專利名稱：一種從豬膽汁中制備高純度豬去氧膽酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種利用豬膽汁(或提取膽紅素的下腳料)制備高純度豬去氧膽酸的方法。
背景技術(shù)：
豬膽汁中含膽汁酸8.5～12％，主要包括四種膽汁酸，其中豬去氧膽酸(HDCA)占總膽汁酸的40％、3α-羥基-6-氧代-5α-膽烷酸占20％、鵝去氧膽酸(CDCA)和豬膽酸(HCA)約占9％，HDCA和豬膽酸是豬膽汁的特征成分。
HDCA為降血脂藥，能抑制膽酸的形成及溶解脂肪，降低血中膽固醇和甘油三酯，適用于Ia或Ib型高血脂癥、動(dòng)脈粥樣硬化癥。對(duì)百日咳桿菌、白喉?xiàng)U菌、金黃色葡萄球菌等有一定的抑菌作用。可用作消炎藥，治療慢性支氣管炎、小兒病毒性上呼吸道炎癥等。HDCA能刺激膽汁分泌，使膽汁變稀而不增加固體量，適用于膽道炎、膽囊炎、膽石癥和其它非阻塞性膽汁郁積。HDCA能促進(jìn)腸道脂肪分解和脂溶性維生素吸收，可用于肝膽疾患引起的消化不良。HDCA還是人工牛黃配方的重要原料。
關(guān)于HDCA的提取，一般以豬膽汁或加熱提取膽紅素后的豬膽汁為原料，工業(yè)鹽酸酸化至剛果紅變藍(lán)(100L膽汁用酸約3L)，靜置12h，收集沉淀并用水洗至中性，晾干，得到豬膽汁總膽酸。
取粗制豬膽汁酸，加2倍量(W/W)氫氧化鈉，8倍量蒸餾水，加熱皂化22h，冷卻至室溫，虹吸上層淡黃色液體，棄之，沉淀用少量水使之溶解，在攪拌下用1∶1鹽酸調(diào)至剛果紅試紙變藍(lán)，，過濾，收集沉淀并用水洗至中性，晾干，即得HDCA粗品。
取粗品加6倍量丙酮和0.04倍量活性炭，加熱攪拌回流1h，放冷，過濾，合并濾液，加入30％(W/V)無水硫酸鈉脫水12h，過濾，濾液濃縮至原體積的2/5，放冷，析晶，抽濾，真空干燥，即得HDCA，熔點(diǎn)168～179℃。
或粗品加4倍量乙酸乙酯回流溶解后，加活性炭脫色(為粗品的5％)，繼續(xù)回流10min，冷卻至30～40℃抽濾；濾渣再加3倍量乙酸乙酯回流，過濾，合并濾液，加20％的無水硫酸鈉脫水，過濾后濃縮至原體積的1/2～1/3，冷卻，析出結(jié)晶，收率按晾干的粗豬膽汁酸計(jì)算約為30％，熔點(diǎn)160～170℃。
為了克服現(xiàn)有方法生產(chǎn)HDCA時(shí)，產(chǎn)品純度不高、乙酸乙酯和丙酮耗用量大等缺陷，本發(fā)明提供一種以豬膽汁或提取膽紅素的下腳料(膏狀物)為原料中生產(chǎn)高純度HDCA的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是以新鮮豬膽汁或豬膽汁提取膽紅素的下腳料(膏狀物)為原料，用堿皂化下腳料，嚴(yán)格控制皂化液的溫度和pH，乙酸乙酯萃取，活性炭脫色。將母液濃縮至適當(dāng)體積，分離沉淀得到HDCA粗品。將粗品進(jìn)行酯化，然后與苯進(jìn)行加成反應(yīng)，利用不同膽汁酸甲酯與苯加成物在苯中的不同溶解度，分離豬去氧膽酸甲酯-苯加成物。用堿分解加成物，調(diào)節(jié)pH，獲得HDCA純品。所得母液還可進(jìn)一步提取高價(jià)值的CDCA。制備方法包括以下步驟1、膽汁酸的皂化將豬膽汁提取膽紅素的下腳料(膏狀物)用水稀釋制成懸浮液，投料的重量比例為下腳料∶水＝1∶7～9，此懸浮液固形物含量約為10％～12.5％，其膽汁酸的含量等同于等體積的新鮮豬膽汁。
