抗禽流感病毒的中藥及其制作方法

專利名稱：抗禽流感病毒的中藥及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種獸用藥品，具體地說是一種抗禽流感病毒的中藥。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的一種急性接觸性傳染病。高、低致病力的禽流感給世界各國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)均帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)抗原具有多樣性，各亞型之間缺乏堅(jiān)強(qiáng)的交叉保護(hù)作用。由于臨床上常用的抗禽流感病毒藥物例如鹽酸金剛烷胺使產(chǎn)蛋雞產(chǎn)量下降，同時(shí)AIV對(duì)其易產(chǎn)生耐藥性，而病毒唑、病毒靈不僅使產(chǎn)蛋量下降，而且是人畜共用的藥物，限制了它們?cè)谂R床的應(yīng)用。由于藥物殘留問題已經(jīng)限制了我國(guó)動(dòng)物源性食品的出口，所以開發(fā)出一種綠色、無(wú)污染、安全、有效、畜禽專用的抗禽流感病毒藥物已迫在眉睫。該藥物的研制不僅可以解決處在亞臨床狀態(tài)雞群的免疫問題，可以是有效預(yù)防禽流感的途徑之一。
中草藥在我國(guó)資源豐富，價(jià)格低廉。相對(duì)于化學(xué)合成藥物而言，中草藥有多種有效成分，不僅具有毒性低、不易產(chǎn)生副作用、多靶點(diǎn)、病原微生物對(duì)其不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，而且在抗菌抗病毒的同時(shí)，還能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫機(jī)能，提高機(jī)體抗病力。目前，國(guó)內(nèi)研究的抗流感病毒中草藥大多數(shù)是解表藥和清熱藥以及以他們?yōu)橹魉幗M成的中成藥，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。
禽流感和人流感有密切的相關(guān)性，目前分離的禽流感病毒，幾乎包羅全部人流感病毒的兩種表面抗原，從感染流感的家禽體內(nèi)能分離到人流感病毒并能檢測(cè)到相應(yīng)的抗體。近幾年來(lái)，禽流感已經(jīng)給世界各國(guó)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，中草藥是我國(guó)最有可能獲得自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一大類藥物，具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力和市場(chǎng)潛力，所以開展對(duì)抗禽流感病毒中草藥的研究已勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種不影響產(chǎn)蛋量，副作用小的抗禽流感病毒的中藥。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的它是重量比為貫眾8-10份、板藍(lán)根8-10份、黃芪15-20份、柴胡8-10份、連翹5-8份、黃連8-10份、金銀花8-10份、黃芩8-10份和甘草4-6份制成的。
本發(fā)明的產(chǎn)品是采用這樣的方法制成的按重量比為貫眾8-10份、板藍(lán)根8-10份、黃芪15-20份、柴胡8-10份、連翹5-8份、黃連8-10份、金銀花8-10份、黃芩8-10份和甘草4-6份的比例將各原料混合，加水浸漬30分鐘，煎煮2次，每次一小時(shí)，分次過濾，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度1.2，放冷，加乙醇使含醇量達(dá)75％，充分?jǐn)嚢?，靜置12小時(shí)。取上清夜，回收乙醇至無(wú)味，加入3-4倍量水，充分?jǐn)嚢璨⒓訜嶂练序v，靜止48小時(shí)，濾取上清液，濃縮至相對(duì)密度1.10，濾過，加入0.07％對(duì)羥基苯甲酸乙酯，灌封。
