專利名稱：：人工肝生物反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種以納米纖維支架材料作為肝細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的用于生物人工肝的生物反應(yīng)器，屬于人工肝支持系統(tǒng)的
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：人工肝作為肝功能不全、肝衰竭或相關(guān)疾病的有效輔助治療技術(shù)已在臨床中廣泛應(yīng)用，現(xiàn)在臨床上應(yīng)用的人工肝主要包括三類非生物型人工肝、生物型人工肝、混合型人工肝。其中生物型人工肝在治療肝病病人的臨床應(yīng)用中療效最為顯著，生物型人工肝一般專指人工培養(yǎng)的肝細(xì)胞為基礎(chǔ)構(gòu)件的體外生物反應(yīng)系統(tǒng)。它不僅具有肝臟的特異性解毒功能，而且具有更高的效能，如參與能量代謝，具有生物合成轉(zhuǎn)化功能，分泌促肝細(xì)胞生長活性物質(zhì)等。生物型人工肝具有自動化程度高、操作簡單、安全可靠的特點。其治療重型肝炎的臨床結(jié)果顯示，顯效率為36.7％，有效率為46.7％，總有效率為83.3％。目前應(yīng)用于臨床的生物型人工肝在細(xì)胞培養(yǎng)方面存在很多問題，諸如生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的肝細(xì)胞密度過低達(dá)不到人體所需的2～3×1010cells/m2，肝細(xì)胞容易從培養(yǎng)基質(zhì)上脫落從而造成肝細(xì)胞隨循環(huán)的培養(yǎng)液流走和在生物反應(yīng)器內(nèi)分布不均勻造成人工肝功能下降，以及培養(yǎng)液中氧氣供量不足造成的肝細(xì)胞死亡等等。未來生物型人工肝主要在肝細(xì)胞的培養(yǎng)以及肝細(xì)胞的優(yōu)化方面進行改進(Jung-KeugPark，Doo-HoonLee.BioartificialLiverSystemsCurrentStatusandFuturePerspective.JournalofBioscienceandBioengineering2005.99(4)311-319.)。納米纖維支架是近年來興起的一種細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，具有巨大的比表面積(孔隙率＞85％)以及10nm～10μm的纖維直徑，其紡織狀的形貌結(jié)構(gòu)類似于脊椎動物體內(nèi)的細(xì)胞生長基質(zhì)-蛋白纖維，有利于細(xì)胞的黏附、生長以及繁殖。有資料表明這種納米纖維支架有利于肝細(xì)胞球狀體的形成以及球狀體生物活性的保持，培養(yǎng)在納米纖維支架上的肝細(xì)胞其合成自蛋白、尿素的能力均大于利用傳統(tǒng)模式培養(yǎng)的肝細(xì)胞(Kian-NgiapChua，Wei-SengLima.Stableimmobilizationofrathepatocytespheroidsongalactosylatednanofiberscaffold.Biomaterials2005.262537-2547)?，F(xiàn)行生物型人工肝的肝細(xì)胞密度一般在5～8×108cells/m2之間，與人肝的肝細(xì)胞密度2～3×1010cells/m2尚有很大差距，因此，現(xiàn)行人工肝不能滿足一個成人的血液凈化需求。并且現(xiàn)行生物型人工肝的肝細(xì)胞球狀體隨著培養(yǎng)液的流動易從細(xì)胞基質(zhì)上脫落，造成肝細(xì)胞的分布不均勻和肝細(xì)胞數(shù)量的減少。肝細(xì)胞對氧氣的需求量很大，但現(xiàn)有的生物人工肝均有氧氣提供不足的缺點，造成肝細(xì)胞的生物活性降低甚至死亡。以上原因嚴(yán)重影響人工肝的臨床效能。目前還沒有檢索到關(guān)于利用納米纖維支架對人工肝生物反應(yīng)器進行改進的報道或?qū)＠?br/>發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明目的在于提供一種利于提高肝細(xì)胞濃度和固定化肝細(xì)胞的人工肝生物反應(yīng)器。