嗜酸乳桿菌/糞腸球菌培養(yǎng)基、制劑及其工藝的制作方法

專利名稱：：嗜酸乳桿菌/糞腸球菌培養(yǎng)基、制劑及其工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及三聯(lián)活菌制劑及其制備方法，更具體涉及包含長(zhǎng)型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌的三聯(lián)活菌制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌是人和動(dòng)物體內(nèi)參見的正常菌群重要成員，集中粘附在下腸道粘膜，對(duì)機(jī)體發(fā)揮有益作用，能抑制外籍病原菌的入侵，其代謝產(chǎn)物提供宿主必需的維生素，參與和協(xié)助營(yíng)養(yǎng)的消化和吸收。上述細(xì)菌能激發(fā)機(jī)體的免疫功能。減少腸源性毒性的吸收。由于消化系統(tǒng)疾病或大量使用抗生素及隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)雙歧桿菌逐漸減少。為保持上述有益菌的正常水平，人們幵始研究含有這些有益菌的制劑。如中國(guó)專利CN1103584公開了三株口服液及其制法，其含有雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌。但是，該口服液穩(wěn)定性差，菌的存活率低，不宜長(zhǎng)期保存。中國(guó)專利CN1119154C公開了一種雙歧三聯(lián)活菌制劑及其制備方法。該文獻(xiàn)提出可以使用特定保護(hù)劑來(lái)提高雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌的穩(wěn)定性。雖然使用上述保護(hù)劑可在一定程度上提高雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌的穩(wěn)定性，但是進(jìn)一步提高穩(wěn)定性的效果并不十分令人滿意。另外，目前并沒有文獻(xiàn)報(bào)道改進(jìn)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌的種子液培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)提高雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌穩(wěn)定性的方法。因此，本領(lǐng)域中需一種具有較高的穩(wěn)定性新的三聯(lián)活菌制劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新的三聯(lián)活菌制劑，它具有較高的穩(wěn)定性。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備上述三聯(lián)活菌制劑的方法，所述方法能方便地制備所述三聯(lián)活菌制劑。本發(fā)明一方面提供了一種三聯(lián)活菌制劑，它包括-長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉；嗜酸乳桿菌菌粉；糞鏈球菌菌粉，所述長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉包含長(zhǎng)型雙歧桿菌和第一保護(hù)劑，所述第一保護(hù)劑包含脫脂奶粉8-50%、谷氨酸鈉0.01-10%、異乳糖8-50%、Vc-Na0.01-5%、淀粉5-30%，以所述第一保護(hù)劑的總重量計(jì)，所述嗜酸乳桿菌菌粉包含嗜酸乳桿菌菌粉包含嗜酸乳桿菌和第二保護(hù)劑，所述糞鏈球菌菌粉包含糞鏈球菌和第二保護(hù)劑，所述第二保護(hù)劑包含脫脂奶粉6-70%、谷氨酸鈉0.01-10%、異乳糖8-50%、Vc-Na0.01-5%、淀粉4-30%，以所述第二保護(hù)劑的總重量計(jì)。本發(fā)明另一方面提供了一種保護(hù)劑，所述保護(hù)劑包含包含脫脂奶粉6-70%、谷氨酸鈉0.01-10%、異乳糖8-50%、Vc-Na0.01-5%、淀粉4-30%,以所述保護(hù)劑的總重量計(jì)。本發(fā)明還提供了一種制造所述三聯(lián)活菌制劑的方法，所述方法包括(a)將長(zhǎng)型雙歧桿菌在第一種子培養(yǎng)基中接種，得到長(zhǎng)型雙歧桿菌接種產(chǎn)物；(b)將嗜酸乳桿菌在第二種子培養(yǎng)基中接種，得到嗜酸乳桿菌接種產(chǎn)物；(c)將糞鏈球菌在第二種子培養(yǎng)基中接種，得到糞鏈球菌接種產(chǎn)物；(d)將步驟(a)所得長(zhǎng)型雙歧桿菌接種產(chǎn)物置于第一發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到長(zhǎng)型雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)物；(e)將步驟(b)所得嗜酸乳桿菌接種產(chǎn)物置于第二發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到嗜酸乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物；(f)將步驟(c)所得糞鏈球菌接種產(chǎn)物置于第二發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到糞鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物；(g)混合長(zhǎng)型雙歧桿菌與第一保護(hù)劑，凍干得到長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉；(h)將嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌分別與第二保護(hù)劑混合，分別凍千得到嗜酸乳桿菌菌粉和糞鏈球菌菌粉；(i)混合上述長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉和糞鏈球菌菌粉得到三聯(lián)活菌制劑。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述第一種子培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和0.15-5重量％的礦物鹽和84.00-97.65重量％的溶劑。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述第二種子培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和65.5-98.2重量免的溶劑。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和0.15-5重量％的礦物鹽和84.00-97.65重量％的溶劑。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和65.5-98.2重量％的溶劑。本發(fā)明還提供了一種種子培養(yǎng)基，所述種子培養(yǎng)基含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和65.5-98.2重量％的溶劑。本發(fā)明又提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和65.5-98.2重量％的溶劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述三聯(lián)活菌制劑在治療便秘中的用途。本發(fā)明發(fā)酵液配制生產(chǎn)工藝使活菌收得率提高；細(xì)菌凍干時(shí)所用的保護(hù)劑，明顯提高細(xì)菌的存活率；使用該活菌凍干粉制備成的制劑，延長(zhǎng)了細(xì)菌存活期，提高制劑穩(wěn)定性。