本發(fā)明的產(chǎn)品是一種中藥復(fù)方制劑，中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床治病的主要形式和手段，是中藥藥學(xué)的重要組成部分。中藥復(fù)方是單味用藥的發(fā)展，復(fù)方的作用明顯優(yōu)于單味藥。禽流感病毒感染后，極易并發(fā)細(xì)菌感染，此外引起全身器官出血性變化，引起免疫抑制，所以選用一些抗禽流感病毒效果好的，且有抗菌作用的中藥。本發(fā)明針對(duì)發(fā)病雞出現(xiàn)高熱、出血、腹瀉、飲食欲降低或廢絕、免疫力低下等共性，選用由貫眾、板藍(lán)根、黃芪等多組中藥組成的復(fù)方中藥，起到抗病毒防止繼發(fā)感染的作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，該藥物對(duì)高致病力的禽流感有一定的防治作用，并具有安全可靠，不影響蛋雞的產(chǎn)蛋量等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的產(chǎn)品具有如下特點(diǎn)1、抗外禽流感病毒的作用通過復(fù)方藥物在MDCK上及雞胚上對(duì)禽流感病毒的作用可以初步推斷本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)禽流感病毒不僅有直接滅活作用，還可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗病毒的作用。
2、安全可靠根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的外來(lái)化合物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，小白鼠一次口服復(fù)方中藥后給藥劑量大于40000mg/kg.b.w，為無(wú)毒。腹腔注射本發(fā)明的產(chǎn)品后其半數(shù)致死量CD50為425.6mg/kg.b.w。屬于低毒。小白鼠口服復(fù)方中藥后的CD50與腹腔注射后CD50相差很大?？赡芩幬锝?jīng)過消化道后，有毒物質(zhì)被分解為無(wú)毒物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)。而腹腔注射后，藥物直接以原型的形式進(jìn)入血液循環(huán)，引起全身中毒。
3、對(duì)雛雞免疫功能的影響(1)對(duì)雛雞免疫器官發(fā)育的影響在正常生理情況下，動(dòng)物機(jī)體的免疫器官重量增加，主要因?yàn)檫@些免疫器官自身細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、分裂增殖形成；而重量減少，則是這些器官成熟的細(xì)胞釋放入血或自身細(xì)胞停止生長(zhǎng)發(fā)育、分裂增殖所致。給藥組雛雞胸腺、法氏囊和脾臟等免疫器官指數(shù)均高于空白對(duì)照組，說明免疫系統(tǒng)成熟較快。所以該本發(fā)明的產(chǎn)品可促進(jìn)SPF雛雞免疫器官的發(fā)育和迅速成熟，使SPF雞免疫功能增強(qiáng)，抵抗各種病原微生物感染，提高抗應(yīng)激能力。
(2)對(duì)SPF雞T淋巴細(xì)胞的影響本發(fā)明申請(qǐng)初步進(jìn)行雛雞服用復(fù)方中藥后對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的影響。CD3+是存在于所有成熟T淋巴細(xì)胞表面。鑒定和區(qū)別T淋巴細(xì)胞的主要表面標(biāo)志，它代表著整個(gè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中，給藥組和疫苗組+給藥組的CD3+T淋巴細(xì)胞含量明顯高于對(duì)照組，所以雛雞在1日齡服用該復(fù)方中藥后，可以顯著提高雞群的細(xì)胞免疫。CD4+T淋巴細(xì)胞具有誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的作用，能分泌多種具有免疫活性的淋巴因子，并刺激B淋巴細(xì)胞的活化、增殖和產(chǎn)生特異性抗體。在本實(shí)驗(yàn)中，給藥組+免疫組的禽流感抗體比免疫組高也證明這一理論。CD8+T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞毒殺作用。給藥組+免疫組的CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比含量比空白對(duì)照組高，說明增加機(jī)體通過細(xì)胞毒殺作用開始抵御和清除細(xì)胞內(nèi)的病原，從而對(duì)病毒的侵害起到一定的防御措施，這也是證明本發(fā)明產(chǎn)品的抗病毒作用的免疫機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)所用的復(fù)方制劑可促進(jìn)免疫器官中免疫活性細(xì)胞的增殖，提高機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫機(jī)能。這與其他中藥的研究報(bào)道一致。
