專利名稱：一株無毒2型豬鏈球菌及其制備方法、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬細(xì)菌類，具體說是一株無毒2型豬鏈球菌(Strep tococcus suis serotype2)及其制備方法，以及在豬鏈球菌病疫苗研制中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2型豬鏈球菌(Streptococcus suis，簡稱S.suis)是一種重要的人獸共患病病原體。豬群對2型S.suis普遍易感，感染后可致急性敗血癥、肺炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎及急性死亡等，如不及時治療病死率達(dá)40％；病后存活的豬生長緩慢，存欄時間大為延長。近年我國南方省份的豬群中2型S.suis流行日趨嚴(yán)重，時有較大規(guī)模暴發(fā)，每年造成的經(jīng)濟損失達(dá)十億元。該病原感染人類可導(dǎo)致腦膜炎、敗血癥等嚴(yán)重疾患。1998及2005年分別在我國江蘇和四川資陽人群中發(fā)生暴發(fā)流行，病人中出現(xiàn)高比例的、國外罕見的中毒性休克綜合征，病情兇險，病死率高(60％～80％)，引發(fā)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。目前，國內(nèi)外尚無理想的適合動物和人使用的疫苗，相關(guān)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究對于該病的預(yù)防和控制具有重要意義。
傳統(tǒng)的疫苗包括滅活疫苗和減毒活疫苗。滅活疫苗是經(jīng)滅活的全菌體死疫苗，其最大的有點是制備與生產(chǎn)容易，且穩(wěn)定、易保存；但缺點是需多次接種、接種劑量大、接種后局部或全身毒、副反應(yīng)明顯，且有的疫苗保護(hù)作用欠佳。減毒活疫苗的優(yōu)點是只需接種一次，接種劑量小，免疫效果較好，且免疫力教持久；缺點是不穩(wěn)定、難保存，且可能出現(xiàn)毒力的回復(fù)突變。以上兩種疫苗都是以全菌體為基礎(chǔ)的疫苗，它們的共同缺點是注入體內(nèi)的抗原組分多而復(fù)雜，有許多組分其實是非保護(hù)性抗原。這些非保護(hù)性抗原組分的存在，一是干擾了機體對保護(hù)性抗原的應(yīng)答(有時對非保護(hù)性抗原的應(yīng)答成為主要應(yīng)答，而保護(hù)性抗原是非主要應(yīng)答甚至無應(yīng)答)；二是非保護(hù)性抗原的存在可能帶來嚴(yán)重的免疫毒副反應(yīng)，如發(fā)燒、免疫性疾病等。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述不足之處提供一株無毒2型豬鏈球菌及其制備方法、應(yīng)用，從健康豬群中分離出一株無毒2型豬鏈球菌，為篩選2型豬鏈球菌蛋白性保護(hù)性抗原打下基礎(chǔ)。經(jīng)PCR法鑒定、形態(tài)學(xué)觀察和血清學(xué)實驗，證實該分離株為2型豬鏈球菌。
經(jīng)動物實驗，證實該菌株以108從耳靜脈注射實驗豬后無病理反應(yīng)，而以05年四川分離的強毒株05ZYH33為陽性對照等量注射實驗豬先后死亡，最快可在24小時內(nèi)猝死。結(jié)果表明，該分離株為2型豬鏈球菌無毒株。
基于系統(tǒng)生物學(xué)和反向遺傳學(xué)方法，擬對2型S.suis無毒株與強毒株的全基因組序列進(jìn)行比較，采用生物信息學(xué)方法全面分析并鑒定出我國流行區(qū)2型S.suis毒力株的保護(hù)性抗原組分，為該菌疫苗走向應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
細(xì)胞特征該菌屬于球菌科、鏈球菌屬，為革蘭氏陽性菌，呈卵圓形，成雙或以短鏈形式存在，兼性厭氧，在5％綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24小時，菌落直徑達(dá)1～2mm，呈淺灰色或半透明，稍帶粘液樣，在不同動物的血平板上能產(chǎn)生各種類型的溶血環(huán)，但主要是α-溶血。部分菌株周圍無溶血區(qū)帶，但把菌落從血平板上移去，可見α-溶血或β-溶血。2型豬鏈球菌在綿羊血瓊脂平板上產(chǎn)生明顯的α-溶血，在馬血瓊脂平板上為β-溶血。
