專利名稱：一組乙肝HBx基因的缺失突變體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一組乙肝HBx基因的缺失突變體及其在臨床診斷、治療以及預(yù)防上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)在東南亞和中國是最常見的惡性腫瘤之一，大量流行病學(xué)調(diào)查表明，長期慢性乙肝病毒感染是導(dǎo)致HCC的主要病因，感染HBV的人群患HCC的危險性是未感染者的100余倍，且HCC病人家庭內(nèi)有HBV感染的聚集性傾向，提示HBV感染與HCC的發(fā)生密切相關(guān)。
HBV是含3.2kb基因組的部分雙鏈DNA病毒，包含S、C、P和X 4個開放讀碼框，其中X基因是最小的開放讀碼框，也是功能重疊最明顯的區(qū)域。X基因位于HBV基因組第1374～1838位核苷酸之間，編碼約含154個氨基酸的多肽即X蛋白，分子量約為17kDa。在這4個開放讀碼框中，X基因常常更頻繁地整合到宿主染色體上，編碼的HBx蛋白能反式激活宿主及病毒調(diào)控基因，參與細(xì)胞調(diào)亡和受損細(xì)胞DNA剪切與修復(fù)，與HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌形成密切相關(guān)。而HBx基因在大多數(shù)肝癌組織上表達(dá)，表明HBx蛋白在調(diào)節(jié)與腫瘤相關(guān)的原癌蛋白和HCC抗凋亡方面發(fā)揮著重要作用。
目前，在一些進(jìn)展性肝病病人中發(fā)現(xiàn)了某些類型的突變HBx基因點突變，特別是K130M和V131I雙替換，在肝硬化和肝癌病人出現(xiàn)的頻率比輕型肝病更高。在HCC癌細(xì)胞中，80％以上是整合型病毒，整合的HBx基因部分缺失，使HCC癌組織中C-端截短的HBx蛋白檢出率比非肝癌組織高出許多倍。迄今為止，尚未有HBx基因缺失突變直接導(dǎo)致HCC的相關(guān)報道，也沒有HBx基因缺失突變體用于臨床診斷治療的報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一組乙肝HBx基因的缺失突變體，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述缺失突變體在乙肝病毒攜帶者及慢性乙肝病人癌變的基因檢測，以及在預(yù)防肝癌和治療HBV慢性感染的藥物制備上的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的采用巢式PCR，單鏈構(gòu)象多態(tài)分析(SSCP)和異源性雙鏈分析(HA)對63份肝細(xì)胞癌組織石臘包埋標(biāo)本HBx基因多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示31.3％的肝癌組織中HBx基因存在特征性帶形，選擇可能有突變的HBx基因進(jìn)行克隆、測序與比對。在第一輪PCR中，其中一樣本擴(kuò)增出了約250bp片段，與參考序列AY217378比對，該HBx基因在HBV核苷酸位置nt1577-1840缺失了264個核苷酸，將該HBx基因缺失突變體命名為HBx7-d264；在HBx基因具有特征性帶形的樣本中，隨機(jī)選擇4個，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板擴(kuò)增HBx基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆和測序，將所得序列與參考序列AF282917比對，發(fā)現(xiàn)其中三個樣本HBx基因全部在nt382-400位置上缺失了19核苷酸(缺失AGGTTTAAGGTCTTTGTAC)并伴隨29個相同位點突變，將該HBx基因缺失突變體命名為HBx-d382；與參考序列AF282917比對，另一樣本HBx基因在nt431-445位置上缺失了15個核苷酸(缺失CACCCGTACCATGCA)，將該HBx基因缺失突變體命名為HBx-d431。最后，對以上三個HBx基因缺失突變體進(jìn)行了裸鼠成瘤實驗。
本發(fā)明具備以下優(yōu)點(1)裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示，來源肝癌組織中的三個缺失突變體均有明顯致瘤作用。且與野生型HBx基因相比，以上三種缺失突變體促進(jìn)QSG7701細(xì)胞成瘤時間更短、腫瘤體積更大，因此，可用于乙肝病毒攜帶者及慢性乙肝病人癌變的基因檢測。