4、用藥物累積法研究本發(fā)明的產(chǎn)品在小白鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)用藥物累積法研究藥代動(dòng)力學(xué)的方法有兩種。第一種是以動(dòng)物死亡率作為觀察指標(biāo)的“累積法”即給多組動(dòng)物按不同間隔時(shí)間給藥，求出不同時(shí)間體存百分率的動(dòng)態(tài)變化情況，從而計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。第二種是以藥物療效作為觀察指標(biāo)的“累積法”。藥物累積法適用于具有一定毒性的中藥復(fù)方的藥動(dòng)學(xué)研究。利用藥物累積法研究藥物在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，測(cè)算有關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是能體現(xiàn)復(fù)方配伍的整體性，符合中醫(yī)用藥的基本理論。但其主要適用于毒理與藥理效應(yīng)由同一組分產(chǎn)生的中藥復(fù)方，而且只能在某種程度上反映毒性成分的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的產(chǎn)品在小白鼠體內(nèi)的表觀分布容積(v)值為10.039，說明該藥與血漿和組織蛋白結(jié)合力很高。本發(fā)明產(chǎn)品的ka值為4.9078/hrs，說明該藥吸收快。當(dāng)腹腔注射后，10分鐘即可出現(xiàn)中毒臨床癥狀，半小時(shí)后出現(xiàn)死亡的臨床表現(xiàn)，從臨床癥狀說明藥物很快進(jìn)入血液，發(fā)揮作用，這兩者是一致的。Kel為消除速率常數(shù)，其大小代表藥物在體內(nèi)的消除快慢。本實(shí)驗(yàn)中kel為0.1501，表示藥物在體內(nèi)消除速度越慢，藥物濃度下降也慢，藥物在體內(nèi)存留時(shí)間長(zhǎng)，藥效也長(zhǎng)。綜上所述，該藥腹腔注射后，在小白鼠體內(nèi)代謝具有吸收快，消除慢的特點(diǎn)。
5、防治SPF雞感染禽流感病毒的試驗(yàn)研究(1)本發(fā)明產(chǎn)品治療SPF雞感染禽流感病毒的研究從各組的保護(hù)率結(jié)果看出，鹽酸金剛烷胺起到一定的保護(hù)作用。從雞只平均存活時(shí)間上看，也能證實(shí)這點(diǎn)。因?yàn)辂}酸金剛烷胺抑制流感病毒的m2基因，從而使m2基因不能行使離子通道功能，抑制病毒的復(fù)制。但是，低濃度的鹽酸金剛烷胺與流感病毒在試驗(yàn)室條件下共同培養(yǎng)時(shí)，極易產(chǎn)生耐鹽酸金剛烷胺的病毒。這些突變的病毒在遺傳上很穩(wěn)定，不僅耐鹽酸金剛烷胺毒株在禽體內(nèi)極易分離到，而且在人體內(nèi)也極易分離到耐鹽酸金剛烷胺的病毒。當(dāng)耐鹽酸金剛烷胺出現(xiàn)后，鹽酸金剛烷胺很快失去效果，并且耐鹽酸金剛烷胺毒株成為當(dāng)?shù)氐牧餍卸局?，所以，?dāng)耐鹽酸金剛烷胺毒株出現(xiàn)后，不僅可引起治療失敗，而且還可以在易感宿主體內(nèi)傳播。
我國(guó)從58年以來(lái)，已經(jīng)在體外實(shí)驗(yàn)篩選到近千種的抗流感病毒的中草藥，但是在動(dòng)物體內(nèi)有肯定的抑制流感病毒的還不多見?？赡苡幸韵略蚴紫龋胁菟幪崛∥飪?nèi)含成分非常復(fù)雜，在體外實(shí)驗(yàn)中能影響病毒吸附和復(fù)制，但在動(dòng)體內(nèi)有些有效成分被分解，或者抗流感的有效成分未被吸收，即使吸收也達(dá)不到相應(yīng)血藥濃度，所以達(dá)不到治療的效果。本發(fā)明的產(chǎn)品在體外有強(qiáng)的抗禽流感病毒作用，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，結(jié)果不甚理想，可能是因?yàn)樵搹?fù)方中藥的使用濃度稍低，其原因有待于進(jìn)一步探討。
