專利名稱：一種免佐劑具有治療動脈粥樣硬化作用的免疫調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)、蛋白分離純化技術(shù)及醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及融合蛋白CTB-p277的構(gòu)建、表達及分離純化，融合蛋白CTB-p277和HSP65的化學(xué)藕聯(lián)。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，本發(fā)明是一種免疫調(diào)節(jié)劑，能用于預(yù)防和治療人動脈粥樣硬化。
背景技術(shù)：
動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)所導(dǎo)致的心、腦血管疾病是嚴重危害人類生命健康的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均居各種疾病前列，同時動脈粥樣硬化也是其他一些嚴重疾病的致病基礎(chǔ)，例如高血壓及慢性腎功能衰竭等，歐美等發(fā)達國家已將心血管疾病列為危害人類身體健康的主要殺手之一。而在我國，據(jù)統(tǒng)計，每年因心血管疾病死亡的人數(shù)約260萬，而且患者人數(shù)呈逐年上升趨勢，年齡呈年輕化趨勢。如何防治動脈粥樣硬化是人們今后要面臨的一個難題。
傳統(tǒng)觀點認為，動脈粥樣硬化是由多種因素促成的，如脂質(zhì)代謝紊亂、高血壓、吸煙、肥胖、糖尿病及糖耐量減低，高凝狀態(tài)，纖溶功能減低，高同型半胱氨酸血癥、高尿酸血癥、遺傳、性別及某些基因的多態(tài)性等。但近年來Ross以新的論據(jù)在他的損傷反應(yīng)學(xué)說的基礎(chǔ)上，明確提出“動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病而不是單純的由于脂質(zhì)沉積所致”，其他學(xué)者又對此進行了補充。動脈粥樣硬化斑塊的形成可能是機體對各種損傷(物理、化學(xué)、生物)的一種本能的保護性反應(yīng)，持續(xù)存在的損傷因素促成了粥樣硬化斑塊和血栓的形成。實際上，炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展到最后斑塊表面破裂并發(fā)血栓形成的所有階段均發(fā)揮了作用。
臨床研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)、抗磷脂抗體綜合征、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)和血管炎患者均有加速形成AS。近年來的大量研究表明AS是一種自身免疫性疾病。
動脈粥樣硬化的危險因素如感染、低密度脂蛋白的氧化、氧化應(yīng)激、高血壓、生物力學(xué)應(yīng)激等可引起內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞內(nèi)的熱休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)過度表達，而且感染的微生物(如肺炎衣原體等)也可釋放出HSP60，具有免疫原性。同時發(fā)現(xiàn)正常定位在細胞內(nèi)的HSP已變成一種可溶形式存在于血液中，這種可溶形式與人類動脈粥樣硬化呈正相關(guān)。動脈硬化患者的抗HSP的自身抗體的滴度明顯的升高，在動脈粥樣硬化的斑塊里已發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞對HSP的特異反應(yīng)。
一般情況下，自身免疫性疾病可通過免疫疾病相關(guān)的自身抗原來治療。動脈硬化患者的抗HSP的自身抗體水平很高，通過免疫HSP65誘導(dǎo)免疫耐受可以達到治療該病的目的。
p277多肽是存在于人HSP60蛋白上的24個氨基酸的多肽(SEQ ID NO.1)。有文獻報道p277是一種在炎癥部位激活抑制炎癥因子的Th2型細胞因子可關(guān)閉Th1細胞對附近其他抗原的反應(yīng)的抗原表位，即p277是較好的治療動脈粥樣硬化這類炎癥性疾病的抗原表位。不過，p277的免疫原性是比較弱的，為了克服這個缺點，我們引入了霍亂毒素B亞單位(Choleratoxin B subunit，CTB)。
