呼吸道合胞病毒亞單位疫苗、制備方法和應(yīng)用的制作方法

專利名稱：：呼吸道合胞病毒亞單位疫苗、制備方法和應(yīng)用的制作方法呼鵬合胞病毒亞單位疫苗、制備施和應(yīng)用駄領(lǐng)域本發(fā)明涉及呼鵬合胞病毒疫苗及其制備方法，更具體地說(shuō)是鵬大腸桿菌表達(dá)重組呼,合胞病毒G蛋白及突變G蛋白，并與無(wú)毒型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素制備疫苗，用于人體或動(dòng)物預(yù)防接種，呼吸道合胞病毒的感染，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。背景獄人類呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyncytialvirus,RSV)是全世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病原體，免疫缺陷病A^^人也是RSV的易感人群。僅在美國(guó)估計(jì)每年因RSV感染住院的就有90000個(gè)嬰幼兒，其中死亡率為2%5%。我國(guó)不但有RSV散發(fā)性感染，還發(fā)頓數(shù)次大規(guī)麟發(fā)流行。小兒呼吸纖染的患者中，合鵬毒的感染率達(dá)到12.3%，其中小于7月齡的患兒的合胞病，染率高達(dá)67.10%，2歲時(shí)兒童約有90X以上感染RSV，住院治療約占0.5%2%。正如其它病毒弓胞的疾病一樣，至今沒有特異性治療方法。本病對(duì)小兒Mitfe割艮大，臨床表現(xiàn)以低熱、下呼^m感染病變多見，嬰幼兒多呈陣咳、憋喘癥狀，甚至死亡。只有采用特異抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫治療，但給患兒和家長(zhǎng)帶來(lái)極大的痛苦和財(cái)產(chǎn)損失。所以疫苗的研頓得非常迫切，世界衛(wèi)鎖織(WHO)早已將RSV疫苗列為頓疫苗賺it^i沖優(yōu)先賺的疫苗之一。呼M合胞病毒(RespiratoiySyncytialVirus,簡(jiǎn)稱RSV)屬于副粘病毒科，肺病毒屬，中等大小(200300nm)，有囊膜，為單股負(fù)鏈RNA病毒?；蚪M由約15000個(gè)核苷酸組成，編碼3種跨膜蛋白(F、G、SH)，2種基質(zhì)蛋白(M1、M2)，3種核衣殼蛋白(N、P、L)和2種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2)。RSVftt上的膜融，)和粘斷G)糖蛋白可以誘導(dǎo)RSV中和抗體，是病毒疫苗石開究開發(fā)的顧蛋白。F蛋白與G、SH蛋白共同參與病毒外膜與宿主細(xì)鵬胞的融合以及細(xì)胞培養(yǎng)過程中胞合體的形成，F(xiàn)蛋白可引起,免疫和細(xì)胞免疫；G蛋白介導(dǎo)與宿主細(xì)胸摸的粘附，在RSV中主要參與決定抗原的多樣性，因此將RSV可分為A、B亞型，他們之間的G蛋白僅有53X的氨基酸同源性，在我國(guó)主要流行A亞型。^呼,合毒疫苗的研究和開發(fā)方面，公知的RSV疫HW滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗。60年代^^RSV滅活疫苗免疫兒童時(shí)可以誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，但不具保護(hù)性，而且疫苗使用后增強(qiáng)了幼兒后繼感^if毒株RSV的發(fā)病程度，住院治療和死亡率顯著提高。而RSV的減毒活疫苗給予12月齡未感染過RSV的嬰兒時(shí)，會(huì)導(dǎo)致上呼吸道的輕微至中度充血，表明還需要進(jìn)一步減毒。雖然減毒活疫苗的臨床微沒有弓胞疫苗增強(qiáng)疾病，但減毒活疫苗仍存在免疫原性差、毒力令A(yù)X隹以接受和遺傳不穩(wěn)定性，人們對(duì)使用該疫苗仍有疑慮。亞單位疫苗被認(rèn)為是^頓很安全的，不存在減毒活疫苗的毒力返祖和免疫原性差等問題，沒有RSV滅活疫苗使用后病情加重的擔(dān)憂。國(guó)外現(xiàn)已有RSV膜糖蛋白G和F為主構(gòu)建的兩種蛋白亞單位疫苗完成了II柳臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，PFP和BBG2Na疫苗是安全的，耐受'斷并具有免疫原性。