具體實(shí)施方式本發(fā)明一方面提供了一種三聯(lián)活菌制劑，它包括長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉；嗜酸乳桿菌菌粉；糞鏈球菌菌粉，所述長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉包含長(zhǎng)型雙歧桿菌和第一保護(hù)劑，所述第一保護(hù)劑包含脫脂奶粉8-50%、谷氨酸鈉0.01-10%、異乳糖8-50%、Vc-Na0.01-5%、淀粉5-30%，以所述第一保護(hù)劑的總重量計(jì)。所述嗜酸乳桿菌菌粉包含嗜酸乳桿菌菌粉包含嗜酸乳桿菌和第二保護(hù)劑，所述糞鏈球菌菌粉包含糞鏈球菌和第二保護(hù)劑，所述第二保護(hù)劑包含脫脂奶粉6-70%、谷氨酸鈉0.01-10%、異乳糖8-50%、Vc-NaO.01-5%、淀粉4-30%，以所述第二保護(hù)劑的總重量計(jì)。本發(fā)明所述的長(zhǎng)型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，它己經(jīng)公開在已授權(quán)的US6368591中，其中長(zhǎng)型雙歧桿菌的保藏號(hào)為CCTCCM98003,嗜酸乳桿菌的保藏號(hào)為CCTCCM98004,糞鏈球菌的保藏號(hào)為CCTCCM98005。長(zhǎng)型雙歧桿菌為厭氧性細(xì)菌，革蘭氏染色陽(yáng)性，著色不均勻，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛，菌體呈直形或彎曲狀，可出現(xiàn)"Y"或"V"型的分叉狀，棒狀等多多形態(tài)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述長(zhǎng)型雙歧桿菌為長(zhǎng)型雙歧桿菌(6—1)(CCTCCM98003)。嗜酸乳桿菌為兼性厭氧菌，革蘭氏染色陽(yáng)性、無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛，兩端圓的短桿球桿狀，單個(gè)或成雙排列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述嗜酸乳桿菌為嗜酸乳桿菌YIT2004(CCTCCM98004)。糞鏈球菌為兼性厭氧菌，革蘭氏染色陽(yáng)性、無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛，卵圓形，多成雙排列，也呈短鏈。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述糞鏈球菌為糞鏈球菌YIT0027(CCTCCM98005)。保護(hù)劑在本發(fā)明中，所述第一保護(hù)劑是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可以知道哪些具體的保護(hù)劑可用于本發(fā)明中，例如參見CN1119154C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述第一保護(hù)劑包含脫脂奶粉8-50%、谷氨酸鈉0.01-10%、異乳糖8-50%、Vc-Na0.01-5%、、淀粉、5-30%,以所述第一保護(hù)劑的總重量計(jì)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述脫脂奶粉的含量為10-40%、較好為15-35%、更好為20-30%、最好為22-28%，以所述第一保護(hù)劑的總重量計(jì)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述谷氨酸鈉的含量為0.1-8%、較好為0.5-5%、更好為1-3%、最好為1.5-2.5%，以所述第一保護(hù)劑的總重量計(jì)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述異乳糖的含量為10-45%、較好為15-35%、更好為20-30%、最好為22-25%，以所述第一保護(hù)劑的總重量計(jì)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述Vc-Na的含量為0.1-4%、較好為0.5-3%、更好為1-2.5%、最好為1.5-2%，以所述第一保護(hù)劑的總重量計(jì)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述淀粉的含量為8-25%、較好為10-20%、更好為12-18%、最好為13-17%，以所述第一保護(hù)劑的總重量計(jì)。在本發(fā)明中，所述第二保護(hù)劑包含脫脂奶粉6-70%、谷氨酸鈉0.01-10%、異乳糖8-50%、Vc-Na0.01-5%、淀教、4-30%，以所述第二保護(hù)劑的總重量計(jì)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述脫脂奶粉的含量為10-60%、較好為20-50%、更好為30-40%、最好為33-37%，以所述第二保護(hù)劑的總重量計(jì)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述谷氨酸鈉的含量為0.1-8%、較好為0.5-5%、更好為1-3%、最好為1.5-2.5%，以所述第二保護(hù)劑的總重量計(jì)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述異乳糖的含量為10-45%、較好為15-35%、更好為20-30%、最好為22-25%,以所述第一保護(hù)劑的總重量計(jì)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述Vc-Na的含量為0.1-4%、較好為0.5-3%、更好為1-2.5%、最好為1.5-2%，以所述第二保護(hù)劑的總重量計(jì)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述淀粉的含量為5-25%、較好為10-20%、更好為12-18%、最好為13-17%，以所述第二保護(hù)劑的總重量計(jì)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述第二保護(hù)劑由下列物質(zhì)組成脫脂奶粉谷氨酸鈉異乳糖Vc-Na淀粉2重量份0.5重量份2.5重量份0.2重量份1重量份在本發(fā)明中，所述脫脂奶粉是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可以直接得到哪些脫脂奶粉可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述脫脂奶粉選自市售脫脂奶粉。在本發(fā)明中，所述谷氨酸鈉是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可以直接得到哪些谷氨酸鈉可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的-一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述谷氨酸鈉選自市售谷氨酸鈉。在本發(fā)明中，所述異乳糖是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可以直接得到哪些異乳糖可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述異乳糖選自市售異乳糖。在本發(fā)明中，所述VcNa是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可以直接得到哪些VcNa可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述VcNa選自市售VcNa。在本發(fā)明中，所述淀粉是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可以直接得到哪些淀粉可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述淀粉選自市售淀粉。