(2)根據(jù)RNA干擾(RNAi)的設(shè)計原理，提供針對HBx基因的缺失突變體的cDNA靶序列，再根據(jù)cDNA靶序列化學(xué)合成siRNA，可有效抑制HBsAg的表達(dá)，從而應(yīng)用于制備治療HBV慢性感染和預(yù)防肝癌的藥物。
以下結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
具體實施方案實施例一缺失突變體序列測定及其應(yīng)用研究1、肝癌組織總DNA提取63份肝癌組織標(biāo)本來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院普外科、傳染科門診和住院病人，病人分別來自湖南、湖北、江西等省，病人HBsAg陽性，而抗HBs、抗HCV、抗HDV三抗體均為陰性。這些肝癌組織經(jīng)外科手術(shù)后，采用北京天根生物科技有限公司的DNA提取試劑盒提取肝癌組織DNA。
2、巢式PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)和異源雙鏈分析(HA)1)巢式PCR采用巢式PCR擴(kuò)增肝癌組織中HBx基因片段，引物序列為P15′-ATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCT-3′(nt.1365-1387，正向外引物)；P25′-CACAGCTTGGAGGCTTGAACA-3′(nt.1881-1861，反向外引物)P35′-GTTCACGGTGGTCTCCAT-3′(nt.1625-1608，反向內(nèi)引物)P45′-CTCTGCACGTCGCATGGAGAC-3′(nt.1595-1615，正向內(nèi)引物)其中第一輪PCR引物為P1和P2，第二輪PCR引物為P1和P3、P4和P2。第一輪PCR反應(yīng)體系為P1和P2各0.5μl、2×Pfu MasterMix 12.5μl、模板2μl、雙蒸水9.5μl，總體積25μl。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸60秒，35個循環(huán)后，72℃延伸5秒。預(yù)期目的片段大小為517bp，將第一輪PCR產(chǎn)物用TE液1∶10稀釋后，作為第二輪PCR模板。
第二輪PCR反應(yīng)體系為P1和P3或P2和P4各0.5μl、2×Pfu MasterMix12.5μl、模板2μl、雙蒸水9.5μl，總體積25μl。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，35個循環(huán)后，72℃再延伸5分鐘。預(yù)期目的片段大小分別為261bp和267bp。
2)單鏈構(gòu)象多態(tài)性和異源雙鏈分析①聚丙烯酰胺凝膠電泳配制8％的聚丙烯酰胺凝膠25ml。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1μl與變性上樣液5μl于0.2ml Eppendorf管中混勻，98℃水浴10分鐘，立即冰浴驟冷變性，取約4μl樣品上樣用于SSCP分析；1μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與5μl溴酚藍(lán)上樣液混勻，取4μl直接用于HA分析。20℃、10mA電泳5h。
②硝酸銀染色將凝膠置方盒中，加入固定液并置水平振蕩器在室溫下振蕩，回收固定液，凝膠用雙蒸餾水漂洗3次；現(xiàn)配銀染液500ml，加入0.75ml甲醛混勻后倒入方盒中，避光水平振蕩，染色30min；棄銀染液，雙蒸水快速漂洗1次，將預(yù)冷的500ml顯影液內(nèi)加入0.75ml甲醛、100ul(10mg/ml)硫代硫酸鈉混勻后倒入方盒中，緩慢顯影至所有帶型顯現(xiàn)為此；棄顯影液，加入終止液終止顯影并固定影象5分鐘，雙蒸水漂洗凝膠2次，2分鐘/次。
③拍照在看片燈箱上拍照，然后剪一張與凝膠同樣大小的濾紙，嚴(yán)密覆蓋于凝膠，室溫下干燥保存。
3、T載體克隆和序列測定1)目的的基因擴(kuò)增根據(jù)上述單鏈構(gòu)象多態(tài)性和異源雙鏈分析的結(jié)果，挑選出有特征性變化的樣本作為研究對象，并以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，P5和P6為引物，擴(kuò)增HBx基因。引物序列為P55’-AATGCATGCATGGCTGCTAGGCTGTGCT-3’(nt1374～1394，正向引物)P65’-CCCTGCAGTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTG-3’(nt1838～1817，反向引物)。