(2)預(yù)防SPF雞感染禽流感病毒的研究從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，復(fù)方中藥預(yù)防組不論是在攻毒組，還是在同群感染組，其死亡保護(hù)率及平均存活時(shí)間都比本發(fā)明產(chǎn)品治療組高。所以本復(fù)方中藥抑制病毒只是一個(gè)方面，更重要的是調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)在能動(dòng)性，消除組織細(xì)胞損傷，恢復(fù)內(nèi)環(huán)境平衡，內(nèi)外并重。
(3)感染病毒組、同群感染組的病毒分離情況在試驗(yàn)中，中藥用藥組及鹽酸金剛烷胺用藥組的雞群排毒量均比對(duì)照組低，說明本發(fā)明產(chǎn)品能抑制病毒的復(fù)制。在同等情況下，從泄殖腔棉試子分離到病毒含量比從喉頭棉試子分離到的病毒含量低。這可能是因?yàn)楸景l(fā)明產(chǎn)品及鹽酸金剛烷胺均是以飲水的方式給藥，使腸道內(nèi)病毒含量降低。所以根據(jù)此結(jié)果，可以推測(cè)，如果該復(fù)方藥物以噴劑的形式給藥，可以抑制流感病毒與肺上皮細(xì)胞的結(jié)合，療效會(huì)更佳。
上述特點(diǎn)是通過如下試驗(yàn)得出的1.材料與方法1.1供試試劑和病毒本發(fā)明產(chǎn)品為黃褐色透明澄清液體。對(duì)照組鹽酸金剛烷胺購(gòu)于東北制藥總廠；H5N1和H9N2亞型的禽流感病毒、MDCK細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物流感中心提供；細(xì)胞培養(yǎng)板(24，96孔)、DMEM購(gòu)于Gibco公司；SPF雞胚、SPF雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所；FITC標(biāo)記的CD3購(gòu)自Southern BiotechnologyAssociates.Inc公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD4、CD8、TCR由喬傳玲博士后、姜永萍博士惠贈(zèng)。H9亞型禽流感油乳劑滅活疫苗由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感開放實(shí)驗(yàn)室提供，F(xiàn)ACScanTM(Flow cytometer BDIS，San Jose，CA)，Beckman離心機(jī)等。
1.2藥物無(wú)毒劑量測(cè)定1.2.1藥物對(duì)雞胚的最大無(wú)毒劑量取本發(fā)明產(chǎn)品的多個(gè)稀釋度接種5個(gè)10日齡雞胚(0.2ml/胚)，同時(shí)設(shè)滅菌生理鹽水對(duì)照，24小時(shí)以內(nèi)死亡雞胚棄掉，24小時(shí)后死亡雞胚及時(shí)取出冷凍，活雞胚繼續(xù)孵化直至出雛。
1.2.2藥物對(duì)犬腎細(xì)胞(MDCK)毒性實(shí)驗(yàn)取上述用細(xì)胞維持液稀釋的不同稀釋度的本發(fā)明產(chǎn)品，每稀釋度接種4孔，每管1ml，并設(shè)正常對(duì)照管，每天觀察細(xì)胞病變，觀察結(jié)果。
1.3本發(fā)明產(chǎn)品在雞胚上抗禽流感病毒試驗(yàn)1.3.1本發(fā)明產(chǎn)品與禽流感病毒直接滅活作用將不同濃度的樣品分別與等量105EID50的H5N1與104EID50的H9N2混勻，在室溫作用1h后，立即分別接種于9-10日齡雞胚尿囊腔內(nèi)，每組4枚，37℃孵育96小時(shí)，分別測(cè)定各組雞胚尿囊液內(nèi)的血凝效價(jià)。同時(shí)設(shè)生理鹽水，病毒及室溫放置1h后的病毒對(duì)照。
1.3.2本發(fā)明產(chǎn)品在雞胚上對(duì)禽流感病毒的治療作用將9-10日齡雞胚分組，4個(gè)/組，先分別接種104EID50H9N2和105EID50H5N10.1ml，接種于尿囊腔內(nèi)，37℃孵化1小時(shí)后，接種各稀釋度的本發(fā)明產(chǎn)品，37℃孵化96小時(shí)。測(cè)定每組雞胚尿囊腔中病毒的血凝效價(jià)。
1.3.3本發(fā)明產(chǎn)品在雞胚上對(duì)禽流感病毒的預(yù)防作用先依法接種藥物，后接種病毒，操作方法同上。