該生物反應(yīng)器實現(xiàn)了生物反應(yīng)器內(nèi)肝細(xì)胞的黏附生長，不僅可以避免傳統(tǒng)人工肝的肝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所帶來的細(xì)胞流失問題，而且納米纖維無紡布的類生物體蛋白纖維的結(jié)構(gòu)可以促進肝細(xì)胞的繁殖和生長，從而可以在很大程度上提高肝細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的密度以及肝細(xì)胞的生物活性，增強肝細(xì)胞合成白蛋白及分泌染色素的能力。技術(shù)方案本發(fā)明將納米纖維支架應(yīng)用于人工肝生物反應(yīng)器并通過優(yōu)化內(nèi)部結(jié)構(gòu)對生物反應(yīng)器進行改進，以提高生物型人工肝的肝細(xì)胞密度和增加培養(yǎng)液的氧含量并改善肝細(xì)胞在生物反應(yīng)器內(nèi)分布情況，從而提高生物型人工肝的臨床效能。針對以上問題本發(fā)明在對人工肝生物反應(yīng)器的改進中引入納米纖維支架，利用納米纖維支架利于細(xì)胞黏附、生長的特點，可達(dá)到固定肝細(xì)胞進而提高生物型人工肝的肝細(xì)胞密度的目的，并且有利于細(xì)胞培養(yǎng)液的循環(huán)以及促進肝細(xì)胞的繁殖和球狀體的形成。此外對生物反應(yīng)器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化設(shè)計，增加輸氧管，以提高肝細(xì)胞的成活率和生物活性。進而提高肝細(xì)胞凈化血液的能力。本發(fā)明的人工肝生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)為在生物反應(yīng)器外殼的一端設(shè)有血漿進口、氧氣進口，在生物反應(yīng)器外殼的另一端設(shè)有血漿出口、氧氣出口，在生物反應(yīng)器外殼的側(cè)面地兩頭分別設(shè)有營養(yǎng)液進口、營養(yǎng)液出口，在生物反應(yīng)器外殼的內(nèi)部設(shè)有由納米纖維支架、中空纖維組成的細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)；納米纖維支架與中空纖維之間形成卷曲的“夾心式”結(jié)構(gòu)，即納米纖維支架卷曲成螺旋的卷筒狀，在卷曲的夾層中設(shè)有中空纖維，肝細(xì)胞聚集體附在中空纖維旁；在生物反應(yīng)器中設(shè)置氧氣通道，可以實現(xiàn)適時加氧功能。所述的納米纖維支架的材料為海藻酸鹽、多聚賴氨酸、殼聚糖、瓊脂糖、聚乙烯醇中的一種或幾種的混合物，呈長方形無紡布結(jié)構(gòu)。所述納米纖維支架的纖維直徑在30nm～400nm之間，孔隙率＞85％。將納米纖維支架中排布的中空纖維每間隔5～10根選取一根，按此方法將選出的中空纖維作為氧氣的通道，將余下的中空纖維作為血漿的通道。有益效果該生物反應(yīng)器首次引入納米纖維支架，實現(xiàn)了生物反應(yīng)器內(nèi)肝細(xì)胞的黏附生長，不僅可以避免傳統(tǒng)人工肝的肝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所帶來的細(xì)胞流失問題，而且納米纖維無紡布的類生物體蛋白纖維的結(jié)構(gòu)可以促進肝細(xì)胞的繁殖和生長，從而可以在很大程度上提高肝細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的密度以及肝細(xì)胞的生物活性，增強肝細(xì)胞合成白蛋白及分泌染色素的能力。針對肝細(xì)胞的培養(yǎng)需氧量大的特點，在生物反應(yīng)器的設(shè)計中加入了通氧設(shè)施，可以實現(xiàn)適時向反應(yīng)器中供氧的功能。該生物反應(yīng)器的設(shè)計新穎，納米纖維支架的引入在國內(nèi)外尚屬首例，且制備方法在技術(shù)上均能實現(xiàn)?？