專利名稱：一種犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于預(yù)防犬傳染性肝炎的DNA 疫苗pVAXl-CpG-Loop 背景技術(shù)-犬傳染性肝炎是由犬腺病毒一型(Canine adenovirus-l,CAV-l)引起的急 性敗血性疾病，目前預(yù)防以滅活苗和減毒苗為主。DNA疫苗，是近年興起的新型 疫苗，具有抗體效價(jià)維持時(shí)間長和交叉保護(hù)效果好等優(yōu)點(diǎn)。此外DNA疫苗還具有 以下突出優(yōu)點(diǎn)(1)能誘發(fā)體液及細(xì)胞全方位免疫應(yīng)答，起到預(yù)防作用；(2)免 疫保護(hù)時(shí)間長；(3)生產(chǎn)工藝簡單、成本低廉、穩(wěn)定性好且貯運(yùn)方便。 發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明提供一種預(yù)防犬傳染性肝炎的DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop，可用于預(yù) 防犬傳染性肝炎的感染。其作用機(jī)理為將犬腺病毒一型抗原基因Loop插入真 核表達(dá)載體，將其注射于肌肉組織，使其在肌細(xì)胞中表達(dá)病毒抗原，經(jīng)過抗原提 呈過程，可激活體內(nèi)的體液免疫系統(tǒng)和細(xì)胞免疫系統(tǒng)。激活的體液免疫系統(tǒng)可產(chǎn) 生特異的抗體，消除游離在血液中的病毒，預(yù)防犬肝炎病毒的入侵；犬腺病毒(Canine adenovirus, CAV)，屬于腺病毒科哺乳動(dòng)物腺病毒屬成 員，各類腺病毒具有相同的結(jié)構(gòu)，外形是無包膜的球形結(jié)構(gòu)，衣殼為二十面體立 體對(duì)稱，由252個(gè)殼粒組成，其中240個(gè)非頂角殼粒為六鄰體(hexon)，為主要 的包膜蛋白；12個(gè)頂角的殼粒稱為五鄰體(pentcm);還有三聚體蛋白的纖維。 其中五鄰體基底一端通過非共價(jià)鍵與三聚體纖維相連，另一端吸附到細(xì)胞膜上。 目前，已對(duì)六鄰體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了廣泛的研究。每個(gè)六鄰體是六鄰體蛋 白的同源三聚體，是大于900個(gè)殘基的復(fù)雜蛋白。三聚體的六鄰體分子有一個(gè)五 面體的基底和三角形的塔尖，基底包含兩個(gè)區(qū)域P1、 P2區(qū)，塔區(qū)由4個(gè)環(huán)構(gòu)成 即Loopl、 Loop2、 Lo叩3、 Loop4。 Loopl是最長、最復(fù)雜的環(huán)，自身折疊許多倍， 與周圍環(huán)境相互作用。通過一組單克隆抗體來檢測(cè)不同型的純化的六鄰體蛋白表 明，在六鄰體表面有許多的抗原決定簇在這幾個(gè)環(huán)上。對(duì)15個(gè)不同型的腺病毒 的六鄰體蛋白的序列研究表明，基底區(qū)Pl、 P2是保守的，變化區(qū)主要集中在 Loop 1 、 Loop2上。Loop 1 、 Loop2存在有7個(gè)獨(dú)特的超變區(qū)(Hypervar iab 1 e Region， HVR)，在這7個(gè)腿s中，HVRl- HVR6出現(xiàn)在Loopl中，HVR7出現(xiàn)在Loop2的塔 尖。其中HVR1、 HVR2、 HVR4、 HVR5、 HVR7中都含有中和抗原決定簇，而且抗原 決定簇至少包括兩個(gè)或兩個(gè)以上的HVRs。目前證實(shí)六鄰體蛋白可以引發(fā)極強(qiáng)的 中和反應(yīng)，中和抗原決定簇主要存在六鄰體上，而六鄰體中主要抗原決定簇集中 在Loopl區(qū)和Loop2區(qū)。本發(fā)明根據(jù)GeneBank中犬腺病毒I型和人腺病毒2型 的六鄰體蛋白基因序列及氨基酸序列，設(shè)計(jì)并合成了 Lo叩l和Loop2基因，連 接兩個(gè)基因命名為Loop,將Loop克隆到質(zhì)粒載體pVAXl-CpG，構(gòu)建疫苗 pVAXl-CpG-Loop; 合成的Loop蛋白核苷酸序列為 LooplAACTGCCTATTTAATGGATCAGGTGCCAACATTAACACTTTAGCCCAAGTGCCATTTGCGGGCGCCATT ACCGTTAATGGTCAAGCCGCAGTCACAGACAACACCTACCAGCCAGAGCCCCAGCTGGGCCCTGAAAGT TGGGTGGATGGCACCTTGGCAGACCTAGGAGATGCGTCTGGCCGCGCCCTGAAAGCATCGACCCCACGC