以F蛋白為主的PFP疫苗是由細(xì)胞培養(yǎng)RSV，病毒，解純化F蛋白制成的亞單位疫苗，因此^成本高，病毒大St咅養(yǎng)時(shí)有安全風(fēng)險(xiǎn)；而由細(xì)菌表達(dá)的以G蛋白為主的BBG2Na疫苗，雖然降低了生產(chǎn)成本、提高了生產(chǎn)的安全性，但是由于G蛋白以及RSV的其它膜蛋白本身是糖蛋白，細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)沒有糖Sit功能，因而影響了疫苗的抗原性，斷氐了免疫效果；大腸桿菌等真核生物具有對(duì)外源蛋白的糖割七功能，表達(dá)的蛋白與天然蛋白具有完全相同的功能，但ffiii文獻(xiàn)和專利檢索，尚未發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中皿RSV膜蛋白的研究。絕大多數(shù)病原體^aa粘膜組織(呼B腿、消鵬、對(duì)直道等)感染人體的，RSV也不例外，為了有效地預(yù)防粘ra染，抗原，苗必須加強(qiáng)^a局部粘膜組織的免ffi答。而粘膜免疫佐劑大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(heat-labileenterotoxin，簡(jiǎn)稱LT)的全毒素(含A、B兩個(gè)亞基)或其B亞基會(huì),協(xié)助抗原蛋白有效鵬撒局部粘膜組織產(chǎn)生分泌型IgA(slgA)以及機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。slgA是粘膜組織表面的主要免疫分子，它可以中和粘膜部位的病原體，ffiih病原體對(duì)粘膜的后繼感染，同時(shí)機(jī)體對(duì)sIgA分泌有免疫記憶能力，反復(fù)的抗原或疫苗刺激可以提高特異的slgA分泌量，增強(qiáng)粘膜的抗感染能力。Cusi等將RSVF亞單位疫苗使用了無(wú)毒型LT佐劑免疫小鼠進(jìn)行了有益的嘗試，表明小鼠免疫后在粘膜和血清中產(chǎn)生較高的sIgA和IgG(Cusi改al，Vaccine,2002，20(29-30):3436)，該疫苗只是針對(duì)了RSV的單一性旨抗原F蛋白。Simmons等將RSV與LT和LTK63(無(wú)毒型LT)分別物理混合后滴鼻免疫小鼠，可以有效地M:粘膜部位的sIgA以及CTL反應(yīng)，使小鼠對(duì)RSV野毒株的攻擊更具有l(wèi)^性(Simmonsetal，JImmunol,2001，166(2):1106)，但RSV全病毒疫苗，在接種后引起了野毒株RSV感染的疾病加重。這兩篇文獻(xiàn)中疫苗抗原的制備方面采用全病毒細(xì)胞培養(yǎng)的方式進(jìn)行生產(chǎn)和純化的，后續(xù)工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高。因itbX寸于RSV亞單位疫苗而言，開發(fā)出一種既能降低大動(dòng)恪疫苗時(shí)的安全風(fēng)險(xiǎn)，又能節(jié)約生產(chǎn)成本，還可以加強(qiáng)RSV疫苗的粘膜免疫、條免疫和細(xì)胞免疫功能，同時(shí)又不影響疫苗的抗原性和免疫效果的制備系統(tǒng)極為必要。
發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明的目的是皿一種呼fM合胞病毒疫苗，在大腸桿菌中,RSV膜蛋白G，并以無(wú)毒型粘膜佐劑LT為佐齊糊被苗的方法，具體是應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)突變的RSV膜蛋白G及截短的G，以無(wú)毒型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素LT為佐劑，旨在提高RSV膜蛋白G免疫動(dòng)物的免疫力和粘膜免勤JC平，用于人體或動(dòng)物預(yù)防接種，抵抗呼吸道合胞病毒的感染。本發(fā)明的目的還是皿一種呼IM合胞病毒(RSV)亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用。通過克隆RSVG蛋白的保守區(qū)域并對(duì)CX3C模序去除或替換成CTL表位基因序列，在大腸桿菌中表達(dá)并中試發(fā)酵、純化，單獨(dú)或S^無(wú)毒型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素S^免疫機(jī)體，可以激發(fā)機(jī)體的,免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的，目的，本發(fā)明,了如下技術(shù)方案-呼^ii合胞病毒亞單位疫苗，含有截短的呼M合胞病毒RSV膜蛋白G。進(jìn)一步還含有無(wú)毒型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素LT佐劑。