CTB是霍亂毒素(Cholera toxin，CT)上的一個亞基，霍亂毒素是一個85KD大小的寡聚蛋白，由一個A亞基(CTA，28KD)和五個完全相同的B亞基(CTB，11.6KD)組成，形成AB5結(jié)構(gòu)。A亞基又由A1亞基(CTA1，22KD)和A2亞基(CTA2，5KD)構(gòu)成。CTA1亞基具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，是發(fā)揮毒性的部分，CTA2是連接肽，連接CTA1和CTB之間的橋梁，它通過二硫鍵與CTA1亞基共價連接，通過非共價鍵與CTB相連。CTB是霍亂毒素上的無毒部分，它能與大多數(shù)哺乳動物細胞表面都有的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1特異性結(jié)合，每個CTB和GM1都有很高的親和力。當(dāng)CTB識別粘膜的M細胞和粘膜上皮細胞表面的GM1神經(jīng)節(jié)苷酯，通過A2將有毒性的A1亞基牽引進入粘膜M細胞和粘膜上皮細胞，這樣就會引發(fā)嚴重腹瀉。
越來越多的研究表明，CTB作為載體蛋白與相應(yīng)的抗原融合表達，可以有效地增強抗原的粘膜免疫原性。Kim等用CTB基因和鼠輪狀病毒腸毒素基因(NSP4)融合(CTB-NSP4)，轉(zhuǎn)入馬鈴薯細胞表達，實驗表明，該融合蛋白可以引發(fā)強烈的粘膜免疫反應(yīng)。George-Chandy等證明CTB和相應(yīng)的抗原連接后，CTB就成為一種很有效的粘膜載體分子，是一種免疫增強劑。Arêas等用CTB與肺炎球菌表面粘附素A基因(PsaA)融合，表達形成CTB-PsaA，發(fā)現(xiàn)該蛋白可以在小鼠中誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)。Eriksson等發(fā)現(xiàn)用化學(xué)藕聯(lián)的OVA-CTB既可以增強機體對OVA對B細胞和T細胞的反應(yīng)，也能優(yōu)先誘導(dǎo)Th2反應(yīng)。從上述研究的中可以看出，CTB是一種有效的粘膜免疫載體蛋白。
人們意識到，針對自身免疫性疾病的治療性疫苗，如果能從粘膜免疫是較理想的，但粘膜多肽疫苗研究面臨一個難題就是粘膜途徑的疫苗免疫原性往往較弱，因而粘膜治療性疫苗成功的關(guān)鍵是如何提高疫苗的粘膜免疫原性。
p277多肽是治療動脈粥樣硬化的抗原，CTB又是具有很強免疫原性的載體蛋白，兩者融合表達形成融合蛋白，通過粘膜免疫的方式，就可以有效地增強p277的抗炎作用，從而達到治療動脈粥樣硬化的效果。
作為自身免疫性疾病的動脈粥樣硬化癥，免疫HSP65是一條有效的治療途徑。通過HSP65和CTB-P277在體外的化學(xué)藕聯(lián)，形成藕聯(lián)蛋白，再用其進行免疫，便可以大大增強藥效。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有治療動脈粥樣硬化作用的免疫調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的又一目的是提供生產(chǎn)該免疫調(diào)節(jié)劑的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供了該免疫調(diào)節(jié)劑的免疫途徑。
本發(fā)明的最終目的是公開該免疫調(diào)節(jié)劑的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種具有治療動脈粥樣硬化作用的免疫調(diào)節(jié)劑。作為本發(fā)明的一個具體實施方式
，該免疫調(diào)節(jié)劑的獲得是先將p277融合于CTB的C端形成融合蛋白，其氨基酸序列見SEQ ID NO.2。p277分子量小，免疫原性弱，直接用p277作免疫原很難在體內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。為增強多肽疫苗的免疫原性，必須采用大分子蛋白作為免疫載體，與p277在體內(nèi)融合表達。CTB是霍亂毒素B亞單位，是很好的免疫載體蛋白。p277與CTB融合表達就可以有效的增強p277的免疫原性，起到抗動脈粥樣硬化的作用。為了便于敘述，將這種融合蛋白表示為“CTB-p277”。HSP65是指源于用作卡介苗的分枝桿菌來源的熱激蛋白，國際基因庫登錄號是M17705。HSP65已被證實具有活化巨噬細胞和釋放諸多細胞因子的功能，不但具有較強的免疫原性，而且具有防治自身免疫性疾病的作用。HSP65是一種良好的免疫佐劑，將融合蛋白CTB-p277與HSP65進行化學(xué)藕聯(lián)，能強化多肽疫苗的免疫原性，不需添加佐劑就能激發(fā)機體產(chǎn)生強烈免疫應(yīng)答，從而達到治療動脈粥樣硬化的效果。將具有治療動脈粥樣硬化作用的免疫調(diào)節(jié)劑表示為“HSP65-CTB-p277”。
在本發(fā)明的第二方面，提供了生產(chǎn)該免疫調(diào)節(jié)劑的方法，其技術(shù)路線詳述如下1.HSP65基因的設(shè)計與獲得在不改變HSP65氨基酸序列的前提下，選用原核和真核生物均適用的密碼子，借助于計算機設(shè)計兩條寡聚核苷酸鏈，從市售的卡介苗提取的DNA中通過PCR法獲得HSP65基因的核苷酸序列，5’端添加了Nco I的識別位點，3’端添加了HindIII或Bgl II的識別位點。