ATGCCTTGCTACGGTTCTTATGCTCCCCCCACCAATGAAAACGGAGGTCAAGCAACTGGGGCCGTGGAA CGAAGATTCTATAAAGTGACCACCAACAATAATAATGAAGCTGATGCCCTACTATATACAGAAGATGTG AACCTCCAAACCCCAGACACCCACTTGGTGCATCAGGTGTCAGACGATCAGGTTACAGGTGTACAGGGA CTGGGGCAACAALoop2AACTATTGCTTCCCACTGAGCGGCATGGGACCATTAACTAACATGACAGCTATGAAGGTCAATMTCAAAGATTGCCCGCTGCTAACCTTATAGACACATTTGTAAATATTGGCGCCAGATGGTCACCTGATGTAATGGGCCGC本發(fā)明犬肝炎病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop的制備方法如下: 1.人工合成犬肝炎病毒Lo叩(Loopl+Loop2)蛋白編碼基因 長度860 bp
類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性b)分子類型DNAC)來源人工合成d)序列描述Lo叩蛋白編碼基因 5'-CGGGATCCATGMCTGCCTATTTAATGGATCAGGTGCCAACATTMCACTTTAGCCCAAGTGCCAT TTGCGGGCGCCATTACCGTTAATGGTCAAGCCGCAGTCACAGACAACACCTACCAGCCAGAGCCCCAGC TGGGCCCTGAAAGTTGGGTGGATGGCACCTTGGCAGACCTAGGAGATGCGTCTGGCCGCGCCCTGAAAG CATCGACCCCACGCATGCCTTGCTACGGTTCTTATGCTCCCCCCACCAATGAAAACGGAGGTCAAGCAA CTGGGGCCGTGGAACGAAGATTCTATAMGTGACCACCAACAATAATAATGMGCTGATGCCCTACTAT ATACAGAAGATGTGAACCTCCAAACCCCAGACACCCACTTGGTGCATCAGGTGTCAGACGATCAGGTTA CAGGTGTACAGGGACTGGGGCAACAACCCGGGTCCCCCGGGAACTATTGCTTCCCACTGAGCGGCATGG GACCATTAACTAACATGACAGCTATGAAGGTCAATAATCAAAACTTTCAAACGGACAACACTAACGTGG GTCCCATTCAAAAGATTGGTTTCGGAAATGTTGAGGCCATGGAGATAAATCTCMTGCTAACCTCTTTATAGCTCCTGCTAATGCAAATACCTATGCTTACATGAATGTGAGATTGCCCGCTGCTAACCTTATAGACA CATTTGTAAATATTGGCGCCAGATGGTCACCTGATGTAATGGACTCTGTTAATCCTTTTAACCACCACA GAAATGCAGGACTCCGCTACCGATCACAGCTGCTTGGCAATGGCCGCCTCGAG-3'其中，5'末端的GGATCC為BamH I酶切位點(diǎn)；CCCGGG為Sma I酶切位點(diǎn)；3' 末端CTCGAG是Xho I酶切位點(diǎn)；2.制備DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop:分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sma I， Sma I和Xho I先合成Loopl和Loop2 片段，再用BaraHI和XhoI連接Loopl和Loop2合成Loop蛋白編碼基因。Lo叩 蛋白編碼基因和真核表達(dá)載體pVAXl-CpG (pVAXl購自Invitrogen公司，序列和 物理圖譜見該公司的產(chǎn)品目錄，加CpG基序修飾)進(jìn)行雙酶切，酶切片段分別經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳純化回收。然后將上述pVAXl-CpG載體酶切片段與Lo叩基因酶