戶艦疫苗，是截短的呼b鵬合胞病毒RSV膜蛋白G包含原G蛋白上aal30230之間的錢酸，并且將aal82186之間的氨基酸CAWIC(CX3C,)替換為RSVM蛋白上的氨基酸YLEKESIYY(CTL表位)，形成Gctl蛋白，其基因序列為CACAAAACAACGTCAAAACAAACCACAAAACAAACCTAATAATGATnTCACTTTGAAGTAAGGAAGTACCTACCACCAAGCCTCACCACCACCACCACCACTAA。上述疫苗是將GciL蛋白基因重組到細(xì)菌表趟體上，并在大腸桿菌中表達(dá)、制備。更具體地，本發(fā)明,了由下述方法構(gòu)建而成的疫苗1)以全基因合成截短的RSVG蛋白基因序列nt288690總共303bp,以及引物gcl:5'-CnTCTnTTCCAGGTAAGrrGGATTGTTGCTGCAGATGC-3';gc2:5'-GAAAGTATITATTATAAAAGAATACCAAACAAAAAACCTG-3';gpl:5'-GGAATTCCATATGACAGTCAAGACCAAAAACACAACAACAACCCAAATAC-3';部10:5'-GCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTTGGTGGTAGGTACTTC-3';其中，gpl、gp10用于擴(kuò)增G蛋白基因，并引入iV^I和及卵Hl酶切位點(diǎn)和6XHISi^，gcl，gc2用來(lái)突變G基因中的CX3C模序，替換為CTL表位；引物gpl、gplO進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物即為截短的G基因；以G基因?yàn)槲ⅲ謩e用引物gpl/gcl以及gc2/gpl0進(jìn)行擴(kuò)增，獲得片段gll和g210，這兩個(gè)片段純化后適量混和為模板，再用引物gpl/gplO進(jìn)行擴(kuò)增，獲得突變的GoL基因；(2)重組表達(dá)載體Gcn7pET22b的構(gòu)建G基因和GcxL基因純化后分別用A/^I和5fl/wHI于37'C酶切2小時(shí)，回收純化片段，與純化的就載體pET22b雙酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶于16。C連,夜，連接產(chǎn)物3^熱休克法轉(zhuǎn)化用0&(:12制備的￡.0^01150，涂布Amp+-LB平板，37'C培養(yǎng)16小時(shí)，挑取數(shù)個(gè)單麟接種Amp+-LB培養(yǎng)液，37'C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，堿裂解法抽粒，Mfel和5謡i/I雙酶切質(zhì)粒，構(gòu)建重M豐採(cǎi)用戰(zhàn)方法再次轉(zhuǎn)化^co/mL21(DE3訴于誘導(dǎo)表達(dá)Gcn^蛋白。(3)GciL蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分另跟k取重組工程菌G/pET22b/BL21和Gcn/pET22b/BL21單菌落接種到Amp+-LB培養(yǎng)液中，37'C震蕩培養(yǎng)過夜，第二天按1%分別接種到飾羊Amp+-LB培養(yǎng)液中，37'C震蕩培養(yǎng)至OD600約為l.O時(shí)，分別加入0.5mmolIPTG在37。C誘導(dǎo),4小時(shí)，誘導(dǎo)結(jié)束后M量樣品進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot進(jìn)行鑒定；(4)重組工程菌Gcn7pET22b/BL21的中試發(fā)酵控制DO》400/。、pH值為7,2左右、鵬37°C，發(fā)酵8小時(shí)菌液密度達(dá)到OD600約為30時(shí)，加入0.1mmol/LIPTG，鵬降至25'C誘導(dǎo)4小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，菌液OD600約為54，菌^M重為39.20g/L，干重為6.95g/L，目標(biāo)蛋白的表達(dá)率約為18.2%，為可溶表達(dá)形式；(5)GcxL蛋白的純化中試發(fā)酵獲得誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌液纟紐離心收集菌體，溶于結(jié)合緩沖液(0.5mol/LNaCl,0.02mol/LNa2HPC^0.01mol/L咪唑)中，高壓破菌，離心收紅清，鄉(xiāng)淀，選擇ChelatingSepharoseFastFlowW柱和C。2+進(jìn)行親和層析純化，使用洗脫緩沖液(0.5mol/LNaCl，0.02mol/LNa2HPO4,0.5mol/L咪唑)洗脫目的蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)；(6)GciL蛋白的動(dòng)物免疫使用GciL蛋白加佐劑無(wú)毒型LT。