專利名稱：兩種乳桿菌株及其用于制備通便生態(tài)口服液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兩種乳桿菌株及其在制備保健食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
便秘是一種常見的臨床癥狀，對人體的危害很大，會引起頭痛、肩膀酸痛、肌膚粗糙等衰老、患病癥狀。目前治療便秘的方法主要是用瀉藥，通過刺激小腸而產(chǎn)生腹瀉，但這樣往往會引起脫水，影響腸道的正常生理平衡，因而尋求一種能夠潤腸通便，無毒無害，可以長期食用的保健食品對便秘患者無疑具有重要的意義。
近些年來，利用微生物技術(shù)研制益生菌類保健食品風(fēng)靡了全世界。很多研究已表明，益生菌具有提高腸道機(jī)能，改善人體胃腸功能，維持腸道菌群平衡的作用。如何選育優(yōu)質(zhì)益生菌菌株并將其應(yīng)用于開發(fā)具有通便功能的保健食品是目前研究的熱點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有潤腸通便作用的益生菌保健食品。為此，本發(fā)明公開了兩種經(jīng)選育得到的乳桿菌株以及將它們用于制備通便生態(tài)口服液的方法。
本發(fā)明所提供的兩種乳桿菌株，分別為德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株Lactobacillusdelbrueckii subsp bulgaricus和嗜酸乳桿菌株Lactobacillus acidophilus，已于2007年1月31日保藏在位于北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號分別為CGMCC No.1936和CGMCCNo.1937。
德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus，是將保加利亞乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株1.1480(購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)經(jīng)活化后篩選得到。將該菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)觀察結(jié)果為革蘭氏染色呈陽性，細(xì)胞形態(tài)為長桿狀，形成芽孢呈陰性，過氧化氫酶呈陰性。
嗜酸乳桿菌株Lactobacillus acidophilus，是將嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株1.1854(購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)經(jīng)活化后篩選得到。將該菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)觀察結(jié)果為革蘭氏染色呈陽性，細(xì)胞形態(tài)為桿狀，形成芽孢呈陰性，過氧化氫酶呈陰性。
本發(fā)明還提供了采用上述乳桿菌株用于制備通便生態(tài)口服液的方法，包括以下步驟
(1)采用MRS培養(yǎng)基對權(quán)利要求1和權(quán)利要求2的菌株分別進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間為120h；(2)將步驟(1)中培養(yǎng)好的兩種菌種按照1∶1的比例接入菌種罐內(nèi)進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，采用營養(yǎng)瓊脂作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間為48h；(3)將步驟(2)中培養(yǎng)好的復(fù)合菌種接入大罐內(nèi)做進(jìn)一步培養(yǎng)，采用紅糖作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為72h；(4)將步驟(3)中所得液體按常規(guī)罐裝制得口服液產(chǎn)品。
所述MRS培養(yǎng)基每1000ml蒸餾水中包含如下成分蛋白胨10g 牛肉膏5g 乙酸鈉5g葡萄糖20g吐溫80 1g MgSO4·7H2O 0.58g 酵母膏3gMnSO4·H2O 0.25g 檸檬酸銨2g K2HPO42g。
所述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基每1000ml蒸餾水中包含如下成分瓊脂20g蛋白胨10g 牛肉膏10g 乙酸鈉5g葡萄糖5g 吐溫80 1g 檸檬酸銨2g酵母膏5gMnSO4·H2O 0.1g MgSO4·7H2O 0.2g K2HPO41g。
本發(fā)明通便生態(tài)口服液的制備采用復(fù)合培養(yǎng)新工藝，該工藝先進(jìn)、合理、穩(wěn)定、可靠，克服了只能將單個菌種單獨(dú)生產(chǎn)后再混合使用投資大、工藝復(fù)雜的問題。兩種菌的復(fù)合培養(yǎng)，可有效彌補(bǔ)單純嗜酸乳桿菌發(fā)酵口味差的缺點(diǎn)，同時由于存在共生關(guān)系，保加利亞乳桿菌分解蛋白產(chǎn)生的氨基酸可為嗜酸乳桿菌的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，而嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的乙酸可以促進(jìn)保加利亞乳桿菌的生長，使其產(chǎn)酸能力增強(qiáng)，縮短復(fù)合培養(yǎng)的周期。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所制通便生態(tài)口服液具有營養(yǎng)高、口味佳的特點(diǎn)，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，保質(zhì)期長。