反應(yīng)體系和循環(huán)條件同上。預(yù)期片段的大小為482bp。PCR產(chǎn)物的回收及純化具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。
2)PCR產(chǎn)物的回收及純化具體步驟參照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根生物科技有限公司)說明書進(jìn)行①P5和P6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15g/L瓊脂糖凝膠電泳后，切下單一的目的條帶放入干凈的離心管中，稱取重量。②向膠中加入3倍體積的溶膠液，50℃水浴放置10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管。③將上一步所得溶液分別加入吸附柱中，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。④向吸附柱中加入700μl漂洗液，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，倒掉收集管中廢液，將吸附柱重新放入收集管中。⑤向吸附柱中加入500μl漂洗液，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，倒掉收集管中廢液，將吸附柱重新放入收集管中，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，盡量去除漂洗液。將吸附柱置于室溫晾干。⑥將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空加入25μl在68℃水浴中預(yù)熱的洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘收集DNA溶液。⑦回收得到的DNA片段用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度和純度。
3)T載體克隆的構(gòu)建參照pGM-T平未端DNA片段加A克隆試劑盒(北京天根生物科技有限公司)說明書進(jìn)行。在0.2ml Eppendorf管中加入下列成分平末端HBx基因片段15ul，加A反應(yīng)液4ul，DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl。72℃保溫30分鐘。加A后的產(chǎn)物直接用于下面的連接反應(yīng)。
取0.2ml滅菌Eppendorf管，加入已加A的HBx基因片段3μl、T4DNA連接酶(3U/μl)1μl、10×T4DNA連接酶緩沖液1μl、pGM-T載體(50ng/μl)1μl、無菌去離子4μl、總反應(yīng)體積為10μl，置16℃恒溫箱中過夜連接。
細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法參見試劑盒說明書，具體操作步驟為①制備轉(zhuǎn)化平板。向鋪好含有氨芐青霉素(50ug/ml)的固體瓊脂平板表面加入7ul的IPTG(200mg/ml)、40μl的X-gal(20mg/ml)，使用無菌的彎頭玻璃棒將其均勻的涂開，避光置于37℃放置1小時，使溶解X-gal的二甲基甲酰胺盡量揮發(fā)干凈。②轉(zhuǎn)化取5μl連接產(chǎn)物加到100μl TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30分鐘；將Eppendorf管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴中放置2分鐘，其間不要搖動Eppendorf管；向Eppendorf管中加入250μl 37℃預(yù)熱的SOC(不含抗生素)培養(yǎng)基，37℃、180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)45分鐘；將Eppendorf管內(nèi)容物混勻，吸取100μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含氨芐青霉素(80ug/ml)的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻璃棒輕輕的將細(xì)菌均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養(yǎng)16小時。