2.p277基因的設(shè)計與獲得p277是人HSP60上的一段(437-460位VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED)氨基酸序列。我們將442和447位的C(半胱氨酸)用V(纈氨酸)來置換，以增強肽段的穩(wěn)定性，兩者具有相同的免疫特性。根據(jù)多肽p277氨基酸序列，選擇原核和真核生物均適用的密碼子，借助于計算機設(shè)計兩條寡核苷酸鏈，分別作為上游、下游引物，并在上游引物5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶BamHI的酶切位點，下游引物5’端加上終止密碼子和限制性核酸內(nèi)切酶HindIII的酶切位點，兩條引物互補序列為20個堿基，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法獲得p277多肽基因的核苷酸序列。
3.CTB基因的設(shè)計和獲得以pET28a-CTB質(zhì)粒為模板。為了便于載體的構(gòu)建，利用計算機輔助設(shè)計上、下游引物，上游引物添加Pag I識別位點，下游引物添加Nhe I識別位點，通過PCR方法，獲得所需的目的基因。
4.pED-HSP65重組工程菌的構(gòu)建Hsp65基因經(jīng)Nco I、HindIII切割插入經(jīng)Nco I、HindIII切割的pED質(zhì)粒載體中，組成融合表達的重組質(zhì)粒pED-HSP65，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
5.pED-p277重組基因工程菌的構(gòu)建p277基因經(jīng)BamHI、HindIII切割插入經(jīng)BamHI、HindIII切割的pED質(zhì)粒載體中，組成融合表達的重組質(zhì)粒pED-p277，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
6.pET28a-HSP65-p277重組基因工程菌的構(gòu)建HSP65基因經(jīng)Nco I、Bgl II切割插入經(jīng)Nco I、BamHI切割的pED-p277質(zhì)粒中，BglII和BamHI為同尾酶，組成融合表達的重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-p277(結(jié)構(gòu)示意圖見附圖1，5600bp)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21獲得重組基因工程菌。
7.pET28a-CTB-p277重組基因工程菌的構(gòu)建CTB基因經(jīng)過Pag I、Nhe I切割插入經(jīng)Nco I、Nhe I切割的pET28a-HSP65-p277質(zhì)粒中，Pag I和Nco I是同尾酶，組成融合表達的重組質(zhì)粒pET28a-CTB-p277，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21獲得重組基因工程菌。
8.工程菌發(fā)酵及HSP65-CTB-p277藕聯(lián)蛋白的獲得1)CTB-p277的獲得以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，玉米漿培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵參數(shù)如下溫度36-38℃，pH6.8-7.2。發(fā)酵后離心收集工程菌，反復(fù)凍融裂解菌體，獲得包含體，包含體經(jīng)過洗滌、裂解、復(fù)性，獲得復(fù)性蛋白，再經(jīng)DEAE陰離子交換柱層析純化，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(用非還原上樣緩沖液)，判斷純化的CTB-p277純度。HSP65為本實驗室保存。
2)HSP65-CTB-p277藕聯(lián)蛋白的獲得把HSP65和純化后的CTB-p277放在一起，PBS充分溶解，用0.3％的戊二醛溶液進行化學(xué)藕聯(lián)，攪拌過夜后，再滴加1M的甘氨酸終止多余的戊二醛溶液，裝入透析袋中透析。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(用非還原上樣緩沖液)，判斷HSP65-CTB-p277藕聯(lián)情況。
