專利名稱：輔酶復(fù)合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔酶復(fù)合物的制備方法。
背景技術(shù)：
輔酶復(fù)合物是由多種輔酶和生物活性物質(zhì)組成，主要含有輔酶A、輔酶I、三磷酸腺苷、還原型谷胱苷肽和核苷酸等生物活性物質(zhì)。它們大都是人體內(nèi)乙?；磻?yīng)，氧化還原反應(yīng)、轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)和能量代謝的重要酶的輔酶，對(duì)體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)、脂肪及能量代謝起著重要作用，在糖酵解、三羧酸循環(huán)，脂肪酸β-氧化、肝糖元的合成和分解、乙酰膽堿的合成、組織呼吸、能量轉(zhuǎn)移、保肝解毒、抗放射(輻射)作用等方面，均與其密切相關(guān)，其產(chǎn)品市場(chǎng)前景非常廣闊。
目前，國內(nèi)復(fù)合輔酶生產(chǎn)主要是依據(jù)中國專利200410058086.X中所述的高壓均質(zhì)破壁——活性炭提取分離——離子交換樹脂純化——超濾純化——丙酮沉淀等步驟。其缺點(diǎn)在于1.各工藝之間無法連貫的銜接，需要進(jìn)行中間處理之后才能進(jìn)入下一工序。2.工藝步驟中活性炭洗脫時(shí)所采用的堿性環(huán)境對(duì)輔酶活性有嚴(yán)重的破壞作用。3.將超濾置于離子交換樹脂純化之后，使超濾的作用效果大幅下降。4.各工藝環(huán)節(jié)繁瑣，對(duì)操作人員要求較高。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種輔酶復(fù)合物的制備方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種輔酶復(fù)合物的制備方法，其特征是該方法的步驟如下a)原材料的處理將酵母與冰水混合物按1∶1∶2～4的質(zhì)量比混合后，置于沸水中，然后在80℃～100℃溫度下保溫5～10min，迅速投入碎冰冷卻，經(jīng)離心機(jī)離心分離，取上清液，離心條件為4000rpm～6000rpm，時(shí)間為15～30min；b)超濾分離將步驟a所得上清液置于超濾器，在0.1～0.3MPa超濾壓下進(jìn)行分離純化，取濾出液；所述超濾器采用切割分子量8000～12000的超濾膜；c)柱層析純化將步驟b所得的濾出液用強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂進(jìn)行吸附，洗脫體系為0.2mol/L NaCl溶液，并用0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH到1.5～2.0，洗脫流速為150～250mL/h，并用核酸蛋白檢測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流出液OD值，收集在254nm波長下有光吸收的部分；d)濃縮將步驟c所得洗脫液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在55℃～60℃溫度下減壓濃縮至原體積的1/15～1/20；e)沉淀析出將步驟d所得濃縮液的pH值調(diào)至2～3，緩慢倒入10～20倍體積，-10℃～-20℃的丙酮溶液中，該溶液用5～8mol/L硝酸調(diào)節(jié)pH到2～3，靜置過夜，取沉淀，即得輔酶復(fù)合物。
上述的酵母為啤酒酵母、面包酵母或食用酵母；所述的強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂有717型樹脂以及711型樹脂。
同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法采用溫差破壁、減壓濃縮等成熟工藝，在取得令人滿意的產(chǎn)品得率的同時(shí)，降低了對(duì)生產(chǎn)設(shè)備的要求。其次，充分利用了現(xiàn)有設(shè)備，將超濾步驟提前，一方面代替活性炭的分離提取，減少了工藝環(huán)節(jié)，同時(shí)避免了洗脫時(shí)堿性環(huán)境對(duì)輔酶活性的破壞。另一方面，由于超濾可以將大部分分子量大、粘度高的雜質(zhì)除去，再進(jìn)入層析柱，降低了分離難度，提高了層析分離純化的效率以及層析的生產(chǎn)速度。第三，在本發(fā)明工藝中各提取純化步驟之間無須各種附加處理，可以直接進(jìn)入下一步操作，因此，可以使整個(gè)工藝做到無縫式，連續(xù)化，自動(dòng)化操作，提高了整個(gè)過程的整體性，降低了生產(chǎn)周期，簡(jiǎn)化了操作步驟。所得產(chǎn)品色澤呈淡黃色、疏松，符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)WS1-XG-010-2002。
具體實(shí)施例方式
1.將面包酵母與水、冰按1∶1∶2的比例混合后，置于1體積沸水中，90℃保溫5min，迅速投入碎冰冷卻。置離心機(jī)4800rpm離心分離30min，取上清液。
2.將上清液置于裝有切割10000分子量超濾膜的超濾器中，0.2MPa超濾壓下進(jìn)行分離純化，取濾出液。