1.3本發(fā)明產(chǎn)品在MDCK上抗禽流感病毒實(shí)驗(yàn)1.3.1本發(fā)明產(chǎn)品與病毒相混立即加入細(xì)胞將不同稀釋度、不同本發(fā)明產(chǎn)品(在最大無(wú)毒劑量基礎(chǔ)上)與等體積10TCID50H9N2和H5N1混合作用1h后，立即接種細(xì)胞，并同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照，正常細(xì)胞和藥物對(duì)照。
1.3.2本發(fā)明產(chǎn)品在MDCK上對(duì)禽流感病毒的預(yù)防作用先用不同稀釋度、不同本發(fā)明產(chǎn)品37℃處理細(xì)胞1h后，按1.3.1中方法加入病毒。同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照，正常細(xì)胞和藥物對(duì)照。
1.3.3本發(fā)明產(chǎn)品在MDCK上對(duì)禽流感病毒的治療作用先接種10TCID50H9N2和H5N1病毒感染細(xì)胞，在37℃孵化1h，按1.3.1中方法加入各稀釋度不同中藥。同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照，正常細(xì)胞和藥物對(duì)照。
1.3.4結(jié)果判定在雞胚內(nèi)，能抑制血凝滴度32倍以上的最小藥量，即為有效藥物濃度。在MDCK細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)，不引起細(xì)胞病變的藥物濃度為有效的藥物濃度[2]1.4急性毒性實(shí)驗(yàn)-半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定采取口服和腹腔注射兩種給藥途徑?？诜┝繛?30mg/10g.b.w，口服組組間劑量比為1∶0.8，試驗(yàn)共分7組，其中一組為對(duì)照組，10只/組；連續(xù)觀察7天，并稱量體重。腹腔注射組注射劑量為50mg/10g.b.w，組間劑量比為1∶0.75，試驗(yàn)共為6組，其中一組為對(duì)照組，10只/組。腹腔注射后，死亡動(dòng)物及時(shí)剖檢并取心、肝、脾、腎、肺做病理切變，觀察其病理變化。采用簡(jiǎn)化機(jī)率單位計(jì)算法計(jì)算LD50。
1.5本發(fā)明產(chǎn)品藥代動(dòng)力學(xué)的研究1.5.1給藥劑量及給藥時(shí)間的確定取CD5-CD35范圍內(nèi)劑量。本實(shí)驗(yàn)取CD11的劑量即125mg/kg.b.w兩次相同量用藥。取0.5、1、2、4、8、12h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)再次給藥。
1.5.2動(dòng)物分組按性別、體重等組間一致原則將小鼠分為6組，每組20只，第一次給藥后不同時(shí)間第二次用藥，觀察兩次用藥后的死亡率(不再出現(xiàn)死亡為止)。腹腔注射藥液容量為0.5ml，125mg/kg.b.w。
2.5.3計(jì)算方法由表查出各死亡率的幾率單位，按D-P直線找出死亡率的相應(yīng)劑量，按下列計(jì)算藥量的體存％體存％＝(死亡率相應(yīng)的函數(shù)劑量-第二次用量)/第一次用量×100％在本式中第一次和第二次用量在本實(shí)驗(yàn)中是相等的。就間隔時(shí)間與體存率、log體存率作圖，即得出一次用藥后體存％的動(dòng)態(tài)變化。此變化若符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，則按MCPKP程序擬合藥時(shí)曲線，也就是以體存％和時(shí)間的數(shù)據(jù)經(jīng)MCPKP程序進(jìn)行擬合[4]。
1.6本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)SPF雞免疫功能的影響將1日齡80羽SPF雞隨機(jī)分成4組，每組20羽，統(tǒng)一飼喂相同的全價(jià)飼料。兩組40只雞從1日齡起0.5％本發(fā)明產(chǎn)品飲水，其中20只雞15日齡免H9亞型的禽流感油乳劑滅活疫苗。其余20只作為給藥組；其余40只雞中，20只15日齡免H9亞型的禽流感油乳劑滅活疫苗，為疫苗對(duì)照組；另外20只為空白對(duì)照組。從15日齡開始，22天、29天隨機(jī)抽取發(fā)育正常的5羽雞，按常規(guī)方法屠宰，分離并測(cè)定胸腺、脾臟、法氏囊免疫器官的指數(shù)(免疫器官重量除以相應(yīng)雞體重求得各臟器指數(shù))。了解免疫器官生產(chǎn)發(fā)育情況。在21日齡，從4組實(shí)驗(yàn)雞中隨機(jī)挑選5只，心臟采2ml肝素抗凝血。在FAC上測(cè)量CD3、CD4、CD8及γδTCR的含量。采用血凝抑制(HI)方法檢測(cè)血清中禽流感抗體滴度。