制造三聯(lián)活菌制劑的方法本發(fā)明另--方面提供了一種制造上述三聯(lián)活菌制劑的方法，所述方法包括(a)將長(zhǎng)型雙歧桿菌在第一種子培養(yǎng)基中接種，得到長(zhǎng)型雙歧桿菌接種產(chǎn)物；(b)將嗜酸乳桿菌在第二種子培養(yǎng)基中接種，得到嗜酸乳桿菌接種產(chǎn)物；(c)將糞鏈球菌在第二種子培養(yǎng)基中接種，得到糞鏈球菌接種產(chǎn)物；(d)將步驟(a)所得長(zhǎng)型雙歧桿菌接種產(chǎn)物置于第一發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到長(zhǎng)型雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)物；(e)將步驟(b)所得嗜酸乳桿菌接種產(chǎn)物置于第二發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到嗜酸乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物；(f)將步驟(c)所得糞鏈球菌接種產(chǎn)物置于第二發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到糞鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物；(g)混合長(zhǎng)型雙歧桿菌與第一保護(hù)劑，凍干得到長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉；(h)將嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌分別與第二保護(hù)劑混合，分別凍干得到嗜酸乳桿菌菌粉和糞鏈球菌菌粉；(i)混合上述長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉和糞鏈球菌菌粉得到三聯(lián)活菌制劑。在上述步驟(a)中，所述接種長(zhǎng)型雙歧桿菌的方法是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可直接知道怎樣對(duì)所述長(zhǎng)型雙歧桿菌進(jìn)行接種。具體的接種方法可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述接種方法包括火焰接種法，即用鑷子夾住乙醇棉花，點(diǎn)燃后，在種子罐接種頭上下燃燒，火焰消毒。然后旋開種子罐接種頭蓋，在火焰下快速將裝有種子接種瓶的橡皮管插入接種頭上。緩慢打開接種口閥門，將種子倒入罐內(nèi)。在上述步驟(b)中，接種所述嗜酸乳桿菌的方法是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可直接知道怎樣對(duì)所述嗜酸乳桿菌進(jìn)行接種。具體的接種方法可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述接種方法包括火焰接種法，即用鑷子夾住乙醇棉花，點(diǎn)燃后，在種子罐接種頭上下燃燒，火焰消毒。旋開種子罐接種頭蓋，在火焰下快速將裝有種子接種瓶的橡皮管插入接種頭上。緩慢打開接種口閥門，將種子倒入罐內(nèi)。在上述步驟(c)中，接種所述糞鏈球菌的方法是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可直接知道怎樣對(duì)所述糞鏈球菌進(jìn)行接種。具體的接種方法可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述接種方法包括火焰接種法，即用鑷子夾住乙醇棉花，點(diǎn)燃后，在種子罐接種頭上下燃燒，火焰消毒。旋開種子罐接種頭蓋，在火焰下快速將裝有種子接種瓶的橡皮管插入接種頭上。緩慢打開接種口閥門，將種子倒入罐內(nèi)。在上述步驟(d)中，發(fā)酵長(zhǎng)型雙歧桿菌接種產(chǎn)物的方法是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可知道怎樣對(duì)長(zhǎng)型雙歧桿菌接種產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵。具體的發(fā)酵方法可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述發(fā)酵方法包括液態(tài)培養(yǎng)方法(即所用培養(yǎng)基是一種或多種水溶液如蛋白胨水、營(yíng)養(yǎng)肉湯等)、固態(tài)培養(yǎng)方法(培養(yǎng)基是含有固態(tài)物如瓊脂、明膠等的培養(yǎng)基，呈凝固狀或者半凝固狀)。在上述步驟(e)中，發(fā)酵嗜酸乳桿菌接種產(chǎn)物的方法是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可知道怎樣對(duì)嗜酸乳桿菌接種產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵。具體的發(fā)酵方法可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述發(fā)酵方法包括液態(tài)培養(yǎng)方法(培養(yǎng)基是一種或多種水溶液如蛋白胨水、營(yíng)養(yǎng)肉湯等)、固態(tài)培養(yǎng)方法(培養(yǎng)基是含有不同濃度固態(tài)物如瓊脂、明膠等的培養(yǎng)基，呈凝固狀或者半凝固狀)。在上述步驟(f)中，發(fā)酵糞鏈球菌接種產(chǎn)物的方法是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可知道怎樣對(duì)糞鏈球菌接種產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵。具體的發(fā)酵方法可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述發(fā)酵方法包括液態(tài)培養(yǎng)方法(培養(yǎng)基是一種或多種水溶液如蛋白胨水、營(yíng)養(yǎng)肉湯等)、固態(tài)培養(yǎng)方法(培養(yǎng)基是含有不同濃度固態(tài)物如瓊脂、明膠等的培養(yǎng)基，呈凝固狀或者半凝固狀)。在上述步驟(g)和(h)中，所述凍干方法是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以知道進(jìn)行凍干的具體方法。具體的凍干方法可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述凍干方法包括低溫冷凍干燥法，所述冷凍干燥是指通過(guò)升華從凍結(jié)的生物產(chǎn)品中去掉水份或其他溶劑的過(guò)程。升華指的是溶劑，比如水，像干冰一樣，不經(jīng)過(guò)液態(tài)，從固態(tài)直接變?yōu)闅鈶B(tài)的過(guò)程。第一種子培養(yǎng)棊在上述步驟(a)中，所述第一種子培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可直接得到哪些種子培養(yǎng)基可用于接種長(zhǎng)型雙歧桿菌。具體的第一種子培養(yǎng)基可參見《長(zhǎng)雙歧桿菌增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化》(《食品工業(yè)科技》2004年第04期)。但是，為了得到更加穩(wěn)定的長(zhǎng)型雙歧桿菌，優(yōu)選使用特定的種子培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述第一種子培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和0.15-5重量％的礦物鹽和84.00-97.65重量％的溶劑。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述第一種子培養(yǎng)基包含如下組分<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>述氮源是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可直接知道哪些具體氮源可用于本發(fā)明中。