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 兩種菌種的復(fù)合培養(yǎng)先在250L菌種罐內(nèi)通活蒸汽，罐內(nèi)溫度升至121℃，消毒30min后，罐夾層通入蒸餾水降溫至50℃，再在罐內(nèi)加入瓊脂20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、乙酸鈉5g、葡萄糖5g、吐溫80 1g、檸檬酸銨2g、酵母膏5g、MnSO4·H2O 0.1g、MgSO4·7H2O 0.2g、K2HPO41g，并加水至1000ml。將罐內(nèi)溫度升至121℃，實(shí)消25min，再在夾層通入蒸餾水，當(dāng)罐內(nèi)溫度降至35℃時，按體積比1∶1的比例，接入已培養(yǎng)好的德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜酸乳桿菌菌種進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間為48h。
實(shí)施例2 復(fù)合菌種的大罐培養(yǎng)先在2000L大罐內(nèi)通活蒸汽，當(dāng)罐內(nèi)溫度升至121℃，消毒30min，罐夾層通入蒸餾水降溫至50℃時，在罐內(nèi)加入紅糖50g，加水至1000ml，再升溫至121℃消毒25min，降溫至35℃，罐內(nèi)接入實(shí)施例1中培養(yǎng)好的復(fù)合菌種50ml。接完菌種后，在28℃保溫，培養(yǎng)72h經(jīng)檢驗(yàn)合格后，待罐裝。
實(shí)施例3 通便生態(tài)口服液的通便功能試驗(yàn)為了解本發(fā)明所制備通便生態(tài)口服液的通便功能，由中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所與山東大學(xué)第二醫(yī)院合作，選擇了100名自愿受試者，隨機(jī)分為試食組和對照組，每組50名，從2005年11月開始進(jìn)行人體試食試驗(yàn)。
受試對象選擇標(biāo)準(zhǔn)為排便次數(shù)一周少于3次者；糞便硬度增加者；無器質(zhì)性便秘者；習(xí)慣性便秘者。受試口服液為每瓶100ml，人體用量為每人(以成人60kg體重計(jì))每日2次，每次40ml。
試食者服用本發(fā)明所制備通便生態(tài)口服液，對照組服用外觀和口味與通便生態(tài)口服液均相似的安慰劑。按照盲法進(jìn)行試食試驗(yàn)，服用方法為每人每日2次，每次40ml，共服用觀察2周(14天)。在試食期間，使兩組受試者盡量保持其生活方式及飲食習(xí)慣不變，觀察記錄兩組受試者的排便次數(shù)、排便狀況、糞便性狀及膳食攝入量。
統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)復(fù)合正態(tài)分布后，采用t檢驗(yàn)的方法比較試食前后各指標(biāo)的變化。對于數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布的資料，采用非參秩和檢驗(yàn)比較試食前后各指標(biāo)的變化。計(jì)數(shù)資料使用X2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果判定試食前后，試食組自身比較排便次數(shù)明顯增加，排便狀況和糞便性狀二項(xiàng)指標(biāo)中一項(xiàng)指標(biāo)評分明顯下降，差異有顯著性；試食后，試食組與對照組比較，排便次數(shù)、排便狀況和糞便性狀任一項(xiàng)明顯改善，差異有顯著性，可判定該受試樣品有通便功能。
通便生態(tài)口服液對受試者排便次數(shù)的影響用組間t檢驗(yàn)和試驗(yàn)前后自身對照t檢驗(yàn)對受試者試食前一周和試食期間平均一周的排便次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果見表1。
表1 通便生態(tài)口服液對受試者每周排便次數(shù)的影響(n，Mean±SD)
表1結(jié)果表明，兩組受試者試食前的排便次數(shù)沒有顯著差異，具有可比性。服用通便生態(tài)口服液期間，試食組排便次數(shù)與試食前相比有極顯著增加(P＜0.01)，且極顯著高于試驗(yàn)期間對照組的周平均排便次數(shù)(P＜0.01)，說明通便生態(tài)口服液可增加便秘者的排便次數(shù)。
通便生態(tài)口服液對受試者排便狀況的影響排便狀況根據(jù)排便困難程度分為四級，評分值標(biāo)準(zhǔn)如下I級(0分)排便正常；II級(1分)僅有下墜感、不適感；III級(2分)下墜感、不適感明顯，或有便頻但排便困難而量少，較少出現(xiàn)腹痛或肛門燒灼感；IV級(3分)經(jīng)常出現(xiàn)腹痛或肛門燒灼感，影響排便。
用組間t檢驗(yàn)和試驗(yàn)前后自身對照t檢驗(yàn)對受試者的平均排便狀況評分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果示于表2。
表2 通便生態(tài)口服液對受試者排便狀況評分的影響(分/次，Mean±SD)
表2結(jié)果表明，兩組受試者試食前的平均排便狀況評分沒有顯著差異，具有可比性。服用通便生態(tài)口服液期間，試食組平均排便狀況評分與試食前自身相比有極顯著降低(P＜0.01)，并且也極顯著低于對照組試食期間的平均評分(P＜0.01)，說明通便生態(tài)口服液可改善便秘者的排便狀況。
通便生態(tài)口服液對受試者糞便性狀的影響糞便狀況根據(jù)Bristol糞便性狀分類法分為三級，評分值標(biāo)準(zhǔn)如下I級(0分)像香腸或蛇，平滑且軟；像香腸，但在表面有裂痕；
軟的團(tuán)塊，有明顯的邊緣(容易排出)。
II級(1分)香腸形狀，但有團(tuán)塊；松散的塊狀，邊緣粗糙。
III級(2分)分離的硬團(tuán)，像果殼(不易排出)。