1.7本發(fā)明產(chǎn)品防治SPF雞感染禽流感病毒的試驗(yàn)研究試驗(yàn)共分5組，第I組是中藥治療組，共18只SPF雞。18只雞同時(shí)給予0.5％的中藥飲水。其中8只給藥同時(shí)功擊H5N1亞型禽流感病毒，攻毒劑量為104EID50/0.1ml，肌肉注射0.2ml。另外10只不攻毒，以便模擬雞場(chǎng)雞群自然感染及給藥后的治療情況。
第II組是鹽酸金剛烷胺對(duì)照組，共17只SPF雞。17只雞同時(shí)給予0.1％的鹽酸金剛烷胺飲水。其中7只攻毒同時(shí)給藥，攻毒劑量為104EID50/0.1ml，肌肉注射0.2ml。另外10只不攻毒，以便模擬雞場(chǎng)雞群在給予鹽酸金剛烷胺后的治療情況。
第III組是中藥預(yù)防組。實(shí)驗(yàn)用雞12只SPF雞，12只雞均在攻毒前15天給予0.5％的中藥。其中6只攻毒，攻毒劑量為104EID50/0.1ml，肌肉注射0.2ml/只。另外6只不攻毒，以便模擬雞場(chǎng)雞群在給予本發(fā)明產(chǎn)品后的預(yù)防及治療情況。
從攻毒開始連續(xù)觀察14天，觀察并記錄雞的死亡數(shù)，然后計(jì)算死亡率，保護(hù)率、平均存活時(shí)間。在攻毒后3、5、7天采集泄殖腔、喉頭棉試子，采集的棉試子用滅菌生理鹽水配成10-1-10-8懸液，尿囊腔接種在9-10日齡5只SPF雞胚內(nèi)，在37℃孵育48小時(shí)，按照微量紅細(xì)胞凝集法，檢查雞胚尿囊液中血凝活性。如具有血凝活性，通過血凝抑制試驗(yàn)在排除新城疫病毒感染的前提下，說明有禽流感病毒的存在。
第IV組是對(duì)照組。對(duì)照組分3組。一組為攻毒組，攻毒劑量同其他組，共8只SPF雞，另外一組為7只SPF雞同群感染組，最后一組未感染病毒對(duì)照組，由4只SPF雞組成。
2結(jié)果2.1本發(fā)明產(chǎn)品最大無(wú)毒劑量測(cè)定藥物對(duì)雞胚、MDCK的無(wú)毒劑量分別是1000mg/ml、62.5mg/ml。
2.2本發(fā)明產(chǎn)品體外抗病毒的作用2.2.1本發(fā)明產(chǎn)品在雞胚內(nèi)對(duì)禽流感病毒的作用本發(fā)明產(chǎn)品在雞胚內(nèi)對(duì)H5N1亞型禽流感病毒的有效滅活濃度、治療濃度及預(yù)防濃度分別是31.25mg/ml、125mg/ml及250mg/ml，對(duì)H9N2亞型禽流感病毒的有效滅活濃度、治療濃度及預(yù)防濃度分別是31.25mg/ml、15.625mg/ml及62.5mg/ml。
2.2.2本發(fā)明產(chǎn)品在MDCK上對(duì)禽流感病毒的作用本發(fā)明產(chǎn)品在雞胚內(nèi)對(duì)H5N1亞型禽流感病毒的有效滅活濃度、治療濃度及預(yù)防濃度分別是31.25mg/ml、125mg/ml，治療濃度未測(cè)出。對(duì)H9N2亞型禽流感病毒的有效滅活濃度、治療濃度及預(yù)防濃度分別是15.62 5、31.25mg/ml及31.25mg/ml。
2.3本發(fā)明產(chǎn)品的安全性研究2.3.1本發(fā)明產(chǎn)品口服組對(duì)小白鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)本發(fā)明產(chǎn)品口服后，沒有引起小白鼠的死亡。但在高劑量時(shí)有體重減輕的趨勢(shì)。
2.3.2本發(fā)明產(chǎn)品腹腔注射后對(duì)小白鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)小白鼠腹腔注射中藥10min后，即表現(xiàn)出興奮不安，痙攣，縮成一團(tuán)，呼吸困難，在給藥后0.5h出現(xiàn)死亡。對(duì)死亡鼠各臟器進(jìn)行剖檢肝臟體積稍腫大，被膜緊張，邊緣鈍圓，表面呈暗紫紅色，切面呈暗紅色，質(zhì)地變軟。脾、腎臟體積均增大。按照劑量的減少，死亡率也相應(yīng)減少，而且臟器病變也逐漸降低。經(jīng)組織學(xué)病理切片后可以看出，各臟器的病理變化與劑量呈一定的關(guān)系。用簡(jiǎn)化幾率單位計(jì)算法(也稱和爾恩法)計(jì)算CD50。該本發(fā)明產(chǎn)品經(jīng)腹腔注射后，對(duì)小白鼠的CD50為425.6mg/kg.b.w。