具體氮源的例子可參見CN1119154C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例子中，所述氮源選自脫脂奶粉、蛋白胨、胰胨、銨鹽中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述氮源選自脫脂奶粉、硫酸銨中的一種或兩種。通常，以所述第一種子培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述氮源的含量為1.1-6.5重量％，較好為1.5-5.5重量％，更好為2.0-5.0重量％，最好為3.0-4.0重量％。在所述第一種子培養(yǎng)基中，所述碳源是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些碳源可用于本發(fā)明中。具體碳源的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述碳源選自葡萄糖、乳糖、異乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖、麥芽糖中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，所述碳源選自葡萄糖、異乳糖中的一種或兩種。通常，以所述第一種子培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述碳源的含量為0.8-2.8重量％，較好為1.0-2.5重量%，更好為1.5-2.0重量％。在所述第一種子培養(yǎng)基中，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可用于本發(fā)明中。具體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是酵母粉。通常，以所述第一種子培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量為0.6-1.5重量％，較好為0.7-1.2重量％，更好為0.8-1.0重量％。在所述第一種子培養(yǎng)基中，所述礦物鹽(礦物質(zhì))是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些礦物鹽可用于本發(fā)明中。具體的礦物鹽的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述礦物鹽選自磷酸鹽中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述礦物鹽選自磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀中的一種或多種。通常，以所述第一種子培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述礦物鹽的含量為0.15-5重量％，較好為0.5-4.5重量％，更好為1.0-3.0%，最好為1.5-2.5重量％。在所述第一種子培養(yǎng)基中，所述溶劑是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些溶劑可用于本發(fā)明中。具體溶劑的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述溶劑是生物學(xué)培養(yǎng)基中常用的溶劑，例如水(純水)等。第二種子培養(yǎng)基在上述步驟(b)和(C)中，所述第二種子培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可直接得到哪些種子培養(yǎng)基可用于接種嗜酸乳桿菌。具體的第二種子培養(yǎng)基可參見《嗜酸乳桿菌增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化》(《食品工業(yè)科技》2002年第06期)和《嗜酸乳桿菌、糞鏈球菌保健酸奶發(fā)酵劑的研究》(安徽農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)2000年第01期)但是，為了得到更加穩(wěn)定的嗜酸乳桿菌，優(yōu)選使用特定的第二種子培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述第二種子培養(yǎng)基含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和65.5-98.2重量免的溶劑。所述第二種子培養(yǎng)基包含<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>水溶劑余量在所述第二種子培養(yǎng)基中，所述氮源是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可直接知道哪些具體氮源可用于本發(fā)明中。具體氮源的例子可參見CN1119154C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例子中，所述氮源選自脫脂奶粉、蛋白胨、胰胨、銨鹽中的一種或多種。在本發(fā)明的另-一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述氮源選自胰胨、蛋白胨中的一種或兩種。通常，以所述第二子培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述氮源的含量為1.1-6.5重量％，較好為1.5-5.5重量％，更好為2.0-5.0重量％，最好為3.0-4.0重量％。在所述第二種子培養(yǎng)基中，所述碳源是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些碳源可用于本發(fā)明中。具體碳源的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述碳源選自葡萄糖、乳糖、異乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖、麥芽糖中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，所述碳源選自葡萄糖、乳糖中的一種或兩種。通常，以所述第二子培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述碳源的含量為0.5-2.8重量％，較好為1.0-2.5重量％，更好為1.5-2.0重量％。在所述第二種子培養(yǎng)基中，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可用于本發(fā)明中。具體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)選自西紅柿、泡菜汁、酵母粉中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)選自西紅柿、酵母粉中的-種或多種。通常，以所述第二種子培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量為0.5-25重量％，較好為5-20重量％，更好為10-15重量％。在所述第二種子培養(yǎng)基中，所述溶劑是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些溶劑可用于本發(fā)明中。具體溶劑的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述溶劑是生物學(xué)培養(yǎng)基中常用的溶劑，例如水(純水)等。發(fā)酵培養(yǎng)棊在上述步驟(d)中，所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可知道哪些發(fā)酵培養(yǎng)基可用于發(fā)酵長(zhǎng)型雙歧桿菌。具體的發(fā)酵培養(yǎng)基可參見CN1119145C。但是，為了得到更加穩(wěn)定的長(zhǎng)型雙歧桿菌，優(yōu)選使用特定的第一發(fā)酵培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和0.15-5重量％的礦物鹽和84.00-97.65重量9fc的溶劑。