此外，本發(fā)明戶腿疫苗應(yīng)用于增強(qiáng)粘膜免疫、微免疫和細(xì)胞免疫功能的RSV疫苗制備系統(tǒng)中。本發(fā)明的構(gòu)建疫苗的方案主要包括如下幾項(xiàng)1.在大腸桿菌中進(jìn)行,截短的RSV膜蛋白GRSV膜蛋白G的aal30230(基因序列nt390690)具有高度的保守性，以此為抗原免疫動(dòng)物可以同時(shí)預(yù)防RSVA和B亞型的感染。PCR擴(kuò)增G基因序列nt390690以及雙酶切后重組到大腸桿菌,載體pET22b上，轉(zhuǎn)化￡//81^210^3)，在AMP-LB平板上篩選，PCR擴(kuò)增以及抽粒和酶切鑒定。構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)截短的G蛋白。SDS-PAG和Westernblot鑒定G蛋白的W量和抗原性。2.在桿菌中進(jìn)行表達(dá)截短并突變的RSV膜蛋白G截短的RSV膜蛋白G(aal30230)中aal82186含有CX3C模序(CAWIC)，，列可以引起以酸性粒細(xì)胞增多糊市部病變特征，因雌用RSVM蛋白上的CTL表位(aa229-237，YLEKESIYY)替換G蛋白上的CX3C模序。合成CTL表位的基因序列，ffli!S疊延伸PCR連接CTL表位和截短的G蛋白基因序列，形成Gcil蛋白序列，雙酶切后重組到^M桿菌皿載體pET22b上，轉(zhuǎn)化￡>//81^1(0￡3),在AMP-LB平板上篩選，PCR擴(kuò)增以及抽提質(zhì)粒和酶切鑒定。構(gòu)建正確的重會(huì)IM粒用IPTG誘導(dǎo),截短的G蛋白。SDS-PAG和Westernblot鑒定Gcil蛋白的針量和抗原性。3.RSV膜蛋白G和Gctl分別與無(wú)毒型LT佐劑混和免疫動(dòng)物。蛋白G+LT、GciL+LT分別免疫小鼠，ELISA檢測(cè)小鼠的血清、唾液、呼鵬灌洗液中是體有抗G抗體，血液和呼吸道灌洗液中的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量，if^S幾種疫苗的免疫效果。與現(xiàn)有技斜目比，本發(fā)明具有以下有益效果(1)針對(duì)RSV疫苗的臨床試驗(yàn)中，國(guó)外4頓的G蛋白亞單位疫苗由W有CX3C模序，會(huì)引起機(jī)體呼吸道中以嗜酸性f娜胞增多為特性的肺炎，限制了該疫苗的進(jìn)一步開發(fā)。本發(fā)明不僅去除了G蛋白上的CX3C樹芋，而且用RSV的M蛋白上的CTL表位替換，即消除了CX3C弓胞的病理反應(yīng)，又增強(qiáng)了疫苗的細(xì)胞免ffi答功能。(2)采用無(wú)毒型LT與RSVG蛋白S^免疫動(dòng)物，提高了G蛋白的免疫原性，加強(qiáng)了G蛋白誘發(fā)機(jī)體的局部粘膜免疫功能和系統(tǒng)免疫功能，為機(jī)條呼吸道粘膜部位表面抗RSV感染提供了餅。(3)在大腸桿菌中表達(dá)RSV截短的蛋白G和突變的GciL，可以提高蛋白疫苗的表&7jC平，減少用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)病毒制備RSV疫苗時(shí)，由病毒所帶來(lái)的安全隱患。由于大腸桿菌結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快速、易于培養(yǎng)和發(fā)酵、4^成本低、目的蛋白產(chǎn)量高，這對(duì)于規(guī)?；a(chǎn)粘膜佐劑及其臨床應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但不以雌限制本發(fā)明。圖1是重組質(zhì)粒G/pET22b和Gcn/pET22b的雙酶切鑒定(M:DNAMarkerDL2000;1和2:G/pET22b的WifeI和5amHI雙酶切；3:Gcn7pET22b的MfeI和Bomi/1雙酶切)。圖2是SDS-PAGE檢測(cè)重組G和GciL的表達(dá)(M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:未誘導(dǎo)的G/pET22b/BL21;2:誘導(dǎo)的G/pET22b/BL21;3:未誘導(dǎo)的Gcn7pET22b/BL21;4:誘導(dǎo)的Gcn/pET22b/BL21)。圖3是Westemblot檢測(cè)重組G和GciL(1:陰性對(duì)照；2:重組G蛋白；3:重組Gctl蛋白)。圖4是SDS-PAGE檢測(cè)G蛋白和GciL蛋白的純化結(jié)果(M:蛋白W量標(biāo)準(zhǔn)；1:流穿峰；2:G/pET22b/BL21誘導(dǎo)產(chǎn)物；3:純化的G蛋白；4:純化的Gctl蛋白)。