2.4本發(fā)明產(chǎn)品藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)根據(jù)小白鼠死亡率計(jì)算體存藥物量，通過MCPKP程序?qū)w存百分率與間隔時(shí)間擬合后，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及藥-時(shí)方程。該本發(fā)明產(chǎn)品在小白鼠體內(nèi)的經(jīng)時(shí)過程為一室模型。其藥-時(shí)方程式為C＝650.66e-4.9078t，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1表1本發(fā)明產(chǎn)品在小白鼠體內(nèi)的表觀藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 1Pharmacoketics Parameter of combination herbs in mouse
2.5本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)SPF雞免疫功能的影響2.5.1本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)免疫器官指數(shù)的影響本發(fā)明產(chǎn)品飲水組的法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)在14日齡明顯高于對(duì)照組。
2.5.2本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)雛雞血清中禽流感抗體滴度的影響在免疫后半個(gè)月，給藥組+免疫組的禽流感抗體滴度比免疫組高1.6個(gè)滴度。
2.5.3本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)SPF雞體重變化的影響給藥組的體重明顯高于對(duì)照組，其中在第21天時(shí)重量差異顯著。
2.5.4不同的外周血液中CD3+、CD4+、CD8+、TCR+T淋巴細(xì)胞變化。
CD3+、CD4+、CD8+、TCR+T淋巴細(xì)胞的變化情況見表2。
表2.本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)外周血液中T淋巴細(xì)胞的影響(百分比)Table 2Influence on Tlymphocyte in peripheral blood of combination herbs(percentage)
I組為空白對(duì)照組；II組為疫苗免疫組；III組為疫苗+給藥組；IV組為給藥組。
2.6本發(fā)明產(chǎn)品防治SPF雞感染禽流感病毒的試驗(yàn)研究2.6.1保護(hù)作用除未感染病毒對(duì)照組外，感染病毒組均有雞只死亡。
2.6.1.1中藥對(duì)感染病毒組的保護(hù)作用在攻毒同時(shí)給予藥物的實(shí)驗(yàn)組保護(hù)率均低于同群感染后給藥組。本發(fā)明產(chǎn)品治療組保護(hù)率為0，說明其不能完全抑制禽流感病毒在雞體內(nèi)的復(fù)制與繁殖。而鹽酸金剛烷胺組的保護(hù)率為14.3％，說明鹽酸金剛烷胺能起到一定的保護(hù)作用。
從平均死亡時(shí)間來(lái)看，病毒感染對(duì)照組雞只死亡最快，其次是中藥治療組、中藥預(yù)防組、再次是鹽酸金剛烷胺組，最后為對(duì)照組。
2.6.1.2同群感染組保護(hù)作用除未感染禽流感病毒對(duì)照組以外，其他組均有雞只死亡。保護(hù)率以鹽酸金剛烷胺為最高，達(dá)33.4％，其次為本發(fā)明產(chǎn)品預(yù)防組達(dá)30％，再次是本發(fā)明產(chǎn)品治療組為20％。
2.6.2病毒分離情況2.6.2.1感染病毒組的病毒分離情況對(duì)感染病毒組的雞只在3、5、7天分離病毒。泄殖腔棉試子、喉頭棉試子分離病毒情況見表3。
表3.病毒感染組泄殖腔棉試子、喉頭棉試子病毒分離情況Table 3 Cultivating avian influenza virus of fecal and clocal
2.6.2.2同群感染組病毒的分離情況對(duì)同群感染組的雞只在3、5、7天分離病毒。分別采集泄殖腔棉試子和喉頭棉試子，結(jié)果見表4。
表4.同群感染組的泄殖腔棉試子病毒分離情況Table 4 Cultivating avian influenza virus of fecal
具體實(shí)施方式