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基包含<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述氮源是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可直接知道哪些具體氮源可用于本發(fā)明中。具體氮源的例子可參見CN1119154C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例子中，所述氮源選自脫脂奶粉、蛋白胨、胰胨、銨鹽中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述氮源選自脫脂奶粉、硫酸銨中的一種或兩種。通常，以所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述氮源的含量為1.1-6.5重量％，較好為1.5-5.5重量％，更好為2.0-5.0重量％，最好為3.0-4.0重量％。在所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述碳源是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些碳源可用于本發(fā)明中。具體碳源的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述碳源選自葡萄糖、乳糖、異乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖、麥芽糖中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，所述碳源選自葡萄糖、異乳糖中的一種或兩種。通常，以所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述碳源的含量為0.8-2.8重量％，較好為1.0-2.5重量%，更好為1.5-2.0重量％。在所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可用于本發(fā)明中。具體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是酵母粉。通常，以所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量為0.6-1.5重量％，較好為0.7-1.2重量％，更好為0.8-1.0重量％。在所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述礦物鹽(礦物質(zhì))是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些礦物鹽可用于本發(fā)明中。具體的礦物鹽的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述礦物鹽選自磷酸鹽中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述礦物鹽選自磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀中的一種或多種。通常，以所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述礦物鹽的含量為0.15-5重量％，較好為0.5-4.5重量％，更好為1.0-3.0%，最好為1.5-2.5重量％。在所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述溶劑是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些溶劑可用于本發(fā)明中。具體溶劑的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述溶劑是生物學(xué)培養(yǎng)基中常用的溶劑，例如水(純水)等。在上述步驟(e)和(f)中，所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可知道哪些發(fā)酵培養(yǎng)基可用于本發(fā)明中發(fā)酵嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和65.5-98.2重量％的溶劑，所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基包含400kg的配制量<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述氮源是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可直接知道哪些具體氮源可用于本發(fā)明中。具體氮源的例子可參見CN1119154C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例子中，所述氮源選自脫脂奶粉、蛋白胨、胰胨、銨鹽中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述氮源選自胰胨、蛋白胨中的一種或兩種。通常，以所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述氮源的含量為1.1-6.5重量％，較好為1.5-5.5重量％，更好為2.0-5.0重量％,最好為3.0-4.0重量％。在所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述碳源是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些碳源可用于本發(fā)明中。具體碳源的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述碳源選自葡萄糖、乳糖、異乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖、麥芽糖中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，所述碳源選自葡萄糖、乳糖中的一種或兩種。通常，以所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述碳源的含量為0.5-2.8重量。％，較好為1.0-2.5重量％，更好為1.5-2.0重量％。在所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可用于本發(fā)明中。具體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)選自西紅柿、泡菜汁、酵母粉中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)選自西紅柿、酵母粉中的一種或多種。通常，以所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量計(jì)，所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量為0.5-25重量％，較好為5-20重量％，更好為10-15重量％。在所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述溶劑是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)可以直接知道哪些溶劑可用于本發(fā)明中。具體溶劑的例子可參見CN1119145C。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述溶劑是生物學(xué)培養(yǎng)基中常用的溶劑，例如水(純水)等。在上述步驟(g)-(h)中所述的第一保護(hù)劑和第二保護(hù)劑的定義如上述。雄所述三聯(lián)活菌制劑可制成各種合適的劑型，例如口服液、片劑、膠囊、口崩片等等。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述劑型為膠囊。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述劑型為片劑。