在本發(fā)明的第三方面是提供了該免疫調(diào)節(jié)劑的免疫途徑。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中的熱休克蛋白65(MT-HSP65)采用粘膜免疫途徑可以起到抗動脈粥樣硬化的效果。在本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑中，CTB是強烈的粘膜免疫載體蛋白，與p277融合后形成CTB-p277，也具有很強的粘膜免疫原性，HSP65和CTB-p277兩者藕聯(lián)后更進一步增強了疫苗的免疫原性，不需添加佐劑就能激發(fā)機體產(chǎn)生強烈免疫應(yīng)答，因而可以通過粘膜給藥來治療動脈粥樣硬化。利用鼻粘膜給藥進行粘膜免疫簡便易行，藥物經(jīng)鼻粘膜部豐富毛細血管吸收后直接進入體循環(huán)，使藥物不良反應(yīng)的發(fā)生機率大為降低，體液免疫是粘膜免疫效應(yīng)的主要過程，即產(chǎn)生分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，sIgA的多聚體結(jié)構(gòu)能增強其對抗原的親和力，而且sIgA表面特殊的糖成分或糖鏈有助于使其粘附于粘膜的表面和抵抗蛋白水解酶的消化作用。通過鼻粘膜給藥還可免受胃腸道中酶的破壞和肝臟對藥物的首過清除效應(yīng)，有利于提高生物利用度和血藥濃度，可極大地減少藥物用量。同時IgG，IgM，IgE等免疫球蛋白在粘膜反應(yīng)中也起著不可忽視的重要作用。
在本發(fā)明的第四方面是該免疫調(diào)節(jié)劑的用途。將該免疫調(diào)節(jié)劑直接免疫動物，能激發(fā)機體的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生p277的特異性抗體。在醫(yī)學(xué)上，該免疫調(diào)節(jié)劑能用于治療人動脈粥樣硬化。
圖1載體質(zhì)粒pET28a-HSP65-p277結(jié)構(gòu)框架圖。
圖2重組質(zhì)粒pET28a-CTB-p277結(jié)構(gòu)框架圖。
圖3重組質(zhì)粒pET28a-CTB-p277C端部分基因測序結(jié)果。
圖4 SDS-PAGE電泳顯示CTB-p277的融合表達和純化以及HSP65-CTB-p277藕聯(lián)蛋白的情況。1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2.載荷pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導(dǎo)后)；3.載荷pET28a-CTB-p277質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導(dǎo)后)；4.經(jīng)復(fù)性純化后的CTB-p277融合蛋白(用非還原上樣緩沖液)；5.HSP65-CTB-p277藕聯(lián)蛋白(用非還原上樣緩沖液)。
圖5 ELISA測定結(jié)果顯示HSP65-CTB-p277藕聯(lián)蛋白經(jīng)粘膜免疫能誘發(fā)新西蘭大白兔產(chǎn)生抗p277的抗體。圖列 正常組 PBS組 OVA組 HSP65組■HSP65-CTB-p277組圖6 Western-blotting檢測結(jié)果顯示HSP65-CTB-p277能誘發(fā)新西蘭大白兔產(chǎn)生抗p277抗體。A蛋白轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染色顯示相應(yīng)的蛋白條帶；B雜交后顯色結(jié)果。1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2.還原態(tài)rhVEGF-P277；3.氧化態(tài)rhVEGF-p277；4.還原態(tài)rhVEGF；5.氧化態(tài)rhVEGF。
圖7各組新西蘭大白兔第一次免疫后的第八周血清中總膽固醇含量。結(jié)果顯示除正常組外，HSP65-CTB-p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫組的總膽固醇水平要顯著低于PBS組和OVA組，HSP65給藥組總膽固醇的水平也有一定程度的降低。
具體實施例方式
(1)菌株，細胞系和質(zhì)粒宿主菌E.coliBL2l(Escherichia coliBL21)是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究有關(guān)的實驗室一般都有保存。
質(zhì)粒pET28a購自Novagen公司。
卡介苗由上海生物制品公司生產(chǎn)，該制品中含有牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)。
質(zhì)粒pET28a-HSP65、pET28a-HSP65-p277由本實驗室構(gòu)建并保存，HSP65蛋白也由本實驗室分離純化。