切片段按一定比例混合，通過連接酶進(jìn)行連接。然后以CaCl2法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大 腸桿菌DH5a (購自GIBLC0公司)中，在卡那霉素平板上得到轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行篩 選。篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子為重組pVAX1-CpG-Lo叩的工程菌，該工程菌可用于制 備DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop;本發(fā)明DNA疫苗是真核表達(dá)載體pVAXl-CpG與Loop蛋白編碼基因的重組質(zhì) 粒。該重組質(zhì)粒含有pUC ori質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)、卡那霉素抗性基因Kanamycin、 一個(gè)完整的真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子PCMV、犬腺病毒Loop基因。 本發(fā)明DNA疫苗制備工藝簡單，成本低廉，其可在真核細(xì)胞中表達(dá)Loop抗原并 可激活淋巴細(xì)胞；
圖1:為本發(fā)明犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Lo叩的結(jié)構(gòu)示意圖 圖2:為本發(fā)明犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop的構(gòu)建流程圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的制備方法作詳細(xì)描述。實(shí)施例1:犬腺病毒DNA疫苗pVAX卜CpG-Loop的制備DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop結(jié)構(gòu)見圖1，構(gòu)建流程見圖21.合成Loop基因DNA (結(jié)構(gòu)如前所述)，5'末端的GGATCC為BamH I酶切位 點(diǎn)；3，末端CTCGAG是Xho I酶切位點(diǎn)； 3.構(gòu)建pVAXl-CpG-Loop的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I對(duì)Lo叩基因DNA進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為200ng/pl的Loop基因DNA 5卩1; 10XM Buffer是由pH7. 5 lOOmM-150mMTris-HCl; lOOmM MgCl2; ImM-lOmM 二硫蘇糖醇；lOOmM NaCl組成；BamH I酶(10U/pl) lpl; Xho I酶(12U/pl) l卩l(xiāng);補(bǔ)H20室總體積20卩1。 37。C溫浴消化2小時(shí)。之后將消化樣品進(jìn)行1-2%低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收Loop 酶切片段。同時(shí)，用BamH I和Xho I雙酶切pVAXl- CpG載體。反應(yīng)體系為pVAXl-CpG載體2pl (200ng/卩l(xiāng)); 10XM Buffer 2pl; BaraH I酶(lOU/pl) lyil; Xho I酶(12U/pl) l口l;補(bǔ)H20至總體積20卩1。 37。C溫育消化2小時(shí)。之后將消化
樣品進(jìn)行1%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收pVAXl- CpG酶切片段；將上述pVAXl- CpG酶切片段與Loop酶切片段混合，以連接酶進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為200ng/Vl的pVAXl- CpG酶切片段0.5pl; 50ng/pl的Loop 酶切片段lpl;由600mM-660mM Tris-HCl pH7. 6; 60mM-66mM MgCl2; lOOmM 二 硫蘇糖醇；ImM ATP組成的連接Buffe lpl;補(bǔ)H20至總體積10pl。連接反應(yīng)的條件定為12°C 10小時(shí)；4. 構(gòu)建pVAXl-CpG-Loop工程菌將上述連接反應(yīng)產(chǎn)物以CaC12法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5 a中(購于大連寶生物公司)連接產(chǎn)物10卩l(xiāng)與DH5ci(1 2X109細(xì)菌/ral)感受態(tài)細(xì)胞200pl混合，冰浴放置30分鐘，42'C2分鐘，冰浴10分鐘，加入0.6ml 2YT液體培養(yǎng) 基是由18g蛋白胨/L; 10g酵母抽提物/L; 5gNaCl/L組成，37。