下面舉例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)地描述按重量比為貫眾8-10份、板藍(lán)根8-10份、黃芪15-20份、柴胡8-10份、連翹5-8份、黃連8-10份、金銀花8-10份、黃芩8-10份和甘草4-6份的比例將個(gè)原料混合，加水浸漬30分鐘，煎煮2次，每次一小時(shí)，分次過濾，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度1.2，放冷，加乙醇使含醇量達(dá)75％，充分?jǐn)嚢?，靜置12小時(shí)。取上清夜，回收乙醇至無(wú)味，加入3-4倍量水，充分?jǐn)嚢璨⒓訜嶂练序v，靜止48小時(shí)，濾取上清液，濃縮至相對(duì)密度1.10，濾過，加入0.07％對(duì)羥基苯甲酸乙酯，灌封制成產(chǎn)品。
按重量比為貫眾9g、板藍(lán)根9g、黃芪18g、柴胡9g、連翹6g、黃連9g、金銀花9g、黃芩9g和甘草5g的比例將個(gè)原料混合，加水浸漬30分鐘，煎煮2次，每次一小時(shí)，分次過濾，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度1.2，放冷，加乙醇使含醇量達(dá)75％，充分?jǐn)嚢瑁o置12小時(shí)。取上清夜，回收乙醇至無(wú)味，加入3-4倍量水，充分?jǐn)嚢璨⒓訜嶂练序v，靜止48小時(shí)，濾取上清液，濃縮至相對(duì)密度1.10，濾過，加入0.07％對(duì)羥基苯甲酸乙酯，灌封。
權(quán)利要求
1.一種抗禽流感病毒的中藥，其特征是它是重量比為貫眾8-10份、板藍(lán)根8-10份、黃芪15-20份、柴胡8-10份、連翹5-8份、黃連8-10份、金銀花8-10份、黃芩8-10份和甘草4-6份制成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗禽流感病毒的中藥，其特征是它是重量比為貫眾9g、板藍(lán)根9g、黃芪18g、柴胡9g、連翹6g、黃連9g、金銀花9g、黃芩9g和甘草5g制成的。
3.一種抗禽流感病毒的中藥的制作方法，其特征是按重量比為貫眾8-10份、板藍(lán)根8-10份、黃芪15-20份、柴胡8-10份、連翹5-8份、黃連8-10份、金銀花8-10份、黃芩8-10份和甘草4-6份的比例將個(gè)原料混合，加水浸漬30分鐘，煎煮2次，每次一小時(shí)，分次過濾，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度1.2，放冷，加乙醇使含醇量達(dá)75％，充分?jǐn)嚢瑁o置12小時(shí)，取上清夜，回收乙醇至無(wú)味，加入3-4倍量水，充分?jǐn)嚢璨⒓訜嶂练序v，靜止48小時(shí)，濾取上清液，濃縮至相對(duì)密度1.10，濾過，加入0.07％對(duì)羥基苯甲酸乙酯，灌封制得產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種抗禽流感病毒的中藥及其制作方法。它是重量比為貫眾8－10份、板藍(lán)根8－10份、黃芪15－20份、柴胡8－10份、連翹5－8份、黃連8－10份、金銀花8－10份、黃芩8－10份和甘草4－6份制成的。本發(fā)明的產(chǎn)品是一種中藥復(fù)方制劑，禽流感病毒感染后，極易并發(fā)細(xì)菌感染，此外引起全身器官出血性變化，引起免疫抑制，本發(fā)明選用一些抗禽流感病毒效果好的，且有抗菌作用的中藥。本發(fā)明針對(duì)發(fā)病雞出現(xiàn)高熱、出血、腹瀉、飲食欲降低或廢絕、免疫力低下等共性，選用由貫眾、板藍(lán)根、黃芪等多組中藥組成的復(fù)方中藥，起到抗病毒和防止繼發(fā)感染的作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，該藥物對(duì)高致病力的禽流感有一定的防治作用，并具有安全可靠，不影響蛋雞的產(chǎn)蛋量等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101023997SQ20071007195
公開日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2007年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月28日
發(fā)明者李艷華, 閆清波, 佟恒敏, 于康震, 孫元, 田國(guó)彬 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)