梢韵嘈胚@種新型的生物反應(yīng)器在人工肝以及其他細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。圖1為生物反應(yīng)器橫切面示意圖，圖2為生物反應(yīng)器縱切面示意圖，以上的圖中有營養(yǎng)液進口1、血漿進口2、氧氣進口3、營養(yǎng)液出口4、血漿出口5、氧氣出口6，生物反應(yīng)器外殼7、納米纖維支架8、中空纖維9、肝細(xì)胞聚集體10。具體實施例方式本發(fā)明的人工肝生物反應(yīng)器在生物反應(yīng)器外殼7的一端設(shè)有血漿進口2、氧氣進口3，在生物反應(yīng)器外殼7的另一端設(shè)有血漿出口5、氧氣出口6，在生物反應(yīng)器外殼7的側(cè)面地兩頭分別設(shè)有營養(yǎng)液進口1、營養(yǎng)液出口4，在生物反應(yīng)器外殼7的內(nèi)部設(shè)有由納米纖維支架8、中空纖維9組成的細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)；納米纖維支架8與中空纖維9之間形成卷曲的“夾心式”結(jié)構(gòu)，即納米纖維支架8卷曲成螺旋的卷筒狀，在卷曲的夾層中設(shè)有中空纖維9，肝細(xì)胞聚集體10附在中空纖維9旁；在生物反應(yīng)器中設(shè)置氧氣通道，可以實現(xiàn)適時加氧功能。其中面臨的主要問題為支架材料的選擇以及生物反應(yīng)器內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)計的問題。納米纖維支架材料應(yīng)具有良好的生物相容性以及一定的力學(xué)強度。為此，制備納米纖維支架的材料選擇有利于肝細(xì)胞繁殖、生長的海藻酸鹽、多聚賴氨酸、殼聚糖、瓊脂糖、聚乙烯醇等高分子聚合物。內(nèi)部結(jié)構(gòu)的設(shè)計應(yīng)利于細(xì)胞營養(yǎng)液的適時加氧以及減小具體制備過程中的操作難度。利用靜電紡絲法將以上高分子聚合物制備成具有30nm～400nm直徑纖維的長方形無紡布支架，將中空纖維規(guī)則排布于無紡布支架上，其中部分中空纖維作為氧氣通道而其他中空纖維作為血漿通道，將納米纖維支架卷曲包裹中空纖維后填充于生物反應(yīng)器內(nèi)(見附圖)，即制得此新型生物反應(yīng)器。該生物反應(yīng)器的特征在于引入納米纖維支架作為細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)，此納米纖維支架原材料為海藻酸鹽、或多聚賴氨酸、或殼聚糖、或瓊脂糖、或聚乙烯醇等高分子聚合物，具有30nm～400nm的纖維直徑，呈長方形無紡布結(jié)構(gòu)；納米纖維支架與中空纖維間呈規(guī)則的卷曲“夾心式”結(jié)構(gòu)；中空纖維束分為兩束，其中一束作為氧氣通道，向細(xì)胞培養(yǎng)液中適時加氧；在反應(yīng)器的外殼上留有血漿、氧氣、營養(yǎng)液的進出口各兩個。本發(fā)明通過以下方法加以實施。利用靜電紡絲技術(shù)將聚合物(海藻酸鹽、多聚賴氨酸、殼聚糖、瓊脂糖、聚乙烯醇等)制備成一定面積的長方形無紡布支架，然后將聚砜中空纖維規(guī)則的排布于納米纖維無紡布上(間距在0.5mm～2mm)，每隔5～15根選擇一根中空纖維作為氧氣的通道，卷曲納米纖維支架將聚砜中空纖維包裹起來，后填充于外殼支架內(nèi)，在外殼支架上留有氧氣通道、血漿通道、培養(yǎng)液通道各兩個分別作為進口和出口。該方法包括以下過程1.納米纖維支架的制備選擇不同的溶劑將聚合物(海藻酸鹽、多聚賴氨酸、殼聚糖、瓊脂糖、聚乙烯醇等)溶解制備成靜電紡絲溶液。根據(jù)聚合物溶液的不同性質(zhì)制定不同的靜電紡絲條件(電壓、接受距離、注射速度)，然后進行紡絲，在紡絲過程中通過移動接受器的位置和控制紡絲的時間對納米纖維支架的形狀和厚度進行調(diào)節(jié)。將不同材料的納米纖維支架進行相應(yīng)的改性和消毒，制備成能放置于細(xì)胞培養(yǎng)液中作為細(xì)胞生長基質(zhì)的納米纖維支架。2.