取新鮮豬膽汁或上述懸浮液作為初始豬膽汁，加入初始豬膽汁重量10％～15％的氫氧化鈉或氫氧化鉀，加入初始豬膽汁重量2％的消泡劑，110～135℃加熱回流16～25h，進(jìn)行皂化。
2、總膽酸的分離皂化反應(yīng)完成后，待反應(yīng)液冷卻至50℃時(shí)，在攪拌的條件下用濃硫酸或鹽酸將反應(yīng)液調(diào)至pH8。酸化液溫度保持在55±5℃，加入初始豬膽汁重量3～5％NaHSO3，攪拌15min。然后加入反應(yīng)液體積40％的乙酸乙酯或乙醚，邊攪拌邊用稀的硫酸或鹽酸繼續(xù)酸化至pH5，攪拌30min后靜置1h，虹吸取出有機(jī)層。
加入初始豬膽汁重量5～10％的活性炭，50～55℃攪拌30min，過濾，殘?jiān)猿跏钾i膽汁體積5％的乙酸乙酯洗滌，合并濾液和洗滌液。
3、HDCA粗品的分離將上述合并液減壓濃縮至乙酸乙酯或乙醚加入量的1/2～2/3，伴隨慢慢攪拌后有沉淀生成，然后置于室溫下15～20h。抽濾，以乙酸乙酯清洗濾渣，直至濾液呈黃色。將清洗過的沉淀真空干燥，得到灰白色HDCA粗品。
4、HDCA的甲酯化總膽酸溶于初始豬膽汁體積30％甲醇或乙醇中，加入適量濃硫酸、鹽酸或磷酸酯化，室溫?cái)嚢?2～36h。以NaHCO3或Na2CO3中和至pH7，混合物過濾，減壓濃縮得油狀物。
油狀物溶于初始豬膽汁體積30～40％熱苯中，濾液減壓濃縮到原體積的約1/2時(shí)，放置冰箱中過夜，析出粘稠物。過濾，用苯少許洗滌濾餅、即豬去氧膽酸甲酯-苯加成物。
5、HDCA純品的分離豬去氧膽酸甲酯-苯加成物加入初始豬膽汁重量4～6％的NaOH或KOH、初始豬膽汁體積10～12％水，水蒸汽蒸餾，直至苯全部蒸除，加入1N HCl調(diào)pH至4～5，析出沉淀，水洗至中性，真空干燥。得到HDCA純品。
其中第4和第5步驟HDCA的純化方法也可采用現(xiàn)有的生產(chǎn)方法的丙酮和乙酸乙酯重結(jié)晶方法，然而，所得產(chǎn)品的純度能顯著提高。
本發(fā)明在總膽酸的分離過程中，通過嚴(yán)格控制合理的pH和料液的溫度，選擇性沉淀豬膽汁酸，使得皂化產(chǎn)物中的豬膽汁酸能充分析出，同時(shí)減少了其中的雜質(zhì)含量，減輕了后續(xù)HDCA的純化難度。
本發(fā)明在HDCA的純化過程中，利用膽汁酸甲酯苯加成物在苯中的不同溶解度這一特性，選擇性沉淀豬去氧膽酸甲酯-苯加成物。一方面克服了有機(jī)溶劑重結(jié)晶這一傳統(tǒng)方法溶劑耗用量大，操作繁瑣的缺陷，另一方面使得終產(chǎn)品純度顯著提高。
本發(fā)明的HDCA生產(chǎn)方法成本較低、可形成工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)、所得產(chǎn)品純度高(HPLC＞98％)、總收率達(dá)到所投入下腳料的20％以上；該發(fā)明克服了現(xiàn)有方法所得產(chǎn)品純度不高、乙酸乙酯和丙酮耗用量大等缺陷；該發(fā)明所用原料在產(chǎn)出HDCA后還可從中進(jìn)一步提取高價(jià)值的CDCA產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。