在本發(fā)明中，所述三聯(lián)活菌制劑可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法制成各種劑型，例如可根據(jù)CN1119154C所述方法制成片劑、膠囊、顆粒劑等等。例如1.膠囊制造方法原輔料預(yù)處理、烘粉、原輔料混合過(guò)篩、膠囊填充、裝瓶、裝箱；2.顆粒制造方法原輔料預(yù)處理、制粒、烘粉、原輔料混合過(guò)篩、散劑填充、裝泡罩、裝單中盒、裝箱；3.片劑制造方法原輔料預(yù)處理、制粒、烘粉、原輔料混合過(guò)篩、壓片、內(nèi)包裝、裝盒、裝箱實(shí)施例西紅柿汁的制備準(zhǔn)確稱取果色艷麗，果皮光亮、肉質(zhì)厚、無(wú)柄、無(wú)斑點(diǎn)、無(wú)裂痕的西紅柿(可根據(jù)實(shí)際需要量決定)。將上述經(jīng)過(guò)初步篩選后的西紅柿放入水池中洗干凈后放置于干凈的筐中。將洗凈的西紅柿依次放入粉碎機(jī)中粉碎后倒入加熱滅菌鍋中滅菌。加熱滅菌后的西紅柿汁離心后即制備成西紅柿汁。實(shí)施例1:制備接種長(zhǎng)型雙歧桿菌的種子培養(yǎng)基用500ml的純水溶解下表1所示數(shù)量的葡萄糖(購(gòu)自河北圣雪葡萄糖有限公司)、酵母粉(德國(guó)MERCKKGAA.)、硫酸銨(江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司，AR級(jí))、磷酸二氫鉀(汕頭金砂化工廠有限公司，AR級(jí))、磷酸氫二鉀(訕頭金砂化工廠有限公司，AR級(jí))和異乳糖(意大利INALCOS.P.A.)，得到溶液。并用1500ml純水將下表1所示數(shù)量的脫脂奶粉(新西蘭FONTERRALTD.)用勻漿機(jī)(上海標(biāo)本模型廠，DS-1)打勻，得到混懸液。將上述溶液和混懸液經(jīng)過(guò)膠體磨(溫州鹿城乳化機(jī)械公司，JM-L80)研磨均勻后放至種子瓶中，然后用飲用水加至4000g配制成長(zhǎng)型雙歧桿菌的種子培養(yǎng)基，再加入少許稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。封好上述種子瓶口，并將所述種子瓶在消毒鍋中于121"C消毒10-15分鐘。表l4000g的配制量組分處方1處方2處方3處方4處方5脫脂奶粉44g44g196g260g260g葡萄糖12g12g58g80g80g酵母粉24g54g54g54g60g硫酸銨3g55g55g55g100g磷酸二氫鉀lg20g12g12g20g磷酸氫二鉀2g80g43g2g80g異乳糖8g40g32g8g40g實(shí)施例2:制備接種嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌的種子培養(yǎng)基用500ml的純水溶解下表2所示數(shù)量的葡萄糖(河北圣雪葡萄糖有限公司)、酵母粉(德國(guó)MERCKKGAA.)、乳糖(上海申美醫(yī)藥開發(fā)科技有限公司)、西紅柿汁(上海浦東新區(qū)金楊街道鑫鑫副食品經(jīng)營(yíng)部)，得到溶液。并用1500ml純水將下表2所示數(shù)量的胰胨(德國(guó)MERCKKGAA.)和蛋白胨(日本制藥株式會(huì)社)用勻漿機(jī)(上海標(biāo)本模型廠，DS-1)打勻，得到混懸液。將上述溶液和混懸液經(jīng)過(guò)膠體磨研磨均勻后放至種子瓶中，然后用飲用水加至4000g配制成長(zhǎng)型雙歧桿菌的種子培養(yǎng)基，再加入少許稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。封好上述種子瓶口，并將所述種子瓶在消毒鍋中于12rC消毒10-15分鐘。19<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例3:制備長(zhǎng)型雙歧桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基將下表3所示除碳酸鈣以外的組分倒入不銹鋼桶中，再將30千克飲用水倒入不銹鋼桶內(nèi)，同時(shí)用不銹鋼棒攪拌，得到培養(yǎng)基的混懸液。將所得混懸液倒入膠體磨中碾磨均勻。將碾磨均勻的混懸液倒入裝有攪拌機(jī)的發(fā)酵罐中，用水補(bǔ)充至400kg。開啟發(fā)酵罐攪拌機(jī)，同時(shí)用NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，再加入下表3所示的加碳酸鈣，同時(shí)用水加至400kg，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。將所述發(fā)酵培養(yǎng)基于121°C進(jìn)行10-15分鐘的消毒。表3400kg的配制量<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)ffi例4:制備嗜酸乳桿菌和/或糞腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基將下表4所示除西紅柿汁以外的組分倒入不銹鋼桶中，再將30千克飲用水倒入不銹鋼桶內(nèi)，同時(shí)用不銹鋼棒攪拌，得到培養(yǎng)基的混懸液。將所得懸浮液倒入膠體磨中碾磨均勻。將碾磨均勻的懸浮液倒入裝有攪拌機(jī)的發(fā)酵罐中，用水補(bǔ)充至總體積為40升。開啟發(fā)酵罐攪拌機(jī)，同時(shí)用NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，再加入下表4所示的西紅柿汁，同時(shí)用水加至400kg，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。將所述發(fā)酵培養(yǎng)基于12rC進(jìn)行10-15分鐘的消毒。表4400kg的配制量組分處方1處方2處方3處方4處方5西紅柿汁1.8kg1.8kg50kg92kg92kg葡萄糖0.6kg0.6kg6kg10kg10kg酵母粉0.2kg4.3kg"kg4.3kg8kg胰胨4kg16kg16kg16kg20kg蛋白胨0.4kg6kg3."g0.4kg乳糖0.2kg2kg1.3kg0.2kg2kg實(shí)施例5:制備長(zhǎng)型雙歧桿菌菌泥將長(zhǎng)型雙歧桿菌種子(購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所)40ml分別置于裝有實(shí)施例i中所得種子培養(yǎng)基(處方1-5)的5000ml玻璃血清瓶中'于37.0土2.0。C接種，分別得到接種產(chǎn)物Al-A5。將上述接種產(chǎn)物Al-A5分別置于裝有實(shí)施例3所得發(fā)酵培養(yǎng)基(處方1-5)的600L發(fā)酵罐(張家港江南化工機(jī)械廠)中37.0±2.0°C、罐壓0.05±0.03MPa發(fā)酵，得到發(fā)酵產(chǎn)物Bl-B5。將上述發(fā)酵產(chǎn)物Bl-B5分別通入上海離心機(jī)械研究所生產(chǎn)的GQ142管式離心機(jī)的離心管進(jìn)行常溫離心。通入的發(fā)酵液體流量控制在4000~9000毫升/分鐘，離心90-150分鐘結(jié)束后取出離心管，從離心管中挖出菌泥Cl-C5放入不銹鋼桶。錢伊J6:匍腦鵬隱艦將嗜酸乳桿菌(購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所)40ml分別置于裝有實(shí)施例2中所得種子培養(yǎng)基(處方1-5)的5000ml玻璃血清瓶中37.0土2.0。C接種，分別得到接種產(chǎn)物D1—D5。將上述接種產(chǎn)物D1-D5分別置于實(shí)施例4所得發(fā)酵培養(yǎng)基(處方1-5)600L發(fā)酵罐(張家港江南化工機(jī)械廠)中37.0土2.(TC、罐壓0.05土0.03MPa發(fā)酵，得到發(fā)酵產(chǎn)物E1-E5。將上述發(fā)酵產(chǎn)物El-E5分別通入上海離心機(jī)械研究所生產(chǎn)的GQ142管式離心機(jī)的離心管進(jìn)行常溫離心。通入的發(fā)酵液體流量控制在4000~9000ml/min，離心40-80分鐘結(jié)束后取出離心管，從離心管中挖出菌泥Fl-F5放入不銹鋼桶。