圖5是構(gòu)建本發(fā)明重組皿載體Gcn/pET22b的^路線圖。附圖中，截短的G蛋白基因序列AAAACAACGTCAAAACAAACCACAAAACAAACCTAATAATGATnTCACTTTGAAGTGTrACCAAGCCT具體實(shí)船式本發(fā)明中的實(shí)施例以￡>//8121(0￡3)及其表達(dá)載體？￡1221)進(jìn)行,118￥膜蛋白G、Gctl來(lái)說(shuō)明。實(shí)施例l:截短的RSV膜蛋白G和突變GciL基因的獲得委托DNA合成公司全基因合成RSVG蛋白基因序列nt288690總共303bp,以及弓胸gcl:5'^CnTCTTnTCCAGGTAAGTrGGATTGTTGCTGCAGATGC-3';gc2:5'-GAAAGTATTTATTATAAAAGAATACCAAACAAAAAACCTG-3';gpl:5'-GGAATTCCATATGACAGTCAAGACCAAAAACACAACAACAACCCAAATAC陽(yáng)3';gplO:5'隱GCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTTGGTGGTAGGTACTTC-3'。其中，gpl、gp10用于擴(kuò)增G蛋白基因，并引入MfeI和及柳HI酶切位點(diǎn)和6XfflS標(biāo)簽，gcl，gc2用來(lái)突變G基因中的CX3C豐辦，替換為CTL表位。引物(gpl、gplO)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物(約320bp)即為截短的G基因。采用重疊延伸PCR方法獲得GoL基因，即以全基因合成的G基因?yàn)槟０?，分別用引物gpl/gcl以及gc2/gpl0進(jìn)行擴(kuò)增，獲得片段gll和g210，這兩個(gè)片段純化后適量混和為模板，再用引物gpl/gp10進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得突變的GciL基因(約340bp)。G基因和Gc化基因的上下兩端分別引入了AWeI和及卵HI酶切點(diǎn)以及在5amHI酶切位點(diǎn)前加入6XfflS標(biāo)簽。實(shí)施例2:重組,載體G/pET22b和Gcn7pET22b的構(gòu)建G基因和GciL基因純化后分別用AWeI和5omHI于37"C酶切2小時(shí)，回鵬化片段，與純化的親載體pET22b雙酶切產(chǎn)物用T4DNA^接酶于16。C連接過夜，連接產(chǎn)物艦熱休克法轉(zhuǎn)化用CaCl2制備的Eco/ZDH5a，涂布Amp+-LB平板，37'C培養(yǎng)16小時(shí)，挑取數(shù)個(gè)單離接種Amp+-LB培養(yǎng)液，37。C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，^^法抽MM粒，MfeI和5函/H鵬切質(zhì)粒鑒定含有預(yù)期大小的GS因和Gcil基因，并M3i專MkDNA測(cè)序公司測(cè)序結(jié)果序列正確。構(gòu)建正確的重l艦茅裸用戰(zhàn)方法再次轉(zhuǎn)^Eco//BL21(DE3訴于誘導(dǎo)^ii截短的G蛋白和GciL蛋白。實(shí)施例3:G蛋白和GciL蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分別挑取重組工程菌G/pET22b/BL21和Gcn/pET22b/BL21單菌落接種到Amp+-LB培養(yǎng)液中，37。C震蕩培養(yǎng)過夜，第二天按l%分別接種到ifl羊Amp+-LB培養(yǎng)液中，37'C震蕩培養(yǎng)至OD600約為1.0時(shí)，分別加入0.5mmolIPTG在37'C誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)。誘導(dǎo)結(jié)束后皿量樣品進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:G蛋白和Gcil蛋白的表觀M量分別是14.2KDa和14.7KDa，與理論計(jì)算值基本一致，占菌體總蛋白的相對(duì)含量分別是18.4%和19.4%。實(shí)施例4:重組工程菌G/pET22b/BL21和Gcn7pET22b/BL21的中試發(fā)酵自控發(fā)酵罐中分別發(fā)酵重組工程菌G/pET22b/BL21和Gcn/pET22b/BL21。在高密度發(fā)酵過程中，在線檢測(cè)發(fā),的DO、pH和溫度，控制DO》40。/。、pH值為7,2左右、溫度37'C，并且檢測(cè)培養(yǎng)過程中菌液的OD600、培養(yǎng)液中葡萄M量，及時(shí)對(duì)發(fā)^#行調(diào)整。