目前該2型豬鏈球菌菌種保藏在中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心，本保藏中心登記入冊編號是CGMCC No.1902，分類命名豬鏈球菌(2型)，菌種的拉丁學(xué)名是Streptococcus suis，參據(jù)的微生物(株)05JYS68，保藏日期是2006年12月18日。
一株無毒2型豬鏈球菌制備方法1.增菌培養(yǎng)用棉拭子從健康豬的咽、鼻部采集樣本，放入裝有0.5ml的THB培養(yǎng)基(Todd Hewitt Broth，BactoTM)中，旋渦振蕩器上混勻之后，30℃～39℃靜置培養(yǎng)3～6小時。
2.純化分離將上述培養(yǎng)的雜菌用常規(guī)方法提取總DNA作為模板，用針對2型莢膜多糖(cps2)基因設(shè)計的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，結(jié)果為陽性的樣本確定為含有2型豬鏈球菌。采用平板劃線法，從陽性樣本中挑取單菌落，再進(jìn)行增菌培養(yǎng)，經(jīng)過PCR、革蘭氏染色和血清凝集實驗，確定所分離的菌株為2型豬鏈球菌，命名為05JYS68。
3.動物實驗為證實該2型豬鏈球菌分離株為無毒株，將其增菌后以108從耳靜脈注射3只健康長白仔豬，同時設(shè)置以05年四川分離的強毒株05ZYH33為陽性對照。結(jié)果，注射05JYS68的實驗豬基本無病理反應(yīng)，而注射05ZYH33的實驗豬先后死亡，最快可在24小時內(nèi)猝死。結(jié)果表明，該分離株05JYS68為2型豬鏈球菌無毒株。
全基因組序列測定為獲得2型豬鏈球菌無毒株05JYS68的更多信息，以便為豬鏈球菌疫苗研制打下基礎(chǔ)，我們對其全基因組進(jìn)行了測序，證實這是一株2型豬鏈球菌，而且與強毒株基因組相似性較大，適合用于疫苗研究與生產(chǎn)。然后，基于系統(tǒng)生物學(xué)和反向遺傳學(xué)方法，擬對2型豬鏈球菌無毒株與強毒株的全基因組序列進(jìn)行比較，采用生物信息學(xué)方法全面分析并鑒定出我國流行區(qū)2型豬鏈球菌毒力株的保護(hù)性抗原組分，為該菌疫苗走向應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
一株無毒2型豬鏈球菌在豬鏈球菌病疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明的突出優(yōu)點1.該菌種從健康豬群分離，對人和動物無任何危害。
2.用該菌進(jìn)行動物免疫實驗，證實其對豬鏈球菌病具有很強的保護(hù)性。
3.與強毒株基因組相似性較大，適合用于疫苗研究與生產(chǎn)。
具體實施例方式
實施例1一株無毒2型豬鏈球菌制備方法、應(yīng)用1.增菌培養(yǎng)用棉拭子從健康豬的咽、鼻部采集樣本，放入裝有0.5ml的THB培養(yǎng)基(Todd Hewitt Broth，BactoTM)中，旋渦振蕩器上混勻之后，30℃靜置培養(yǎng)6小時。
2.純化分離將上述培養(yǎng)的雜菌用常規(guī)方法提取總DNA作為模板，用針對2型莢膜多糖(cps2)基因設(shè)計的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，結(jié)果為陽性的樣本確定為含有2型豬鏈球菌。采用平板劃線法，從陽性樣本中挑取單菌落，再進(jìn)行增菌培養(yǎng)，經(jīng)過PCR、革蘭氏染色和血清凝集實驗，確定所分離的菌株為2型豬鏈球菌，命名為05JYS68。
3.動物實驗為證實該2型豬鏈球菌分離株為無毒株，將其增菌后以108從耳靜脈注射3只健康長白仔豬，同時設(shè)置以05年四川分離的強毒株05ZYH33為陽性對照。結(jié)果，注射05JYS68的實驗豬基本無病理反應(yīng)，而注射05ZYH33的實驗豬先后死亡，最快可在24小時內(nèi)猝死。結(jié)果表明，該分離株05JYS68為2型豬鏈球菌無毒株。