實(shí)施例7:制備糞鏈球菌菌泥將糞鏈球菌(購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所)40ml分別置于裝有實(shí)施例2中所得種子培養(yǎng)基(處方l-5)的5000ml玻璃血清瓶中37.0土2.(TC接種，分別得到接種產(chǎn)物G1-G5。將上述接種產(chǎn)物Fl-F5分別置于裝有實(shí)施例4所得發(fā)酵培養(yǎng)基(處方1-5)的600L發(fā)酵罐(張家港江南化工機(jī)械廠)中37.0土2.(TC、罐壓0.05土0.03MPa發(fā)酵，得到發(fā)酵產(chǎn)物H1-H5。將上述發(fā)酵產(chǎn)物Hl-H5分別通入上海離心機(jī)械研究所生產(chǎn)的GQ142管式離心機(jī)的離心管進(jìn)行常溫離心。通入的發(fā)酵液體流量控制在4000~9000ml/min,離心40~80分鐘結(jié)束后取出離心管，從離心管中挖出菌泥11-15放入不銹鋼桶。實(shí)施例8:制備長(zhǎng)型雙歧tf菌菌粉在實(shí)施例5所得菌泥Cl-C5中加入分別下表所示組成的保護(hù)劑(其中菌泥Cl-C5中分別加入處方1-處方5的保護(hù)劑)，同時(shí)用膠體磨循環(huán)研磨均勻。將所得均勻混合物放入冷凍干燥機(jī)(北京天利科技，GLZ-6)中進(jìn)行凍干。在凍千過(guò)程中，對(duì)板層進(jìn)口溫度進(jìn)行降溫預(yù)凍，使產(chǎn)品預(yù)凍到-4(TC左右。預(yù)凍后，開冷凝使冷阱降至-4(TC，然后開真空泵對(duì)箱體進(jìn)行抽空。箱體真空達(dá)到真空設(shè)定值(15pa)后，開始對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行升溫。當(dāng)產(chǎn)品顏色一致時(shí)，凍干結(jié)束，即得菌粉J1-J5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實(shí)施例9:制備嗜酸乳桿菌菌粉在實(shí)施例6所得菌泥F1-F5中加入分別下表所示組成的保護(hù)劑(其中菌泥Fl-F5中分別加入處方l-處方5的保護(hù)劑)，同時(shí)用膠體磨循環(huán)研磨均勻。將所得均勻混合物放入冷凍干燥機(jī)(北京天利科技，GLZ-6)中進(jìn)行凍干。在凍干過(guò)程中，對(duì)板層進(jìn)口溫度進(jìn)行降溫預(yù)凍，使產(chǎn)品預(yù)凍到-40。C左右。預(yù)凍后，開冷凝使冷阱降至-4(TC,然后開真空泵對(duì)箱體進(jìn)行抽空。箱體真空達(dá)到真空設(shè)定值(15pa)后，開始對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行升溫。當(dāng)產(chǎn)品顏色一致時(shí)，凍干結(jié)束，即得菌粉Kl-K5。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實(shí)施例10:制備糞鏈球菌菌粉在實(shí)施例7所得菌泥11-15中加入分別下表所示組成的保護(hù)劑(在菌泥11-15中分別加入處方l-處方5的保護(hù)劑)，同時(shí)用膠體磨循環(huán)研磨均勻。將所得均勻混合物放入冷凍千燥機(jī)(北京天利科技，GLZ-6)中進(jìn)行凍干。在凍干過(guò)程中，對(duì)板層進(jìn)口溫度進(jìn)行降溫預(yù)凍，使產(chǎn)品預(yù)凍到-4(TC左右。預(yù)凍后，開冷凝使冷阱降至-4(TC，然后開真空泵對(duì)箱體進(jìn)行抽空。箱體真空達(dá)到真空設(shè)定值U5pa)后，開始對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行升溫。當(dāng)產(chǎn)品顏色一致時(shí)，凍干結(jié)束，即得菌粉L1曙L(fēng)5。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實(shí)施例ll:制備三聯(lián)活菌膠囊按下表所示數(shù)量的組分投入到多向運(yùn)動(dòng)混合機(jī)(HDA-600，溫州市制藥設(shè)備廠)中混合30分鐘，得到均勻混合物。使用膠囊填充機(jī)(浙江富昌機(jī)械有限公司全自動(dòng)膠囊充填機(jī)，NJP-2000B)制得膠囊Ml-M5各60萬(wàn)粒，其中膠囊Mi包含長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉Ji、嗜酸乳桿菌菌粉Ki和糞鏈球菌菌粉Li，i為1到5的整數(shù)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實(shí)施例12:制備三聯(lián)活菌散劑將下表所示的組分投入多向運(yùn)動(dòng)混合機(jī)(HDA-600,溫州巿制藥設(shè)備廠)中混合30-40，得到均勻混合物。開啟散劑填充機(jī)(上海松川包裝機(jī)械廠多列包裝機(jī)，SL-8)將所述均勻混合物制成散劑N1-N5各IO萬(wàn)支，散劑Ni包含長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉Ji、嗜酸乳桿菌菌粉Ki和糞鏈球菌菌粉Li，i為l到5的整數(shù)。其中空白顆粒如下制備將下表IO所示的組分噴霧制粒后，經(jīng)10(TC烘箱干燥。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)施例13:穩(wěn)定袢試驗(yàn)將下述菌粉分別用鋁塑袋抽真空封口包藏，置于相對(duì)應(yīng)的溫度中，每月取出測(cè)菌量。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>對(duì)比例l-3根據(jù)CN1119154C的實(shí)施例1-3分別制備微生物制劑，即對(duì)比例1-3。用與實(shí)施例13相同的方法測(cè)試對(duì)比例l-3所得微生物制劑中的長(zhǎng)型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸桿菌的穩(wěn)定性，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>其中，B表示長(zhǎng)型雙歧桿菌，L表示嗜酸乳桿菌，S表示糞鏈球菌。實(shí)施例14:三聯(lián)活菌制布」的應(yīng)用使功能性便秘患者口服實(shí)施例1所制得的膠囊M1，每天三次，每次一粒，所得結(jié)果如下-1)有效性結(jié)果本研究共入組病例141例。結(jié)果顯示功能性便秘患者服用膠囊M1持續(xù)一個(gè)月后，日均排便次數(shù)較治療前(0.30，0.35)顯著增多至0.63次/日，P<0.0001，2周治療后，周Bristol分型均值顯著改善(0.61，0.63至1.76)，P〈0扁1。便秘的伴隨癥狀療效評(píng)價(jià)在治療1個(gè)月后便秘伴隨癥狀改善有效率為46.2%，在治療3個(gè)月后伴隨癥狀改善有效率為81.5%。對(duì)單個(gè)癥狀改善情況的分析顯示服用膠囊Ml持續(xù)一個(gè)月后單個(gè)癥狀積分較治療前顯著降低(P<0.05)。對(duì)便秘常見癥狀的總積分改善情況分析顯示功能性便秘患者服用膠囊Ml持續(xù)一個(gè)月后總積分較治療前顯著下降(P<0.001)。2)安全性結(jié)果無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生。實(shí)施例15:三聯(lián)活菌制劑的應(yīng)用本實(shí)施例描述了本發(fā)明三聯(lián)活菌制劑治療腹瀉的效果。A.入選病例1.成人急性腹瀉(1)輕型或者普通型急性菌痢承輕型一體溫38。C以下，臨床癥狀不明顯，腹瀉次數(shù)不超過(guò)4次-5次/日，大便稀爛，肉眼不見膿血，培養(yǎng)陽(yáng)性。*普通型一體溫38-39。C，白血球〈20000/ml，有輕度里急后重，大便5-15次/日，帶粘液或膿血，神志清醒，無(wú)嗜睡、驚厥，心血管功能良好，呼吸平穩(wěn)。