使用藍(lán)/白斑篩選法，挑選白色菌落接種于1ml含氨芐青霉素(80ug/ml)LB培養(yǎng)基中，37℃、180轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)過夜。應(yīng)用PCR鑒定插入片段是否正確。
4)序列測定轉(zhuǎn)化的細(xì)菌經(jīng)PCR鑒定后，將陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，使用ABI PRISM 3730 DNA測序儀進(jìn)行DNA測序，并利用BLASTN和MULTALIN軟件進(jìn)行比對和分析。
在63份肝細(xì)胞癌組織中，51份樣本基因組DNA被擴(kuò)增出目的片段。在第一輪PCR中，其中一樣本擴(kuò)增出了約250bp片段，這一片段比預(yù)期517bp短。經(jīng)基因序列測定，并通過生物信息學(xué)與參考序列AY217378比對，該HBx基因在HBV核苷酸位置nt1577-1840缺失了264個核苷酸，我們命名該缺失HBx基因為HBx7-d264。
隨機(jī)選擇4個具有特征性帶形的樣本，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，在引物P5和P6作用下擴(kuò)增HBx基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆和測序，將所得序列與參考序列AF282917比對，發(fā)現(xiàn)其中3個樣本HBx基因在nt382-400位置上，缺失了19核苷酸(缺失AGGTTTAAGGTCTTTGTAC)，并伴隨29個相同位點突變。這種類型的突變未見報道，我們把這種類型的突變稱為HBx-d382。這種突變引起了HBx基因開放讀碼框的漂移，在nt1818位置上出新的中止密碼子。另一樣本HBx基因在nt431-445位置上，缺失了15個核苷酸(缺失CACCCGTACCATGCA)，導(dǎo)致了開放讀碼框的漂移，出現(xiàn)了截短的HBx蛋白，我們將這種缺失突變命名為HBx-d431。
4、BALB/c裸小鼠成瘤實驗24只SPF級4周齡雄性BALB/c裸小鼠由中科院上海實驗動物中心提供，在SPF級實驗室內(nèi)將其隨機(jī)分為6組，每組4只。A組接種pcDNA3/HBx7-d264/QSG7701細(xì)胞，B組接種pcDNA3/HBx-d382/QSG7701細(xì)胞，C組接種pcDNA3/HBx-d431/QSG7701細(xì)胞，D組接種pcDNA3/HBx(野生型)/QSG7701細(xì)胞，E組接種pcDNA3/QSG7701細(xì)胞，F(xiàn)組接種永生化QSG7701細(xì)胞。取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，用無血清DMEM制備成單細(xì)胞懸液后，以1×106個/只接種于6組裸鼠背部和或腹部皮下，觀察各組裸鼠成瘤情況。在接種后第7周無痛處死裸鼠，觀察肝脾變化，測量各瘤的大小。瘤的體積按下公式計算V＝0.523Lw2。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(X±S)，實驗各對照組與實驗組之間比較采用t檢驗，以P＜0.05確定差異有顯著意義。
在裸鼠背部或腹部皮下種植上述6組細(xì)胞后，其中A-E組裸鼠出現(xiàn)了腫瘤，腫瘤出現(xiàn)的時間分別為第2周、第2周、第2周、第5周和第6周。而QSG7701組7周內(nèi)未見到腫瘤形成。與pcDNA3/HBx(野生型)組相比，pcDNA3/HBx-d382、pcDNA3/HBx-d431和pcDNA3/HBx7-d264組成瘤時間更短、腫瘤體積更大，差異具有顯著意義；pcDNA3空白質(zhì)粒組裸鼠第六周才出現(xiàn)腫瘤，且腫瘤體積遠(yuǎn)小于A、B、C組(參見表1)。
表1各轉(zhuǎn)染組裸鼠成瘤情況
裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示，來源肝癌組織中的缺失突變體HBx-d382、HBx-d431以及HBx7-d264有明顯致瘤作用。與野生型HBx基因相比，以上三種HBx羧端缺失的突變體促進(jìn)QSG7701細(xì)胞成瘤作用更為明顯，可應(yīng)用于乙肝病毒攜帶者及慢性乙肝病人癌變的基因檢測。
5、缺失突變體在RNAi上的應(yīng)用初探我們根據(jù)RNA干擾(RNAi)的設(shè)計原理，設(shè)計了針對HBx基因的缺失突變體的cDNA靶序列，再根據(jù)cDNA靶序列化學(xué)合成siRNA，小鼠試驗結(jié)果表明siRNA能有效抑制乙肝表面抗原(HBsAg)的表達(dá)，提示這組缺失突變體可在制備治療HBV慢性感染和預(yù)防肝癌的藥物中得到應(yīng)用。