C培養(yǎng)45分 鐘后鋪于含卡那霉素的瓊脂平板。37'C培養(yǎng)12小時(shí)后在瓊脂平板上出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。挑選轉(zhuǎn)化子接種在含100pg/ml卡那霉素的3ml 2YT培養(yǎng)基中37'C培養(yǎng)過夜，6，OOOrpm/分鐘離心收集菌體，以質(zhì)粒小量抽提試劑盒(Qiagen)提取質(zhì)粒DNA。然后用Hind III和Xho I雙酶切鑒定。反應(yīng)體系為200ng/pl的重組質(zhì)粒10XM Buffer 2pl; lOU/pl Hind III酶12U/卩l(xiāng) Xho I酶l卩l(xiāng);補(bǔ)H20至總體積20pl。 37'C溫育消化2小時(shí)。之后將消化樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見860bp的Loop片段和2. 99kb的pVAXl-CpG載體片段。說明篩選到的該 陽性轉(zhuǎn)化子為重組pVAXl-CpG-Loop的工程菌；5. 犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop的制備本發(fā)明的DNA疫苗是用上述重組工程菌株制備的。培養(yǎng)方式為液體培養(yǎng)。 采用細(xì)菌培養(yǎng)。選用2XYT培養(yǎng)基含1. 6-2%胰蛋白胨、1%酵母提取物和0. 5-1% 氯化鈉，pH7.0。培養(yǎng)溫度為37i:，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)；從擴(kuò)增后的工程菌中分離純化質(zhì)粒DNA，采用常規(guī)方法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南， 第三版，科學(xué)出版社，2002)。具體步驟如下100g濕菌中加入800mL溶液I含50-60mM葡萄糖，25-30raM Tris-Cl pH8.0， 10mM EDTA強(qiáng)烈振蕩混勻。加入新鮮配制的IL溶液II含0.2N NaOH，
1% SDS)垂直輕柔混勻，室溫5分鐘。再加入冰預(yù)冷的0. 75L溶液III含1M醋 酸鉀，7M醋酸銨pH4.8垂直輕柔混勻，冰浴5分鐘。連續(xù)流12 000轉(zhuǎn)/分鐘4 'C離心取上清。在上清中加入l. 53L異丙醇室溫10分鐘，連續(xù)流12000轉(zhuǎn)/分 鐘室溫離心留沉淀。加70%乙醇450ml漂洗過夜。10 000轉(zhuǎn)/分鐘4。C離心10 分鐘留沉淀。加1L pH7. 4的PBS溶解，加終濃度0.1% RNaseA (華美生物工程 有限公司生產(chǎn))65'C消化30分鐘。再加入等體積的PEG溶液含PEG8000 13%， 氯化鈉1.6 M，沉淀；12 000轉(zhuǎn)/分鐘4'C離心10分鐘，留沉淀。200ml PBS 溶解沉淀，加1%體積曲拉通X114混勻，冰浴5-10分鐘，37°C 30分鐘，37'C 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上層水相。最后用0. 45pm和0. 22Pm雙層濾膜加壓過濾，用PBS緩沖液稀釋至lmg / ml，即犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop， 用于肌肉注射。
權(quán)利要求
1.一種犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop，其特征在于由犬腺病毒六鄰體蛋白中和抗原決定簇改造后的編碼基因和真核表達(dá)載體構(gòu)成，改造后的Loop蛋白編碼基因的核苷酸序列如下CGGGATCCATGAACTGCCTATTTAATGGATCAGGTGCCAACATTAACACTTTAGCCCAAGTGCCATTTGCGGGCGCCATTACCGTTAATGGTCAAGCCGCAGTCACAGACAACACCTACCAGCCAGAGCCCCAGCTGGGCCCTGAAAGTTGGGTGGATGGCACCTTGGCAGACCTAGGAGATGCGTCTGGCCGCGCCCTGAAAGCATCGA