中空纖維與納米纖維支架的構(gòu)造設(shè)計將納米纖維無紡布支架平坦，在支架上順序排布聚砜中空纖維(間距0.5mm～2mm)，然后卷曲納米纖維支架將中空纖維包裹在其內(nèi)部，即制得生物反應(yīng)器的核心組件。每間隔5～10根選擇一根中空纖維作為供應(yīng)氧氣的通道，按此方式將兩端的中空纖維分成兩束，一束作為血漿的通道，一束作為氧氣的通道。3.核心組件的封裝將步驟2種得到的核心組件用聚丙烯外殼封裝，在外殼上留有血漿、氧氣、培養(yǎng)液的進出孔各兩個。將兩端的兩束中空纖維按順序分別放入血漿和氧氣的通道孔中，并用醫(yī)用膠水封裝，即制得此新型生物反應(yīng)器。例一以海藻酸鹽作為納米纖維支架的原材料來制作此新型生物反應(yīng)器。1.納米纖維支架的制備(1)靜電紡絲溶液的制備將海藻酸鈉溶于去離子水中制備成濃度為質(zhì)量比W海藻酸鈉∶W去離子水＝4％的溶液。將聚氧化乙烯(Mw＝900kD)溶于去離子水中制備成濃度為質(zhì)量比W聚氧化乙烯∶W去離子水＝4％的溶液。然后將兩種溶液按體積比V海藻酸鈉溶液∶V聚氧化乙烯溶液＝8∶2的比率混合，常溫攪拌100min至混合均勻，得到海藻酸鈉與聚氧化乙烯的混合溶液。然后按體積比V表面活性劑∶V混合溶液＝0.5％的比率加入表面活性劑曲拉通X-100，持續(xù)攪拌10min。之后按體積比V助溶劑∶V混合溶液＝10％的比率加入助溶劑二甲亞砜。在室溫下持續(xù)攪拌60min。即獲得均一、穩(wěn)定的淺黃色紡絲溶液。(2)靜電紡絲工藝制備納米纖維支架使用離心機將步驟(1)中獲得的紡絲溶液在5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5min，之后將其注入到注射器(直徑為20mm)中，將注射器固定在微量注射泵上，距針頭15cm處固定鋁箔作為接收器。在針頭上施加18kv的高壓，注射泵流速為1.0mL/h。在紡絲過程中不斷移動接收器，即獲得一定面積的纖維膜，其纖維直徑在50nm～500nm。(3)海藻酸鈉納米纖維支架的改性處理將步驟(2)中所得的納米纖維材料浸泡在無水乙醇中10min，之后將該材料浸泡在濃度為質(zhì)量比WCaCl2∶WH2O＝2％的CaCl2溶液中并持續(xù)120min，然后用去離子水沖洗10min以去除殘留的CaCl2。即制得海藻酸鈉納米纖維支架。2.核心組件中中空纖維與納米纖維支架的構(gòu)造將海藻酸鹽納米纖維無紡布支架平坦，在支架上順序排布聚砜中空纖維其間距為1mm，然后卷曲納米纖維支架將中空纖維包裹在其內(nèi)部，形成“夾心式”結(jié)構(gòu)，即制得生物反應(yīng)器的核心組件。然后每間隔5～10根選擇一根中空纖維作為供應(yīng)氧氣的通道，按此方式將兩端的中空纖維分成兩束，一束作為血漿的通道，一束作為氧氣的通道。3.核心組件的封裝將步驟2種得到的核心組件用聚丙烯外殼封裝，在外殼上留有血漿、氧氣、培養(yǎng)液的進出孔各兩個。將兩端的兩束中空纖維按順序分別放入血漿和氧氣的通道孔中，并用醫(yī)用膠水封裝，即制得此新型生物反應(yīng)器例二以殼聚糖作為納米纖維支架的原材料來制作此新型生物反應(yīng)器。1.納米纖維支架的制備(1)靜電紡絲溶液的制備將殼聚糖(Mw＝190kD，Deacetylation＝85％)溶于質(zhì)量比為5％的醋酸溶液中制備成濃度為質(zhì)量比W殼聚糖∶W醋酸溶液＝2％的溶液。將聚氧化乙烯(Mw＝900kD)溶于質(zhì)量比為5％的醋酸溶液中制備成濃度為質(zhì)量比W聚氧化乙烯∶W醋酸溶液＝3％的溶液。然后將兩種溶液按體積比V殼聚糖溶液∶V聚氧化乙烯溶液＝9∶1的比率混合，常溫攪拌100min至混合均勻，得到殼聚糖與聚氧化乙烯的混合溶液。然后按體積比V表面活性劑∶V混合溶液＝0.3％的比率加入表面活性劑曲拉通X-100，持續(xù)攪拌10min。之后按體積比V助溶劑∶V混合溶液＝10％的比率加入助溶劑二甲基甲酰胺。在室溫下持續(xù)攪拌60min。即獲得均一、穩(wěn)定的紡絲溶液。(2)靜電紡絲工藝制備納米纖維支架使用離心機將步驟(1)中獲得的紡絲溶液在5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5min，之后將其注入到注射器(直徑為20mm)中，將注射器固定在微量注射泵上，距針頭18cm處固定鋁箔作為接收器。在針頭上施加22kv的高壓，注射泵流速為1.5mL/h。