(2)酶和試劑分子克隆工具酶和試劑、細菌基因組、質(zhì)粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產(chǎn)品PCR回收試盒和瓊脂糖膠回收試劑盒為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品。
(3)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，配方見參考文獻Salmbrook J，F(xiàn)ristsh EF，Maniatis T.MolecularCloningA Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。
玉米漿培養(yǎng)基含有玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
(4)Cellouse-DEAE DE-52為Whatman公司產(chǎn)品。
(5)辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗為武漢博士德公司產(chǎn)品。
(6)3、3’、5、5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、過氧化氫尿素和牛血清白蛋白(BSA)為美國西格馬(sigma)公司產(chǎn)品。
(7)96孔酶標(biāo)板為美國康寧(Corning)公司產(chǎn)品。
(8)硝酸纖維素膜為美國Millipore公司產(chǎn)品。
(9)測定血清中血糖濃度的儀器為Hitachi Automatic Analyzer(Model-7150，Tokyo，Janpan)。
方法分子生物學(xué)操作方法質(zhì)粒提取、聚合酶鏈反應(yīng)、限制性核酸內(nèi)切酶酶切、DNA片斷的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌在基因工程研究領(lǐng)域，這些都是常規(guī)操作方法，參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYColdspringHarborLaboratoryPress，1989，pp.16-340。
重組蛋白表達量的測定參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法進行。
實施例1CTB-p277多肽基因的設(shè)計、合成和克隆1.CTB基因的獲得在不改變CTB基因的前提下，以pET28a-CTB質(zhì)粒為模板，利用計算機輔助設(shè)計上游引P1和下游引物P2。由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。pET28a-CTB質(zhì)粒由中國藥科大學(xué)微生物教研室惠贈。
上游引物P15’GGGTCATGACACCTCAAAATATTACTG 3’PagI下游引物P25’AAAGCTAGCATTTGCCATACTAATTGCGGCAATCGC 3’NheI上游引物P1中引入PagI酶切位點，下游引物P2中引入NheI酶切位點。
以pET28a-CTB質(zhì)粒為模板，P1和P2分別為上下游引物進行PCR擴增。
PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；然后以94℃變性1min，52℃退火50s，72℃延伸1min，循環(huán)數(shù)30個；最后再72℃延伸10min。其產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，獲得CTB基因。
2.質(zhì)粒pET28a-CTB-p277的構(gòu)建將純化后得CTB基因用PagI和NheI限制性內(nèi)切酶進行酶切，酶切產(chǎn)物用PCR純化試劑盒純化。采用堿裂解法對pET28a-HSP65-p277進行抽提，抽提得到的質(zhì)粒用NcoI和NheI進行雙酶切。酶切反應(yīng)結(jié)束后用膠回收純化試劑盒回收大片段。
將上述酶切回收后得到的CTB片段和pET28a-HSP65-p277質(zhì)粒大片段進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)，通過PCR驗證，篩選含CTB-p277融合蛋白基因的重組質(zhì)粒，稱pET28a-CTB-p277(結(jié)構(gòu)示意圖見附圖2，4520bp)。將該質(zhì)粒委托上海博亞生物技術(shù)有限公司進行核酸的序列分析，進一步驗證CTB-p277融合蛋白基因及其讀碼框的正確性，其測序結(jié)果見附圖3。