發(fā)酵M、時(shí)菌液密度達(dá)到OD600約為30時(shí)，加入0.1mmol/LIPTG，鵬降至25'C誘導(dǎo)4小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，菌液OD600約為54，菌體濕重為39.20g/L，干重為6.95g^L，目標(biāo)蛋白的表達(dá)率約為18.2%，為可溶表達(dá)形式。實(shí)施例5:G蛋白和GciL蛋白的純化中試發(fā)酵獲得誘導(dǎo)鋭的重組菌液鄉(xiāng)紐離心收集菌體，溶于結(jié)合緩沖液(0.5moI/LNaCl，0.02mol/LNa2HPO4,0.01mol/L咪唑)中，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破菌，離心收集上清，鄉(xiāng)淀。選擇ChelatingSepharoseFastFlow;賺柱和0)2+進(jìn)行親和層析純化，4柳^E緩沖液(0.5mol/LNaCl,0.02mol/LNa2HPO4，0.5mol/L咪唑)目的蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)，顯示單一，，分子量為14KDa，純度為93.6%以上。實(shí)施例6:G蛋白和GciL蛋白的動(dòng)物免疫BALB/c小鼠分成6組，每組20只小鼠，采用口服、滴鼻或者注射，分別在0，1，4周進(jìn)行免疫。A組使用PBS;B組使用無(wú)毒型LT;C組j頓GciL蛋白+無(wú)毒型LT;D組使用G蛋白+無(wú)毒型LT;E組使用G蛋白；F組^fflGciL蛋白。免疫結(jié)束后，10只小鼠用ELISA檢測(cè)小鼠血清和呼吸道內(nèi)的IgG、IgA或sIgA，細(xì)胞計(jì)數(shù)小鼠血液和呼吸道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞。另10只小鼠用G蛋白或Gcil蛋白注射小鼠后退的一只腳掌，另一只腳掌注射PBS，24小時(shí)后測(cè)量2只小鼠后腿腳掌的腫脹面積，比較疫苗激發(fā)小鼠細(xì)胞免疫的能力。然后用RSVLong株攻毒，2周后麻醉處死小鼠，分離小鼠呼吸道，進(jìn)行病毒培養(yǎng)和病理切片檢測(cè)。結(jié)果表明^fflGciL蛋白+無(wú)毒型LT的D組小鼠體內(nèi)IgG、IgA、slgA顯著高于其他組(p<0.01);血液和呼TO灌洗液中的嗜酸性粒細(xì)胞與對(duì)照組A組和B組數(shù)量相近，沒有顯著差異(p〉0.05)，但顯著低于C組和E組(p<0.01);C組、D組、E組和F組都可激發(fā)小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)；Gctl蛋白+無(wú)毒型LT齢疫苗対小鼠的保護(hù)率為80%以上。因此，Gcn/LT齢疫苗可以提高小鼠的艦免疫、細(xì)胞免疫以及呼吸道的粘膜免疫，并對(duì)小鼠有很好的做效果。上述生ttf才料中，G蛋白基因序列以及引物序列可通過相關(guān)肝生物學(xué)試齊忪司合成如上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，細(xì)菌敏載體pET22b購(gòu)買于美國(guó)Novagen公司，其他試劑購(gòu)買于國(guó)內(nèi)的相關(guān)公司。本發(fā)明對(duì)于預(yù)防人類呼吸道合胞病毒的感染具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。表1不同M時(shí)間的小鼠血清中G蛋白1f^性IgG的幾何平i^i度<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1、呼吸道合胞病毒亞單位疫苗，含有截短的呼吸道合胞病毒RSV膜蛋白G。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒亞單位疫苗，其特征在于還含有無(wú)毒型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素LT佐劑。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述呼吸道合胞病毒亞單位疫苗，其特征在于截短的呼吸道合胞病毒RSV膜蛋白G包含原G蛋白上aal30230之間的,酸，并且將aal82186之間的氨基酸CAWIC(CX3C模序)替換為RSVM蛋白上的氨基酸YLEKESIYY(CTL表位)，形成Gcil蛋白，其氨基,列為MTVKTKNTTTTQIQPSKSTTKQRQNKPQNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTYLEKESIYYKRIPNKKPGKKTTTKPTKKFnKTTKKDPKPQTTKPKEWTTKPHHHHHH其對(duì)應(yīng)的基因序列為CACAAAACAACGTCAAAACAAACCACAAAACAAACCTAATAATGATTTTCACTTTGAAGTTATTTATTATAAAAGAATACCAAACAAAAAACCTGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCAAAAGGAAGTACCTACCACCAAGCCTCACCACCACCACCACCACTAA。