實(shí)施例1取豬膽汁提取膽紅素的下腳料(膏狀物)125g，用氫氧化鈉皂化下腳料，投料的重量比例為下腳料∶水∶氫氧化鈉＝1∶7∶1.2，按重量比例下料，先于2L三頸燒瓶中進(jìn)水875ml，再將150g氫氧化鈉投入水中攪拌，待完全溶解后投入下腳料，升溫到80℃前，加入消泡劑防止產(chǎn)生過多氣泡。然后小心升溫至110℃，回流反應(yīng)25h。
皂化反應(yīng)完成后，待反應(yīng)液冷卻至50℃時(shí)，邊攪拌邊用濃硫酸將反應(yīng)液調(diào)至pH8，并使溫度維持在55～60℃。然后加入5g NaHSO3，攪拌15min。加入400ml乙酸乙酯，邊攪拌邊用稀硫酸進(jìn)一步酸化至pH 5.0，溫度保持在55℃，攪拌30min后靜置1h，溶液分為兩層，下層為黃色的水相，上層為棕紅色的乙酸乙酯相，虹吸取出有機(jī)層。
加硅藻土及活性炭各10g，攪拌30min，過濾，殘?jiān)?0mL乙酸乙酯洗滌，合并濾液和洗滌液。將上述合并液減壓濃縮至285ml，伴隨慢慢攪拌后有沉淀生成，然后室溫下靜置15h。抽濾，以乙酸乙酯清洗濾餅，直至濾液呈淡黃色。所得固體真空干燥，得到30.5g的灰白色HDCA粗品。熔點(diǎn)為187.5～190.2℃，收率占所投入下腳料的24.4％。
實(shí)施例2將實(shí)施例1得到的30g HDCA，溶于300ml甲醇中，加4.0ml濃硫酸酯化，室溫?cái)嚢?4h。用NaHCO3中和至pH7，混合物過濾，減壓濃縮得油狀物。
油狀物溶于350ml熱苯中，濾液減壓濃縮到原體積的約1/2時(shí)，放置冰箱中過夜，析出粘稠物。過濾，用苯少許洗滌濾餅(豬去氧膽酸甲酯-苯加成物)。
豬去氧膽酸甲酯-苯加成物加入5.5gNaOH和100ml水，水蒸汽蒸餾，直至苯全部蒸除，加入145ml 1N HCl后，析出沉淀，水洗至中性，真空干燥。得到27.07g熔點(diǎn)197～198.2℃的HDCA，本步收率為90.2％，總收率為所投入下腳料的22％，HPLC檢測(cè)，純度＞99％。
實(shí)施例3將實(shí)施例1得到的HDCA粗品用丙酮進(jìn)行重結(jié)晶。取20g HDCA粗品加500ml丙酮和溶液體積5％的活性炭，混合溶解，回流0.5h。趁熱過濾，用丙酮洗滌殘?jiān)?，合并濾液和洗液，減壓濃縮至200ml，在0～5℃冷藏15h，析出晶體。分離結(jié)晶，真空干燥，得到13.6g熔點(diǎn)196.7℃以上的白色HDCA，收率68％，HPLC檢測(cè)，純度＞98％。
實(shí)施例4將實(shí)施例1得到的HDCA粗品用乙酸乙酯進(jìn)行重結(jié)晶。取20g HDCA粗品，加入乙酸乙酯200ml，混合溶解，回流0.5h。減壓濃縮至溶液剛剛開始混濁(體積約為110ml)。在0～5℃冷藏5h，結(jié)晶。分離結(jié)晶，真空干燥，得到16.6g熔點(diǎn)190.5℃以上的白色HDCA，收率83％。
實(shí)施例5取1000g新鮮豬膽汁和120g KOH，加入到2L的三頸燒瓶中，攪拌升溫，升溫至135℃，回流反應(yīng)20h。