在紡絲過程中不斷移動接收器，即獲得一定面積的纖維膜，其纖維直徑在30nm～80nm。在室溫下使納米纖維膜干燥即制得海藻酸鈉納米纖維支架。2.核心組件中中空纖維與納米纖維支架的構(gòu)造將殼聚糖納米纖維無紡布支架平坦，在支架上順序排布聚砜中空纖維其間距為1mm，然后卷曲納米纖維支架將中空纖維包裹在其內(nèi)部，形成“夾心式”結(jié)構(gòu)，即制得生物反應(yīng)器的核心組件。然后每間隔5～10根選擇一根中空纖維作為供應(yīng)氧氣的通道，按此方式將兩端的中空纖維分成兩束，一束作為血漿的通道，一束作為氧氣的通道。3.核心組件的封裝將步驟2種得到的核心組件用聚丙烯外殼封裝，在外殼上留有血漿、氧氣、培養(yǎng)液的進出孔各兩個。將兩端的兩束中空纖維按順序分別放入血漿和氧氣的通道孔中，并用醫(yī)用膠水封裝，即制得此新型生物反應(yīng)器權(quán)利要求1.一種人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于在生物反應(yīng)器外殼(7)的一端設(shè)有血漿進口(2)、氧氣進口(3)，在生物反應(yīng)器外殼(7)的另一端設(shè)有血漿出口(5)、氧氣出口(6)，在生物反應(yīng)器外殼(7)的側(cè)面地兩頭分別設(shè)有營養(yǎng)液進口(1)、營養(yǎng)液出口(4)，在生物反應(yīng)器外殼(7)的內(nèi)部設(shè)有由納米纖維支架(8)、中空纖維(9)組成的細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)；納米纖維支架(8)與中空纖維(9)之間形成卷曲的“夾心式”結(jié)構(gòu)，即納米纖維支架(8)卷曲成螺旋的卷筒狀，在卷曲的夾層中設(shè)有中空纖維(9)，肝細(xì)胞聚集體(10)附在中空纖維(9)旁；在生物反應(yīng)器中設(shè)置氧氣通道，可以實現(xiàn)適時加氧功能。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于所述的納米纖維支架(8)的材料為海藻酸鹽、多聚賴氨酸、殼聚糖、瓊脂糖、聚乙烯醇中的一種或幾種的混合物，呈長方形無紡布結(jié)構(gòu)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于所述納米纖維支架(8)的纖維直徑在30nm～400nm之間，孔隙率＞85％。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于將納米纖維支架(8)中排布的中空纖維(9)每間隔5～10根選取一根，按此方法將選出的中空纖維(9)作為氧氣的通道，將余下的中空纖維(9)作為血漿的通道。全文摘要人工肝生物反應(yīng)器涉及一種以納米纖維支架材料作為肝細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的用于生物人工肝的生物反應(yīng)器。此生物反應(yīng)器在生物反應(yīng)器外殼(7)的一端設(shè)有血漿進口(2)、氧氣進口(3)，在生物反應(yīng)器外殼(7)的另一端設(shè)有血漿出口(5)、氧氣出口(6)，在生物反應(yīng)器外殼(7)的側(cè)面地兩頭分別設(shè)有營養(yǎng)液進口(1)、營養(yǎng)液出口(4)，在生物反應(yīng)器外殼(7)的內(nèi)部設(shè)有由納米纖維支架(8)、中空纖維(9)組成的細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)；納米纖維支架(8)與中空纖維(9)之間形成卷曲的“夾心式”結(jié)構(gòu)，即納米纖維支架(8)卷曲成螺旋的卷筒狀，在卷曲的夾層中設(shè)有中空纖維，肝細(xì)胞聚集體(10)附在中空纖維(9)旁；在生物反應(yīng)器中設(shè)置氧氣通道，可以實現(xiàn)適時加氧功能。文檔編號A61F2/00GK101050418SQ200710020669公開日2007年10月10日申請日期2007年3月20日優(yōu)先權(quán)日2007年3月20日發(fā)明者顧忠澤,馮章啟,付德剛申請人:東南大學(xué)