Untitled.ST25SEQUENCE LISTING<110>朱，平安<120>一組乙肝HBx基因的缺失突變體及其應(yīng)用<130>
<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>201<212>DNA<213>Hepatitis B virus<400>1atggctgcta ggctgtgctg ccaactggat cctgcgcggg acgtcctttg tctacgtccc 60gtcggcgctg aatcccgcgg acgacccgtc tcggggccgt ttggggatct accgtcccct120tctttgtctg ccgttccggc cgaccacggg gcgcacctct ctttacgcgg tctccccgtc180tgtgccttct cgtctgccgg a 201<210>2<211>446<212>DNA<213>Hepatitis B virus<400>2atggctgcta ggctgtgctg ccaactggat cctgcgcggg acgtcctttg tctacgtccc 60gtcggcgctg aatcccgcgg acgacccgtc tcggggccgt ttggggatct accgtcccct120tctttgtctg ccgttccggc cgaccacggg gcgcacctct ctttacgcgg tctccccgtc180tgtgccttct catctgccgg accgtgtgca cttcgcttca cctctgcacg tcgcatggcg240cccaccgtga acgcccgcca ggtattgccc aaggtcttac ataagaggac tcttggactc300tcagcaatgt caacgaccga ctttgaggca tacttcaaag actgtgtgtt taaagactgg360gaggagttgg gggaggagat ttaggaggct gtaggcataa attggtctgt ccaccagcac420catgcaactt tttcacctct gcctaa 446<210>3<211>450<212>DNA<213>Hepatitis B virus<400>3
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1.一組乙肝HBx基因的缺失突變體，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。
2.如權(quán)利要求1所述的一組乙肝HBx基因的缺失突變體，其特征在于SEQID NO.1的參考序列為SEQ ID NO.4。
3.如權(quán)利要求1所述的一組乙肝HBx基因的缺失突變體，其特征在于SEQID NO.2與SEQ ID NO.3的參考序列為SEQ ID NO.5。
4.如權(quán)利要求1所述的一組乙肝HBx基因的缺失突變體，其特征在于SEQID NO.1缺失的序列為SEQ ID NO.6。
5.如權(quán)利要求1所述的一組乙肝HBx基因的缺失突變體，其特征在于SEQID NO.2缺失的序列為SEQ ID NO.7。
6.如權(quán)利要求1所述的一組乙肝HBx基因的缺失突變體，其特征在于SEQID NO.3缺失的序列為SEQ ID NO.8。
7.如權(quán)利要求1所述的一組乙肝HBx基因的缺失突變體在制備對乙肝病毒攜帶者及慢性乙肝病人進(jìn)行癌變基因檢測試劑中的應(yīng)用，以及在制備預(yù)防肝癌和治療HBV慢性感染的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組乙肝HBx基因的缺失突變體，其中SEQ ID NO.1為HBx基因在HBV核苷酸位置1577－1840之間缺失了264個堿基的突變體；SEQ IDNO.2為HBx基因在核苷酸位置382－400之間缺失了19個堿基的突變體；SEQ IDNO.3為HBx基因在核苷酸位置431－445之間缺失了15個堿基的突變體。這組缺失突變體均有明顯的致瘤作用，可用于乙肝病毒攜帶者及慢性乙肝病人癌變的基因檢測，以及用于預(yù)防肝癌的藥物和治療HBV慢性感染的藥物制備。
文檔編號A61P1/16GK101058815SQ20071003467
公開日2007年10月24日 申請日期2007年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月5日
發(fā)明者朱平安, 譚德明, 陳莉, 彭忠田, 宋琳, 劉菲 申請人:朱平安