皂化反應(yīng)完成后，待反應(yīng)液冷卻至50℃時(shí)，邊攪拌邊用濃鹽酸將反應(yīng)液調(diào)至pH8，并使溫度維持在50～63℃。然后加入5.3g NaHSO3，攪拌15min。加入400ml乙醚，一邊攪拌一邊用稀硫酸繼續(xù)酸化至pH 4.75，溫度保持在50℃，攪拌30min后靜置1h，溶液分為兩層，下層為微黃色的水相，上層為棕紅色的乙醚相，虹吸取出有機(jī)層。
加硅藻土及活性炭各10g，攪拌30min，過濾，殘?jiān)?0ml乙醚洗滌，合并濾液和洗滌液。將上述合并液減壓濃縮至250ml，伴隨慢慢攪拌后有沉淀生成，然后室溫下放置20h。過濾，以乙醚洗滌濾餅，直至濾液呈淡黃色。所得固體真空干燥，得到46g的灰白色HDCA粗品。收率為原膽汁重量的4.6％。
實(shí)施例6取豬膽汁提取膽紅素的下腳料(膏狀物)125g，用氫氧化鈉皂化下腳料，投料的重量比例為下腳料∶水∶氫氧化鈉＝1∶7∶1.0，按重量比例下料，先于2L三頸燒瓶中進(jìn)水875ml，再將125g氫氧化鈉投入水中攪拌，待完全溶解后投入下腳料，升溫到80℃前，加入消泡劑防止產(chǎn)生過多氣泡。然后小心升溫至110℃，回流反應(yīng)22h。
皂化反應(yīng)完成后，待反應(yīng)液冷卻至50℃時(shí)，在攪拌的條件下用濃硫酸將反應(yīng)液調(diào)至pH8，溫度維持在55±3℃。上述酸化液溫度保持在55℃，加NaHSO34.5g，攪拌15min。然后加入500mL乙醚，邊攪拌邊用稀硫酸繼續(xù)酸化至pH 4.75，攪拌30min后靜置1h，虹吸取出有機(jī)層。
加硅藻土及活性炭各10g，攪拌30min，過濾，殘?jiān)?0mL乙醚洗滌，合并濾液和洗滌液，蒸除乙醚至干，得到72g的HDCA粗品油狀物。
實(shí)施例7取實(shí)施例6所得油狀物溶于300ml無水乙醇中，加4.0ml 72％磷酸酯化，室溫?cái)嚢?2h。用Na2CO3中和至pH7，混合物過濾，減壓濃縮得油狀物。
油狀物溶于320ml熱苯中，濾液減壓濃縮到原體積的約1/2時(shí)，放置冰箱中過夜，析出粘稠物。過濾，用苯少許洗滌濾餅，即豬去氧膽酸甲酯-苯加成物。
豬去氧膽酸甲酯-苯加成物加入5.5gKOH和120ml水，水蒸汽蒸餾，直至苯全部蒸除，加入150ml 1N HCl后，析出沉淀，水洗至中性，真空干燥。得到25.23gHDCA，熔點(diǎn)197℃以上，總收率占投入下腳料的20.18％，HPLC檢測(cè)，純度＞98.5％。
權(quán)利要求
1.一種從豬膽汁中制備高純度豬去氧膽酸的方法，其特征在于以新鮮豬膽汁或豬膽汁提取膽紅素的下腳料為原料，用堿皂化下腳料，控制皂化液的溫度和pH，乙酸乙酯萃取，活性炭脫色；將母液濃縮至適當(dāng)體積，分離沉淀得到HDCA粗品；將粗品進(jìn)行純化，獲得HDCA純品；其中制備HDCA粗品的方法包括以下步驟(1)膽汁酸的皂化將豬膽汁提取膽紅素的下腳料用水稀釋制成懸浮液，投料的重量比例為下腳料∶水＝1∶7～9，此懸浮液固形物含量約為10％～12.5％，其膽汁酸的含量等同于等體積的新鮮豬膽汁；取新鮮豬膽汁或上述懸浮液作為初始豬膽汁，加入初始豬膽汁重量10％～15％的氫氧化鈉或氫氧化鉀，加入初始豬膽汁重量2％的消泡劑，110～135℃加熱回流16～25h，進(jìn)行皂化；(2)總膽酸的分離皂化反應(yīng)完成后，待反應(yīng)液冷卻至