI的方法。該微生物在好氧條件并維持pH6.5-8.0的環(huán)境下，發(fā)酵培養(yǎng)20-24小時(shí)，酶活可達(dá)到1.6U/mL發(fā)酵液。該菌所產(chǎn)ADI對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2有很強(qiáng)的抑制作用。從該菌的染色體DNA中釣取ADI基因，并得到該基因序列。文檔編號(hào)A61K35/66GK101121925SQ20071010782公開日2008年2月13日申請(qǐng)日期2007年5月17日優(yōu)先權(quán)日2007年5月17日發(fā)明者曄倪,劉詠梅,劉宇鵬,孫志浩,璞鄭申請(qǐng)人:江南大學(xué)