3.將濾出液用717強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂進(jìn)行柱層析吸附純化，0.2mol/LNaCl(用0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為1.7)體系洗脫，在洗脫時(shí)采用蠕動(dòng)泵控制流速在200mL/h，核酸蛋白檢測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流出液OD值，收集在254nm波長下有光吸收的部分。
4.將洗脫液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，58℃減壓濃縮至原體積的1/20。
5.將濃縮液用8mol/L的硝酸調(diào)節(jié)pH至2.3，緩慢倒入15倍體積，-20℃的酸性丙酮(用5～8mol/L硝酸調(diào)節(jié)pH為2.3)溶液中，靜置過夜，取沉淀，即得成品。
最終得到的成品呈淡黃色粉末、疏松，得率為8％左右。其中含有輔酶A(CoA)、輔酶I(CoI)、谷胱苷肽(GSH)等主要成分外，還含有微量的腺三磷(ATP)，黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，黃素單核苷酸(FMN)，腺一磷(AMP)，腺二磷(ADP)，腺苷蛋氨酸(SAM)。輔酶A純度為1.5～3.0U/mg、輔酶I純度為0.0015～0.003mg/mg、谷胱苷肽純度為0.017～0.07mg/mg。
采用以上方法所得產(chǎn)品依據(jù)國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-XG-010-2002檢驗(yàn)結(jié)果如下
其結(jié)果符合國家標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種輔酶復(fù)合物的制備方法，其特征是該方法的步驟如下a.原材料的處理將酵母、水和冰混合物按1∶1∶2～4的質(zhì)量比混合后，置于沸水中，然后在80℃～100℃溫度下保溫5～10min，迅速投入碎冰冷卻，經(jīng)離心機(jī)離心分離，取上清液，離心條件為4000rpm～6000rpm，時(shí)間為15～30min；b.超濾分離將步驟a所得上清液置于超濾器，在0.1～0.3MPa超濾壓下進(jìn)行分離純化，取濾出液；所述超濾器采用切割分子量8000～12000的超濾膜；c.柱層析純化將步驟b所得的濾出液用強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂進(jìn)行吸附，洗脫體系為0.2mol/L的NaCl溶液，并用0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH到1.5～2.0，洗脫流速為150～250mL/h，并用核酸蛋白檢測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流出液OD值，收集在254nm波長下有光吸收的部分；d.濃縮將步驟c所得洗脫液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在55℃～60℃溫度下減壓濃縮至原體積的1/15～1/20；e.沉淀析出將步驟d所得濃縮液的pH值調(diào)至2～3，緩慢倒入10～20倍體積，-10℃～-20℃的丙酮溶液中，該丙酮溶液用5～8mol/L硝酸調(diào)節(jié)pH到2～3，靜置過夜，取沉淀，即得輔酶復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輔酶復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述的酵母為啤酒酵母、面包酵母或食用酵母；所述的強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂有717型樹脂或711型樹脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種輔酶復(fù)合物的制備方法。本發(fā)明方法采用溫差破壁、減壓濃縮等成熟工藝，經(jīng)超濾分離、柱層析純化、濃縮、沉淀析出等步驟得到輔酶復(fù)合物。本方明方法在取得令人滿意的產(chǎn)品得率的同時(shí)，降低了對(duì)生產(chǎn)設(shè)備的要求。其次，充分利用了現(xiàn)有設(shè)備，將超濾步驟提前，一方面代替活性炭的分離提取，減少了工藝環(huán)節(jié)，同時(shí)避免了洗脫時(shí)堿性環(huán)境對(duì)輔酶活性的破壞。另一方面，由于超濾可以將大部分分子量大、粘度高的雜質(zhì)除去，再進(jìn)入層析柱，降低了分離難度，提高了層析分離純化的效率以及層析的生產(chǎn)速度。第三，在本發(fā)明工藝中各提取純化步驟之間無須各種附加處理，可以直接進(jìn)入下一步操作，因此，可以使整個(gè)工藝做到無縫式，連續(xù)化，自動(dòng)化操作，提高了整個(gè)過程的整體性，降低了生產(chǎn)周期，簡(jiǎn)化了操作步驟。所得產(chǎn)品色澤呈淡黃色、疏松，符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)WS
文檔編號(hào)A61P43/00GK101023968SQ20071003742
公開日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日
發(fā)明者沈忠明, 朱俊毅, 殷建偉 申請(qǐng)人:上海大學(xué)