4.全基因組序列測定為獲得2型豬鏈球菌無毒株05JYS68的更多信息，以便為豬鏈球菌疫苗研制打下基礎(chǔ)，我們對其全基因組進(jìn)行了測序，證實這是一株2型豬鏈球菌，而且與強毒株基因組相似性較大，適合用于疫苗研究與生產(chǎn)。然后，基于系統(tǒng)生物學(xué)和反向遺傳學(xué)思法，擬對2型豬鏈球菌無毒株與強毒株的全基因組序列進(jìn)行比較，采用生物信息學(xué)方法全面分析并鑒定出我國流行區(qū)2型豬鏈球菌毒力株的保護(hù)性抗原組分，為該菌疫苗走向應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
實施例2一株無毒2型豬鏈球菌制備方法、應(yīng)用1.增菌培養(yǎng)用棉拭子從健康豬的咽、鼻部采集樣本，放入裝有0.5ml的THB培養(yǎng)基(Todd Hewitt Broth，BactoTM)中，旋渦振蕩器上混勻之后，37℃靜置培養(yǎng)4小時。
2.純化分離將上述培養(yǎng)的雜菌用常規(guī)方法提取總DNA作為模板，用針對2型莢膜多糖(cps2)基因設(shè)計的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，結(jié)果為陽性的樣本確定為含有2型豬鏈球菌。采用平板劃線法，從陽性樣本中挑取單菌落，再進(jìn)行增菌培養(yǎng)，經(jīng)過PCR、革蘭氏染色和血清凝集實驗，確定所分離的菌株為2型豬鏈球菌，命名為05JYS68。
3.動物實驗為證實該2型豬鏈球菌分離株為無毒株，將其增菌后以108從耳靜脈注射3只健康長白仔豬，同時設(shè)置以05年四川分離的強毒株05ZYH33為陽性對照。結(jié)果，注射05JYS68的實驗豬基本無病理反應(yīng)，而注射05ZYH33的實驗豬先后死亡，最快可在24小時內(nèi)猝死。結(jié)果表明，該分離株05JYS68為2型豬鏈球菌無毒株。
4.全基因組序列測定為獲得2型豬鏈球菌無毒株05JYS68的更多信息，以便為豬鏈球菌疫苗研制打下基礎(chǔ)，我們對其全基因組進(jìn)行了測序，證實這是一株2型豬鏈球菌，而且與強毒株基因組相似性較大，適合用于疫苗研究與生產(chǎn)。然后，基于系統(tǒng)生物學(xué)和反向遺傳學(xué)思法，擬對2型豬鏈球菌無毒株與強毒株的全基因組序列進(jìn)行比較，采用生物信息學(xué)方法全面分析并鑒定出我國流行區(qū)2型豬鏈球菌毒力株的保護(hù)性抗原組分，為該菌疫苗走向應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
實施例3一株無毒2型豬鏈球菌制備方法1.增菌培養(yǎng)用棉拭子從健康豬的咽、鼻部采集樣本，放入裝有0.5ml的THB培養(yǎng)基(Todd Hewitt Broth，BactoTM)中，旋渦振蕩器上混勻之后，39℃靜置培養(yǎng)3小時。
2.純化分離將上述培養(yǎng)的雜菌用常規(guī)方法提取總DNA作為模板，用針對2型莢膜多糖(cps2)基因設(shè)計的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，結(jié)果為陽性的樣本確定為含有2型豬鏈球菌。采用平板劃線法，從陽性樣本中挑取單菌落，再進(jìn)行增菌培養(yǎng)，經(jīng)過PCR、革蘭氏染色和血清凝集實驗，確定所分離的菌株為2型豬鏈球菌，命名為05JYS68。
3.動物實驗為證實該2型豬鏈球菌分離株為無毒株，將其增菌后以108從耳靜脈注射3只健康長白仔豬，同時設(shè)置以05年四川分離的強毒株05ZYH33為陽性對照。結(jié)果，注射05JYS68的實驗豬基本無病理反應(yīng)，而注射05ZYH33的實驗豬先后死亡，最快可在24小時內(nèi)猝死。結(jié)果表明，該分離株05JYS68為2型豬鏈球菌無毒株。
4.全基因組序列測定為獲得2型豬鏈球菌無毒株05JYS68的更多信息，以便為豬鏈球菌疫苗研制打下基礎(chǔ)，我們對其全基因組進(jìn)行了測序，證實這是一株2型豬鏈球菌，而且與強毒株基因組相似性較大，適合用于疫苗研究與生產(chǎn)。然后，基于系統(tǒng)生物學(xué)和反向遺傳學(xué)思法，擬對2型豬鏈球菌無毒株與強毒株的全基因組序列進(jìn)行比較，采用生物信息學(xué)方法全面分析并鑒定出我國流行區(qū)2型豬鏈球菌毒力株的保護(hù)性抗原組分，為該菌疫苗走向應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