50℃時(shí)，在攪拌的條件下用濃硫酸或鹽酸將反應(yīng)液調(diào)至pH8；酸化液溫度保持在55±5℃，加入初始豬膽汁重量3～5％NaHSO3，攪拌15min；然后加入反應(yīng)液體積40％的乙酸乙酯或乙醚，邊攪拌邊用稀的硫酸或鹽酸繼續(xù)酸化至pH5，攪拌30min后靜置1h，虹吸取出有機(jī)層；加入初始豬膽汁重量5～10％的活性炭，50～55℃攪拌30min，過濾，殘?jiān)猿跏钾i膽汁體積5％的乙酸乙酯洗滌，合并濾液和洗滌液；(3)HDCA粗品的分離將上述合并液減壓濃縮至乙酸乙酯或乙醚加入量的1/2～2/3，伴隨慢慢攪拌后有沉淀生成，然后置于室溫下15～20h；抽濾，以乙酸乙酯清洗濾渣，直至濾液呈黃色；將清洗過的沉淀真空干燥，得到灰白色HDCA粗品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬膽汁中制備高純度豬去氧膽酸的方法，其特征在于所述制備得到HDCA粗品的純化方法中包括(1)HDCA的甲酯化總膽酸溶于初始豬膽汁體積30％甲醇或乙醇中，加入適量濃硫酸、鹽酸或磷酸酯化，室溫?cái)嚢?2～36h。以NaHCO3或Na2CO3中和至pH7，混合物過濾，減壓濃縮得油狀物；油狀物溶于初始豬膽汁體積30～40％熱苯中，濾液減壓濃縮到原體積的約1/2時(shí)，放置冰箱中過夜，析出粘稠物；過濾，用苯少許洗滌濾餅、即豬去氧膽酸甲酯-苯加成物；(2)所述的HDCA純品的分離豬去氧膽酸甲酯-苯加成物加入初始豬膽汁重量4～6％的NaOH或KOH、初始豬膽汁體積10～12％水，水蒸汽蒸餾，直至苯全部蒸除，加入1N HCl調(diào)pH至4～5，析出沉淀，水洗至中性，真空干燥，得到HDCA純品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬膽汁中制備高純度豬去氧膽酸的方法，其特征在于所述制備得到HDCA粗品的純化方法采用現(xiàn)有的丙酮和乙酸乙酯重結(jié)晶方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用豬膽汁或提取膽紅素的下腳料提取豬去氧膽酸的方法。用堿皂化下腳料，調(diào)節(jié)pH，乙酸乙酯萃取，活性炭脫色。將母液濃縮至適當(dāng)體積，析出沉淀，分離沉淀并干燥得到粗品豬去氧膽酸。粗品進(jìn)行酯化，然后與苯進(jìn)行加成反應(yīng)，利用不同膽汁酸甲酯與苯加成物在苯中的不同溶解度，分離豬去氧膽酸甲酯－苯加成物。用堿分解加成物，調(diào)節(jié)pH，獲得豬去氧膽酸純品。所得母液還可進(jìn)一步提取高價(jià)值鵝去氧膽酸。整個(gè)工藝具有原料豐富易得，環(huán)境友好，安全無毒，成本低，產(chǎn)品純度高，易于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K35/413GK101037463SQ20071002141
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月11日
發(fā)明者徐斌, 董英, 王保志, 丁衛(wèi)平 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)