實施例2CTB-p277基因在大腸桿菌中的表達將重組質(zhì)粒pET28a-CTB-p277轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。從生長有不同轉(zhuǎn)化子平板上挑取單菌落接種含有50ug/ml卡那霉素LB液體培養(yǎng)基，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，按1％比例轉(zhuǎn)接種入新鮮的玉米漿液體培養(yǎng)基(50ug/ml卡那霉素)中，37℃培養(yǎng)4小時后，加入終濃度為0.5mmol/L的α-乳糖誘導(dǎo)大腸桿菌表達T7RNA聚合酶，繼續(xù)培養(yǎng)從而表達融合蛋白CTB-p277。誘導(dǎo)后6小時取少量菌液，離心回收菌體，SDS-PAGE電泳再經(jīng)薄層掃描顯示已經(jīng)實現(xiàn)了CTB-p277多肽基因的融合表達。融合蛋白占細菌總蛋白的40％左右，結(jié)果見圖4泳道3。
實施例3重組蛋白CTB-p277的分離純化誘導(dǎo)表達后的工程菌經(jīng)離心回收菌體，每10g濕菌體懸浮于50ml的50mmol/L Tris-HCl緩沖液中，每克濕菌加80μl溶菌酶(10mg/ml)，再加入Triton X-100至終濃度為0.5％，于37℃振搖過夜。每克濕菌加0.5μl Dnase I(1mg/ml)，于37℃繼續(xù)振搖45min。10000r/min，離心15min，目標(biāo)蛋白形成包含體，出現(xiàn)在沉淀中，棄上清。
按每克包含體濕重加入10ml洗滌液I，使沉淀重新懸浮均勻后，離心后棄上清，沉淀再加入洗滌液II按同樣的方法洗滌，最后用蒸餾水洗去殘留的洗滌液II，沉淀備用，取部分沉淀用15％SDS-PAGE檢測。洗滌液I50mmol/L Tris-HCl緩沖液，0.2％ Triton X-100；洗滌液II2mol/L的尿素。
洗滌后的包含體沉淀，按每克濕重加入10ml的8mol/L的尿素溶液，再加入β巰基乙醇至終濃度為1％，用磁力攪拌子攪拌6h以上，使沉淀重新溶解和懸浮于尿素溶液中。離心后棄沉淀，收集上清。
將上述收集的上清液依次對6mol/L，4mol/L，2mol/L，1mol/L，0.5mol/L的尿素溶液(以50mmol/L Tris-HCl緩沖液溶解)透析，透析液中加入還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽至終濃度分別為2mmol/L和0.4mmol/L。每隔8h換一次液，共透析48h。
復(fù)性后透析液進行陰離子交換柱層析，DEAE纖維素DE-52柱(2.6×40cm)，用離子交換緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.0)/NaCl梯度洗脫，分段收集進行SDS-PAGE電泳檢測，CTB-p277在100-120mM NaCl的洗脫峰中，用SDS-PAGE電泳(用非還原上樣緩沖液)檢查制備樣品的純度，結(jié)果見附圖4泳道4。
實施例4HSP65-CTB-p277藕聯(lián)蛋白的獲得將本實驗室保存的HSP65和純化后的CTB-p277放在一個小燒杯中用PBS充分溶解，緩慢滴加0.3％的戊二醛溶液進行化學(xué)藕聯(lián)，于4℃層析柜中攪拌過夜后，再滴加1M的甘氨酸終止多余的戊二醛溶液，30min后，裝入透析袋中透析36小時。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(用非還原上樣緩沖液)檢查樣品的藕聯(lián)情況。結(jié)果見附圖4泳道5。
實施例5HSP65-CTB-p277藕聯(lián)蛋白的免疫原性研究選用5周齡的雄性新西蘭大白兔，隨機分成五組，每組八只，分別是HSP65-CTB-p277藕聯(lián)蛋白鼻腔粘膜免疫組，HSP65蛋白鼻腔粘膜免疫組，PBS空白對照組，卵清蛋白滴鼻對照組，正常對照組。除正常組外，其余各組都喂飼高膽固醇食物。分別于第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19d免疫，蛋白都用PBS溶解，不加其他佐劑，每次免疫劑量為200μg/只。在第一次給藥時耳緣靜脈取第一次血，后每隔兩周取血一次，共五次。血量為1.0-1.5ml，離心，取血清冷凍保存。