用組間t檢驗(yàn)和試驗(yàn)前后自身對照t檢驗(yàn)對受試者的平均糞便性狀評分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果示于表3。
表3 通便生態(tài)口服液對受試者糞便性狀評分的影響(分/次，Mean±SD)
表3結(jié)果表明，兩組受試者試食前的平均糞便性狀評分沒有顯著差異，具有可比性。服用通便生態(tài)口服液期間，試食組平均糞便性狀評分比試食前有了極明顯下降(P＜0.01)，且顯著低于試食期間對照組的平均評分(P＜0.05)，說明通便生態(tài)口服液可改善便秘者的糞便性狀。
從以上的人體試食試驗(yàn)結(jié)果可以看出，便秘者服用本發(fā)明所制通便生態(tài)口服液14天，試食組自身前后比較排便次數(shù)明顯增加(P＜0.01)，平均排便狀況和糞便性狀評分均明顯下降(P＜0.01)；與對照組比較，試食期間試食組排便次數(shù)明顯增加(P＜0.01)，平均排便狀況和糞便性狀評分均有明顯的改善(P＜0.01)。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范-2003年版》中的判定標(biāo)準(zhǔn)，可以認(rèn)為本發(fā)明所制通便生態(tài)口服液對便秘者有通便功能。
實(shí)施例4 通便生態(tài)口服液的穩(wěn)定性試驗(yàn)對本發(fā)明所制備的通便生態(tài)口服液做了13批次的穩(wěn)定性觀察實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下
以上數(shù)據(jù)結(jié)果表明，不同批次所生產(chǎn)的通便生態(tài)口服液，其活菌總數(shù)大約在109cfu/ml，保存期一年后活菌總數(shù)仍能維持在大約108cfu/ml，說明由本發(fā)明制備所得通便生態(tài)口服液的活菌總數(shù)高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠，保質(zhì)期可在一年以上。
權(quán)利要求
1.一種德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus，其保藏號為CGMCC No.1936。
2.一種嗜酸乳桿菌株Lactobacillus acidophilus，其保藏號為CGMCC No.1937。
3.一種制備通便生態(tài)口服液的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)采用MRS培養(yǎng)基對權(quán)利要求1和權(quán)利要求2的菌株分別進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間為120h；(2)將步驟(1)中培養(yǎng)好的兩種菌種按照體積比1∶1的比例接入菌種罐內(nèi)進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，采用營養(yǎng)瓊脂作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間為48h；(3)將步驟(2)中培養(yǎng)好的復(fù)合菌種接入大罐內(nèi)做進(jìn)一步培養(yǎng)，采用紅糖作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為72h；(4)將步驟(3)中所得液體按常規(guī)罐裝制得口服液產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備通便生態(tài)口服液的方法，其特征在于所述MRS培養(yǎng)基每1000ml蒸餾水中包含如下成分蛋白胨 10g 牛肉膏 5g乙酸鈉5g葡萄糖 20g吐溫80 1g MgSO4·7H2O 0.58g 酵母膏3gMnSO4·H2O 0.25g 檸檬酸銨 2g K2HPO42g。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備通便生態(tài)口服液的方法，其特征在于；所述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基每1000ml蒸餾水中包含如下成分瓊脂 20g 蛋白胨 10g牛肉膏10g 乙酸鈉 5g葡萄糖 5g 吐溫80 1g 檸檬酸銨 2g酵母膏 5gMnSO4·H2O 0.1g MgSO4·7H2O 0.2g K2HPO41g。
全文摘要
本發(fā)明提供兩種乳桿菌株，德氏乳桿菌保加利亞亞種CGMCC No.1936和嗜酸乳桿菌CGMCC No.1937，以及將它們用于制備通便生態(tài)口服液的方法。該方法包括如下步驟(1)采用MRS培養(yǎng)基對兩種菌株分別進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35℃，培養(yǎng)時間120h；(2)將步驟(1)中培養(yǎng)好的兩種菌種按體積比1∶1接入菌種罐內(nèi)進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，采用營養(yǎng)瓊脂作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度35℃，時間48h；(3)將步驟(2)中培養(yǎng)好的復(fù)合菌種接入大罐內(nèi)做進(jìn)一步培養(yǎng)，采用紅糖作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度28℃，時間72h；(4)將步驟(3)中所得液體按常規(guī)罐裝制得產(chǎn)品。本發(fā)明所制通便生態(tài)口服液營養(yǎng)高、口味佳，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，保質(zhì)期長。
文檔編號A61K35/66GK101050440SQ20071006465
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月22日
發(fā)明者雷振東 申請人:雷振東