4、根據(jù)權(quán)利要求13任一0M的呼吸道合胞病毒亞單位疫苗，其特征在于所述疫苗是將Gcil蛋白基因重組到細(xì)菌表達(dá)載體上，并在大腸桿菌中表達(dá)、帝U備。5、權(quán)利要求13任一所述的呼吸道合胞病毒亞單位疫苗，由下述方法構(gòu)建而成1)以全基因合成截短的RSVG蛋白基因序列nt288690總共303bp,以及引物gcl:5'^CnTCTTnTCCAGGTAAGTTGGATTGTTGCTGCAGATGC-3';gc2:5'-GAAAGTATTTATTATAAAAGAATACCAAACAAAAAACCTG-3';gpl:5'-GGAATTCCATATGACAGTCAAGACCAAAAACACAACAACAACCCAAATAC-3';gpl0:5'^GCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTTGGTGGTAGGTACTTC-3';其中，gpl、即10用于擴(kuò)增G蛋白基因，并引入MfeI和及wwHI酶切位點(diǎn)和6XHIS標(biāo)簽，gcl，gc2用來(lái)突變G基因中的CX3C模序，替換為CTL表位；弓l物gpl、gplO進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物即為截短的G基因；以G基因?yàn)槟０?，分別用引物gpl/gcl以及gc2/gpl0進(jìn)行擴(kuò)增，獲得片段gll和g210，這兩個(gè)片段純化后適量混和為模板，再用引物gpl/gplO進(jìn)行擴(kuò)增，獲得突變的GcTL基因；(2)重組^iit;體Gcn/pET22b的構(gòu)建G基因和GciL基因純化后分別用MfeI和BflmHI于37'C酶切2小時(shí)，回收純化片段，與純化的^ii^體pET22b雙酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶于16。C連接過夜，連接產(chǎn)物351熱休克法轉(zhuǎn)化用€3(:12制備的￡0>//0115(1，涂布Amp+-LB平板，37'C培養(yǎng)16小時(shí)，挑取數(shù)個(gè)單麟接種Amp+-LB培養(yǎng)液，37'C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，^法抽粒，Mfel和^m/n雙酶切質(zhì)粒，構(gòu)建重M豐採(cǎi)用戰(zhàn)方法再次轉(zhuǎn)化五.co/!'BL21(DE3訴于誘導(dǎo)^iiGciL蛋白。6、根據(jù)權(quán)利要求13任一所述的呼吸道合胞病毒亞單位疫苗制備方'法1)以全基因合成截短的RSVG蛋白基因序列nt288690總共303bp，以及弓嫩gcl:5'-CnTCTTnTCCAGGTAAGTTGGATTGTTGCTGCAGATGC-3';gc2:5'-GAAAGTATTTATTATAAAAGAATACCAAACAAAAAACCTG-3';gpl:5'^GGAATTCCATATGACAGTCAAGACCAAAAACACAACAACAACCCAAATAC-3';gpl0:5'^GCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTTGGTGGTAGGTACTTC-3';其中，gpl、gp10用于擴(kuò)增G蛋白基因，并引入MfeI和及卵HI酶切位點(diǎn)和6XHISt碟，gcl，gc2用來(lái)突變G基因中的CX3C樹字，替換為CTL表位；引物gpl、gplO進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物即為截短的G基因；以G基因?yàn)槲ⅲ謩e用引物gpl/gcl以及gc2/gpl0進(jìn)行擴(kuò)增，獲得片段gll和g210，這兩個(gè)片段純化后適量混和為模板，再用引物gpl/gplO進(jìn)行擴(kuò)增，獲得突變的GciL基因；(2)重組表]!i^體Gcn/pET22b的構(gòu)建G基因和GciL基因純化后分別用MfeI和及卵HI于37'C酶切2小時(shí)，回收純化片段，與純化的^ii載體pET22b雙酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶于16。