用純化的重組人血管內(nèi)皮生長因子121和p277的融合蛋白(rhVEGF-p277)4℃過夜包被96孔ELISA酶標(biāo)板，每孔100μl含50μg融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃滿孔封閉一小時。免疫后取血所得抗血清用5％BSA(于pH7.5的PBS中)稀釋100倍，然后每孔加入100μl稀釋后的抗血清于37℃作用1小時。用PBST(含0.1％Tween-20)和自來水間隔洗滌6次后加入100μl以1∶20000稀釋的羊抗小鼠IgG二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)，每孔100μl，37℃作用1小時。PBST和自來水間隔洗滌6次，每孔加入100μl過氧化氫尿素和3，3’-5，5’一四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液于37℃顯色30分鐘后，加入50μl 2M H2SO4終止反應(yīng)，并于450nm波長下，測定各孔吸光度值。從結(jié)果中可以看出，HSP65-CTB-p277鼻腔粘膜給藥組新西蘭大白兔體內(nèi)能產(chǎn)生特異性的抗p277抗體值明顯優(yōu)于其他組。結(jié)果見附圖5。
實施例6抗p277特異抗體的Western檢測將純化后的rhVEGF、還原態(tài)rhVEGF-p277和氧化態(tài)rhVEGF-p277用15％ SDS-PAGE電泳后，于30V電壓電泳過夜轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后以5％BSA溶液室溫封閉2小時。實施例5和例6中所得抗血清稀釋20倍后，與硝酸纖維素膜上的抗原于37℃作用1小時后，以pH7.5TBS緩沖液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；加入稀釋400倍的羊抗小鼠或兔IgG(辣根過氧化物酶標(biāo)記)二抗，于37℃作用1小時，再以pH7.5TBS緩沖液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；最后，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色。具體操作方法參考Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.888-898。氧化態(tài)rhVEGF-p277(泳道3)由于其鏈間二硫鍵的作用，部分蛋白質(zhì)形成二聚體，在PAGE膠上表現(xiàn)為分子量分別為17kD和34kD的雙條帶，還原態(tài)rhVEGF-p277(泳道2)為單體，在膠上表現(xiàn)為分子量為16kD的單條帶。由于新西蘭大白兔血清中有抗p277抗體的存在，因此可以分別和膜上16kD和32kD的rhVEGF-p277蛋白帶雜交，但不和rhVEGF雜交(泳道4和5)，證實了HSP65-CTB-p277實驗組能誘發(fā)新西蘭大白兔體內(nèi)產(chǎn)生特異的抗p277的抗體。結(jié)果見附圖6。
實施例7HSP65-CTB-p277藕聯(lián)蛋白的藥效學(xué)研究選用5周齡的雄性新西蘭大白兔，隨機分成五組，每組八只，分別是HSP65-CTB-p277藕聯(lián)蛋白鼻腔粘膜免疫組，HSP65蛋白鼻腔粘膜免疫組，PBS空白對照組，卵清蛋白滴鼻對照組，正常對照組。除正常組外，其余各組都喂飼高膽固醇食物。分別于第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19d免疫，蛋白都用PBS溶解，不加其他佐劑，每次免疫劑量為200μg/只。在第一次給藥后的第八周進行耳緣靜脈取血，血量為1.0-1.5ml，離心，取血清5小時內(nèi)用全自動生化分析儀測定總膽固醇的含量。結(jié)果見附圖7。從測得的總膽固醇水平來看，除正常組外，HSP65-CTB-p277給藥組總膽固醇的水平最低，效果最好，更利于治療動脈粥樣硬化。HSP65對動脈粥樣硬化也有一定的治療作用。
SEQUENCE LISTING<110>中國藥科大學(xué)<120>一種免佐劑具有治療動脈粥樣硬化作用的免疫調(diào)節(jié)劑<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>24<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp1 5 10 15Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp20<210>2<211>133<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>
<400>2Met Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr1 5 10 15
Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu20 25 30Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile35 40 45Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys50 55 60Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu65 70 75 80Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala85 90 95Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Ala Ser Ala Asp Pro Val Leu Gly100 105 110Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Thr115 120 125Pro Ala Asn Glu Asp130
權(quán)利要求
1.一種免佐劑具有治療動脈粥樣硬化作用的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于該免疫調(diào)節(jié)劑是將源于HSP60的抗原表位多肽p277基因與霍亂毒素B亞單位(Cholera toxin B subunit，CTB)基因融合形成的融合蛋白。該融合蛋白與熱休克蛋白65(Heat shock protein 65，HSP65)化學(xué)藕聯(lián)形成藕聯(lián)蛋白。
2.按照權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于該免疫調(diào)節(jié)劑中含有一段源于人HSP60的抗原表位多肽p277，p277的氨基酸序列是VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。
3.根據(jù)權(quán)利1、2和3所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于該調(diào)節(jié)劑是一段SEQ ID NO.1結(jié)構(gòu)的序列融合到霍亂毒素B亞單位C端所形成的多肽，具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
4.按照權(quán)利1所述的治療粥樣硬化作用的免疫調(diào)節(jié)劑，可以表示為HSP65-CTB-p277。其特征在于HSP65攜帶有CTB-p277融合蛋白。
5.一種免佐劑具有治療動脈粥樣硬化作用的免疫調(diào)節(jié)劑的制備方法，包括用PCR法合成CTB的編碼序列DNA，將這些DNA分步插入表達載體，在大腸桿菌中表達出CTB-p277融合蛋白，經(jīng)包含體的洗滌、裂解、復(fù)性、陰離子交換樹脂DEAE纖維素純化，再經(jīng)融合蛋白與HSP65的化學(xué)藕聯(lián)，得到治療人動脈粥樣硬化的免疫調(diào)節(jié)劑。
6.按照權(quán)利要求5所述得到的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于不需添加佐劑，通過粘膜免疫途徑能誘發(fā)機體產(chǎn)生HSP65和p277特異的免疫應(yīng)答。
7.按照權(quán)利要求5所述得到的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于能顯著抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生，能夠起到治療動脈粥樣硬化的作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述得到的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于可與藥物載體或藥物活性成分組合制成藥物組。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能用于治療動脈粥樣硬化的免疫調(diào)節(jié)劑。針對抗原多肽的弱免疫原性，將源于人HSP60的一段抗原表位多肽(SEQ ID NO.1)插入霍亂毒素B亞單位(Cholera toxinB subunit，CTB)的下游，實現(xiàn)了抗原表位多肽與CTB的融合表達。產(chǎn)生的融合蛋白(CTB－p277)與熱休克蛋白65(Heat shock protein 65，HSP65)化學(xué)藕聯(lián)，無需使用佐劑，直接用于免疫。該藕聯(lián)蛋白通過粘膜免疫途徑可激發(fā)機體產(chǎn)生高滴度針對p277的抗體，顯著抑制新西蘭大白兔動脈粥樣硬化的發(fā)生，能夠起到治療動脈粥樣硬化的作用。
文檔編號A61P9/10GK101036786SQ20071001991
公開日2007年9月19日 申請日期2007年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日
發(fā)明者劉景晶, 李建平, 熊祺焱, 陳慶梅, 吳潔, 曹榮月 申請人:中國藥科大學(xué)