一株無毒2型豬鏈球菌在豬鏈球菌病疫苗中的應(yīng)用用該菌進(jìn)行動物免疫實驗，證實其對豬鏈球菌病具有很強的保護(hù)性。即先用該菌對實驗動物進(jìn)行三次免疫，每周一次，然后用2型豬鏈球菌強毒株皮下注射攻擊動物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)動物無病死現(xiàn)象，除關(guān)節(jié)炎外無其它臨床病理反應(yīng)，而未用該菌免疫的動物用強毒株攻擊后全部死亡，這說明該無毒2型豬鏈球菌菌株對豬鏈球菌病有明顯的保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.一株無毒2型豬鏈球菌Streptococcus suis(Serotype2)05JYS68，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號是CGMCC No.1902。
2.權(quán)利要求1所述的一株無毒2型豬鏈球菌的制備方法，其特征在于(1)增菌培養(yǎng)用棉拭子從健康豬的咽、鼻部采集樣本，放入裝有0.5ml的THB培養(yǎng)基(Todd Hewitt Broth，BactoTM)中，旋渦振蕩器上混勻之后，30℃～39℃靜置培養(yǎng)3～6小時；(2)純化分離將上述培養(yǎng)的雜菌用常規(guī)方法提取總DNA作為模板，用針對2型莢膜多糖(cps2)基因設(shè)計的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，結(jié)果為陽性的樣本確定為含有2型豬鏈球菌；采用平板劃線法，從陽性樣本中挑取單菌落，再進(jìn)行增菌培養(yǎng)，經(jīng)過PCR、革蘭氏染色和血清凝集實驗，確定所分離的菌株為2型豬鏈球菌，命名為05JYS68；(3)動物實驗為證實該2型豬鏈球菌分離株為無毒株，將其增菌后以108從耳靜脈注射3只健康長白仔豬，同時設(shè)置以05年四川分離的強毒株05ZYH33為陽性對照，結(jié)果，注射05JYS68的實驗豬基本無病理反應(yīng)，而注射05ZYH33的實驗豬先后死亡，最快可在24小時內(nèi)猝死，結(jié)果表明，該分離株05JYS68為2型豬鏈球菌無毒株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一株無毒2型豬鏈球菌的制備方法，其特征在于從健康豬的咽、鼻部采集菌群，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、形態(tài)學(xué)觀察、血清學(xué)實驗及動物實驗證明所分離到的菌株為2型豬鏈球菌無毒株。
4.權(quán)利要求1所述的一株無毒2型豬鏈球菌在豬鏈球菌病疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬細(xì)菌類，具體說是一株無毒2型豬鏈球菌及其制備方法，以及在豬鏈球菌病疫苗研制中的應(yīng)用。一株無毒2型豬鏈球菌Streptococcus suis(Serotype 2)05JYS68，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號是CGMCCNo.1902。其制備方法為用棉拭子從健康豬的咽、鼻部采集樣本，放入THB培養(yǎng)基中混勻，30℃～39℃靜置培養(yǎng)3～6小時；將其用常規(guī)方法提取總DNA作為模板，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、平板劃線法、革蘭氏染色和血清凝集實驗，確定所分離的菌株為2型豬鏈球菌，命名為05JYS68；為證實該分離菌株為無毒株，將其注射實驗豬，結(jié)果基本無病理反應(yīng)，表明該分離株05JYS68為無毒的2型豬鏈球菌株。
文檔編號A61P31/04GK101020894SQ20071001935
公開日2007年8月22日 申請日期2007年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月17日
發(fā)明者唐家琪, 王長軍, 鄭峰, 潘秀珍 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所