C連接過夜，連接產(chǎn)物皿熱休克法轉(zhuǎn)化用€3(:12制備的￡<:0//01150，涂布Amp+-LB平板，37'C培養(yǎng)16小時(shí)，挑取數(shù)個(gè)單離接種Amp+-LB培養(yǎng)液，37'C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，麟鵬抽頗粒，Mfel和及卵/n雙酶切質(zhì)粒，構(gòu)自會(huì)，粒采用±^方法再次轉(zhuǎn)化￡//8121(0￡3)用于誘導(dǎo),GciL蛋白；(3)GcTL蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分另跟^取重組工程菌G/pET22b/BL21和Gcn7pET22b/BL21單菌落接種到Amp+-LB培養(yǎng)液中，37'C震蕩培養(yǎng)過夜，第二天按1%分別接種到飾羊Amp+-LB培養(yǎng)液中，37'C震蕩培養(yǎng)至OD600約為1.0時(shí)，分別加入0.5mmolIPTG在37'C誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，誘導(dǎo)結(jié)束后皿量樣品進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot進(jìn)行鑒定；(4)重組工程菌Gcn/pET22b/BL21的中試發(fā)酵控制DO》40。/。、pH值為7,2左右、37°C，發(fā)酵8小時(shí)菌液密度達(dá)到OD600約為30時(shí)，加入0.1mmol/LIPTG，離降至25。C誘導(dǎo)4小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，菌液OD600約為54，菌體濕重為39.20g/L，干重為6.95g/L，目標(biāo)蛋白的表達(dá)率約為18.2%，為可溶表達(dá)形式；(5)GciL蛋白的純化中試發(fā)酵獲得誘導(dǎo)泰&的重組菌液^1離心收集菌體，溶于結(jié)^M沖液(0.5mol/LNaCl,0.02mol/LNa2HPC^0.01inol/L咪唑)中，高壓破菌，離心收牡清，鄉(xiāng)淀，選擇ChelatingSepharoseFastFlow鵬柱和0)2+進(jìn)《豫和層析純化，使用洗脫緩沖液(0.5mol/LNaCl,0.02mol/LNa2HPO4,0.5mol/L咪唑)洗脫目的蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)；(6)GciL蛋白的動(dòng)物免疫^fflGciL蛋白加無(wú)毒型LT佐劑。7、呼,合胞病毒亞單位疫,增強(qiáng)粘膜免疫、M免疫和細(xì)胞免疫功能的RSV疫苗中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種呼吸道合胞病毒疫苗、制備方法和應(yīng)用，更具體地說(shuō)是應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)重組呼吸道合胞病毒G蛋白及突變G蛋白，并與無(wú)毒型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素制備疫苗，用于人體或動(dòng)物預(yù)防接種，抵抗呼吸道合胞病毒的感染，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。其特征是所述呼吸道合胞病毒亞單位疫苗，含有截短的呼吸道合胞病毒RSV膜蛋白G。進(jìn)一步還含有無(wú)毒型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素LT佐劑。疫苗是截短的呼吸道合胞病毒RSV膜蛋白G包含原G蛋白上aa130～230之間的氨基酸，并且將aa182～186之間的氨基酸CAWIC(CX3C模序)替換為RSVM蛋白上的氨基酸YLEKESIYY(CTL表位)，形成G_CIL蛋白。本發(fā)明對(duì)于預(yù)防人類呼吸道合胞病毒的感染具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。文檔編號(hào)A61P37/00GK101264323SQ20071006647公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2007年12月19日優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日發(fā)明者井申榮,季秀玲,光李,林連兵,魏云林申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)