(2)原因不明急性腹瀉(包括細(xì)菌性和病毒性等)起病急，有不潔飲食史，腹瀉水便>3次/日，大便外觀無(wú)膿血，鏡檢高倍視野白細(xì)胞<15個(gè)。2.成人慢性腹瀉大便>2-3次/日，大便性狀不正常，持續(xù)2-3個(gè)月以上，反復(fù)發(fā)作以及近期又犯者。3.成人便秘大便>2-3次/天，變硬干結(jié)，且有排便困難，常需依靠開塞露或潤(rùn)腸劑，癥狀持續(xù)l周以上者。4.小兒各種病因的急、慢性腹瀉(感染性或非感染性)或便秘之0+-13周歲門診或住院病兒。B.研究方法病人于治療前停用其它藥物(抗生素、激素、其它止瀉藥或潤(rùn)腸劑)，將實(shí)施例12所得的膠囊M2讓患者服用，劑量如下成人每次5粒，2-3次/日；0+-1周歲的兒童每次l粒，3次/日；l-6周歲的兒童每次2粒，3次/日；6-13周歲的兒童每次3粒，3次/日。根據(jù)卡方檢驗(yàn)和Ridit分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。C.結(jié)論1.用實(shí)施例12所得膠囊M2治療成人或兒童輕、中型的急性腹瀉和原因不明的慢性腹瀉共401例?？偗熜?7.5%。另外，膠囊M2治療急性腹瀉的效果優(yōu)于治療慢性腹瀉(二者療效相比有顯著性差異P〈0.05)。治療成人和兒童急性腹瀉的總有效率分別為92.3%和90.7%;而對(duì)慢性腹瀉的總有效率則分別為訓(xùn)％和76.3%。2.膠囊M2除了可用于治療原因不明的腹瀉外，尚對(duì)感染性腹瀉(病原包括痢疾桿菌、沙門氏菌、致病大腸菌、空腸彎曲菌、氣單胞菌及輪狀病毒等)有療效。其中401例病例中有52例治療前檢查出病原菌(細(xì)菌類)，有8例檢查出輪狀病毒，治療有52例中有50例(96.2%)轉(zhuǎn)陰，8例輪狀病毒性腸炎患者治療后全部顯效。3.膠囊M2對(duì)慢性腹瀉的療效雖不及急性腹瀉，但確有一定效果。慢性腹瀉患者試驗(yàn)前均有不同程度的服過(guò)其它藥物而無(wú)明顯效果，或長(zhǎng)期被診斷為."腸激惹綜合癥"，服用膠囊M2后80.0%的成人和76.3%的兒童患者痊愈。4.膠囊M2有調(diào)整腸道菌群的功能。從對(duì)19例成人和16例兒童腹瀉患者治療前后主要菌群的檢測(cè)結(jié)果看，治療前病人都不同程度的存在腸菌群紊亂，主要表現(xiàn)在腸桿菌需氧或兼性厭氧菌偏高，雙歧桿菌等厭氧菌偏低，治療后隨著臨床癥狀的消失上述狀況得到改善，腸菌群恢復(fù)正常。5.未發(fā)現(xiàn)服用膠囊M2后有明顯副作用。權(quán)利要求1.一種三聯(lián)活菌制劑，它包括長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉；嗜酸乳桿菌菌粉；糞鏈球菌菌粉，所述長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉包含長(zhǎng)型雙歧桿菌和第一保護(hù)劑，所述第一保護(hù)劑包含脫脂奶粉8-50％、谷氨酸鈉0.01-10％、異乳糖8-50％、Vc-Na0.01-5％、淀粉5-30％，以所述第一保護(hù)劑的總重量計(jì)，所述嗜酸乳桿菌菌粉包含嗜酸乳桿菌菌粉包含嗜酸乳桿菌和第二保護(hù)劑，所述糞鏈球菌菌粉包含糞鏈球菌和第二保護(hù)劑，所述第二保護(hù)劑包含脫脂奶粉6-70％、谷氨酸鈉0.01-10％、異乳糖8-50％、Vc-Na0.01-5％、淀粉4-30％，以所述第二保護(hù)劑的總重量計(jì)。2.—種保護(hù)劑，所述保護(hù)劑包含包含脫脂奶粉6-70%、谷氨酸鈉0.01-10%、異乳糖8-50%、Vc-Na0.01-5%、淀粉4-30%，以所述保護(hù)劑的總重量計(jì)。3.—種制造權(quán)利要求1所述三聯(lián)活菌制劑的方法，所述方法包括(a)將長(zhǎng)型雙歧桿菌在第一種子培養(yǎng)基中接種，得到長(zhǎng)型雙歧桿菌接種產(chǎn)物；(b)將嗜酸乳桿菌在第二種子培養(yǎng)基中接種，得到嗜酸乳桿菌接種產(chǎn)物；(c)將糞鏈球菌在第二種子培養(yǎng)基中接種，得到糞鏈球菌接種產(chǎn)物；(d)將步驟(a)所得長(zhǎng)型雙歧桿菌接種產(chǎn)物置于第一發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到長(zhǎng)型雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)物；(e)將步驟(b)所得嗜酸乳桿菌接種產(chǎn)物置于第二發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到嗜酸乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物；(f)將步驟(c)所得糞鏈球菌接種產(chǎn)物置于第二發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到糞鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物；(g)混合長(zhǎng)型雙歧桿菌與第一保護(hù)劑，凍干得到長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉；(h)將嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌分別與第二保護(hù)劑混合，分別凍干得到嗜酸乳桿菌菌粉和糞鏈球菌菌粉；(i)混合上述長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉和糞鏈球菌菌粉得到三聯(lián)活菌制劑。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一種子培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和0.15-5重量%的礦物鹽和84.00-97.65重量9fc的溶劑。5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二種子培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和65.5-98.2重量％的溶劑。6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一發(fā)酵培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和0.15-5重量%的礦物鹽和84.00-97.65重量％的溶劑。7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二發(fā)酵培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和65.5-98.2重量％的溶劑。8.—種種子培養(yǎng)基，所述種子培養(yǎng)基含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量%的碳源、0.5-25重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和65.5-98.2重量％的溶劑。9.一種發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和65.5-98.2重量％的溶劑。10.權(quán)利要求1所述的三聯(lián)活菌制劑在治療便秘中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了一種三聯(lián)活菌制劑，它包括長(zhǎng)型雙歧桿菌菌粉；嗜酸乳桿菌菌粉；糞鏈球菌菌粉。本發(fā)明還提供了致病上述三聯(lián)活菌制劑的方法以及所用的保護(hù)劑、發(fā)酵培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基。文檔編號(hào)A61P1/10GK101244089SQ200710037649公開日2008年8月20日申請(qǐng)日期2007年2月16日優(yōu)先權(quán)日2007年2月16日發(fā)明者亮張,王雪松,陳彬華申請(qǐng)人:信誼藥廠