CCCCACGCATGCCTTGCTACGGTTCTTATGCTCCCCCCACCAATGAAAACGGAGGTCAAGCAACTGGGGCCGTGGAACGAAGATTCTATAAAGTGACCACCAACAATAATAATGAAGCTGATGCCCTACTATATACAGAAGATGTGAACCTCCAAACCCCAGACACCCACTTGGTGCATCAGGTGTCAGACGATCAGGTTACAGGTGTACAGGGACTGGGGCAACAACCCGGGTCCCCCGGGAACTATTGCTTCCCACTGAGCGGCATGGGACCATTAACTAACATGACAGCTATGAAGGTCAATAATCAAAACTTTCAAACGGACAACACTAACGTGGGTCCCATTCAAAAGATTGGTTTCGGAAATGTTGAGGCCATGGAGATAAATCTCAATGCTAACCTCTTTAAAGGTTTTCTCTACTCCAATGTGGCCCTATACCTACCTGATGCCTATAAATACACACCTGATAACATTGTAGCTCCTGCTAATGCAAATACCTATGCTTACATGAATGTGAGATTGCCCGCTGCTAACCTTATAGACACATTTGTAAATATTGGCGCCAGATGGTCACCTGATGTAATGGACTCTGTTAATCCTTTTAACCACCACAGAAATGCAGGACTCCGCTACCGATCACAGCTGCTTGGCAATGGCCGCCTCGAG。
2. 按權(quán)利要求1所述的犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Lo叩，其特征在于所說的真 核表達(dá)載體為pVAXl-CpG 。
3. 按權(quán)利要求1所述的犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop,其特征在于所說的疫 苗制備方法①構(gòu)建pVAXl-CpG-Loop重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I對(duì)Loop基因DNA進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為 Loop基因DNA 5pl(200ng/pl);10XM Buffer是由pH7. 5 lOOmM-150mM Tris-HC1;100mMMgCl2; IraM-lOmM二硫蘇糖醇；lOOmMNaCl組成；BamH I酶(10U/pl) lpl;Xhol酶(12U/pl) lpl;補(bǔ)H20至總體積20pl。 37。C溫浴消化2小時(shí)。之后將消 化樣品進(jìn)行1-2%低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收Loop酶切片段。同時(shí)，用BamHI和Xho I雙酶切pVAXl- CpG載體。反應(yīng)體系為pVAXl- CpG載體2pl(200ng/pl); 10XM Buffer 2]jl; 10U/卩l(xiāng)的BamH I酶lpl; 12U/pl的Xho I酶lpl;補(bǔ)H2O至總體積20pl。 37。C溫育消化2小時(shí)。之后將消化樣品進(jìn)行1%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收pVAXl-CpG酶切片段；將上述pVAXl- CpG酶切片段與Loop酶切片段混合，以連接酶進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為pVAXl-CpG酶切片段0. 5pl (200ng/ial); Loop酶切片段lpl (50ng/pl);由600mM-660mM Tris-HC1 pH7. 6; 60mM-66mM MgCl2; lOOmM 二硫蘇糖醇；lmMATP組成的連接Buffe 補(bǔ)H2O至總體積10pl。連接反應(yīng)的條件定為12'C IO小時(shí)；連接反應(yīng)得到連接產(chǎn)物；② 構(gòu)建pVAXl-CpG-Lo叩工程菌將上述連接產(chǎn)物以CaCl2法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5a中，操作如下連接 產(chǎn)物IO卩I與1 2X 10 9細(xì)菌/ml的DH5 a和感受態(tài)細(xì)胞200P1混合，冰浴放置30分鐘，42t2分鐘，冰浴10分鐘，加入0.6ml由18g蛋白胨/L; 10g酵母抽 提物/ L; 5g NaCl / L組成的2YT液體培養(yǎng)基，37'C培養(yǎng)45分鐘后鋪于含卡那霉 素的瓊脂平板。37。C培養(yǎng)12小時(shí)后在瓊脂平板上出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。挑選轉(zhuǎn)化子接種在含100Pg/ml卡那霉素的3ml 2YT培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)過夜，6， 000rpm/分鐘離心收集菌體，以質(zhì)粒小量抽提試劑盒(Qiagen)提取重組質(zhì)粒DNA。然后用Hind III和Xhol雙酶切鑒定。反應(yīng)體系為重組質(zhì)粒lpl (200ng/vil); 10XM Buffer 2卩1;Hind III酶(10U/卩l(xiāng)) lpl; Xho I酶(12U/卩l(xiāng)) lpl;補(bǔ)H2O至總體積20pl。 37"C溫育消化2小時(shí)。之后將消化樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見860bp的 Lo叩片段和2.99kb的pVAXl-CpG載體片段。說明篩選到的該陽性轉(zhuǎn)化子為重組 pVAXl-CpG-Loop的工程菌；③ 犬腺病毒DNA疫苗pVAXl-CpG-Loop的制備本發(fā)明的DNA疫苗是用上述重組工程菌株制備的。培養(yǎng)方式為液體培養(yǎng)。采 用細(xì)菌培養(yǎng)。選用2XYT培養(yǎng)基含1.6-2%胰蛋白胨、1%酵母提取物和0. 5-1%氯化 鈉，pH7.0。培養(yǎng)溫度為37。C，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)； 從擴(kuò)增后的工程菌中分離純化質(zhì)粒DNA，采用常規(guī)方法具體步驟如下 100g濕菌中加入800mL溶液I含50-60mM葡萄糖，25-30mM Tris-CI pH8. 0, lOmM EDTA強(qiáng)烈振蕩混勻。加入新鮮配制的1L溶液II含0. 2N NaOH， 1% SDS 垂直輕柔混勻，室溫5分鐘。再加入冰預(yù)冷的0.75L溶液III含1M醋酸鉀，7M醋 酸銨pH4. 8垂直輕柔混勻，冰浴5分鐘。連續(xù)流12 000轉(zhuǎn)/分鐘4。C離心取上清。 在上清中加入1. 53L異丙醇室溫10分鐘，連續(xù)流12000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心留沉 淀。加70%乙醇450ml漂洗過夜。10 000轉(zhuǎn)/分鐘4'C離心10分鐘留沉淀。加1L pH7. 4的PBS溶解，加終濃度0. 1% RnaseA 65'C消化30分鐘。再加入等體積的PEG 溶液:含PEG8000 13%，氯化鈉1. 6 M，沉淀；12 000轉(zhuǎn)/分鐘 4。C離心10分鐘， 留沉淀。200ml PBS溶解沉淀，加1%體積曲拉通X114混勻，冰浴5-10分鐘，37。C 30分鐘，37°C 12 000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上層水相。最后用0. 45pm和0. 22pm雙層濾膜加壓過濾，用PBS緩沖液稀釋至lmg / ml，即得犬腺病毒DNA疫 苗pVAX1-CpG-Loop。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于預(yù)防犬傳染性肝炎的犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop。它由犬腺病毒六鄰體蛋白改造后編碼基因插入真核表達(dá)載體所構(gòu)成。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α就成pVAX1-CpG-Loop工程菌，可用于制備疫苗pVAX1-CpG-Loop。由于抗原基因Loop編碼中和抗體決定簇基因，體內(nèi)表達(dá)的抗原蛋白水平更高，從而增強(qiáng)了體液免疫，起到更好的預(yù)防犬肝炎感染的作用。本發(fā)明DNA疫苗制備工藝簡單，成本低廉，可在真核細(xì)胞中表達(dá)Loop抗原并可激活淋巴細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61P1/16GK101116750SQ20071006185
公開日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2007年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月10日
發(fā)明者王俊霞 申請(qǐng)人:河北醫(yī)科大學(xué)