專利名稱：癌性疾病調(diào)節(jié)抗體的制作方法
癌性疾病調(diào)節(jié)抗體引用的相關(guān)申請本申請要求2005年8月2日遞交的申請?zhí)枮?0/704,647的臨時申 請的權(quán)益，將其內(nèi)容通過引用并入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及癌性疾病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)的分離和制備，以及 CDMAB在診斷和治療過程中的應(yīng)用，任選地與一種或多種化學(xué)治療 劑聯(lián)合使用。本發(fā)明進一步涉及利用本發(fā)明的CDMAB進行的結(jié)合活性測定。發(fā)明背景用于癌癥治療的單克隆抗體每個患有癌癥的個體都是獨特的，正如人的身份有所差異一樣，其患有的癌癥也不同于其他癌癥。盡管如此，目前的治療對于同一時期的同類型腫瘤采用相同的方式。至少30%的患者的一線治療是失敗的，這樣就造成更多輪次的治療，增加了治療失敗、腫瘤轉(zhuǎn)移及最終死亡的可能性。 一種優(yōu)越的治療方式應(yīng)該是針對特定個體的個體化治療。目前唯一采用個體化治療的方式是外科手術(shù)?；熀头暖煵荒茚槍颊吡可矶ㄗ?，而在大多數(shù)情況下， 手術(shù)本身并不足以治愈癌癥。隨著單克隆抗體的問世，開發(fā)個體化治療的可能性變得更為現(xiàn)實， 因為每種抗體對應(yīng)單一的抗原決定簇。而且，制備針對多個抗原決定 簇布局的抗體組合成為可能，該多個抗原決定簇唯一確定了某一特定 個體的腫瘤。認識到癌細胞和正常細胞的顯著差異在于癌細胞含有轉(zhuǎn)化細胞特 異的抗原，科學(xué)界長期認為可以設(shè)計出特異性與這些癌抗原結(jié)合的單 克隆抗體，以特異性作用于轉(zhuǎn)化細胞；這樣就產(chǎn)生了這樣一種觀點單克隆抗體能夠作為"魔術(shù)子彈，，消除癌細胞。然而，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛 地認識到單一的單克隆抗體不能用于癌癥的所有情形，單克隆抗體可 以按類來開發(fā)，用來治療目標癌癥。依照本發(fā)明公開的方法分離出的 單克隆抗體已經(jīng)顯示出能夠以有利于患者的方式改善癌性疾病過程， 如降低腫瘤負荷，并且在本文中這些單克隆抗體將分別被稱為癌性疾病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)或"抗癌"抗體。目前，癌癥患者通?？蛇x擇的治療方式很少。目前的治療方式已 經(jīng)改善了總體存活率和發(fā)病率。然而，對特定的個體來說，這些改善 的統(tǒng)計數(shù)據(jù)與他們個人情況的改善并無必然關(guān)系。因此，如果提出一種方法學(xué)，使醫(yī)生能夠在同組患者中，獨立于 其他患者治療每例肺瘤，這就使根據(jù)個人進行量身定做的獨特治療成 為可能。這樣一種治療方式在理論上可以增加治愈率，產(chǎn)生更好的效 果，從而滿足長期的需要。從歷史上來看，多克隆抗體的應(yīng)用在治療人類癌癥的方面取得的 成功有限。 一直用人類的血漿來治療淋巴瘤和白血病，但很少有長期 的好轉(zhuǎn)或反應(yīng)。而且，這種治療方法重復(fù)性差，與化療相比，沒有更 多的益處。像乳癌、黑色素瘤和腎細胞癌等實體腫瘤也用人類血液、 黑猩猩的血清、人類血漿和馬血清來治療過，但相應(yīng)的結(jié)果是不可預(yù) 測和無歲文的。有很多用單克隆抗體治療實體腫瘤的臨床試驗。在20世紀80年 代，就有至少四項針對人類乳腺癌的臨床試驗，在使用了針對特定抗 原或基于組織特異性的抗體的至少47個患者中，只產(chǎn)生了一名應(yīng)答 者。直到1998年，才有了一次成功的臨床試驗，該試驗聯(lián)合使用人源 化的抗Her2/neu抗體(Herceptit^)與順鉑。在這項試驗中，對37個患 者的反應(yīng)進行了評估，大約有四分之一的患者有部分反應(yīng)，另外四分 之一有輕微的或穩(wěn)定的病情發(fā)展。在反應(yīng)者中，中位腫瘤進展時間(median time to progression)是8.4個月，其中中位反應(yīng)持續(xù)時間(median response duration)是5.3個月。Herceptii^在1998年被批準作為一線用藥與Taxo產(chǎn)聯(lián)合使用。臨 床試驗結(jié)果表明，與單獨接受Taxo產(chǎn)治療的人群的中位疾病進展時間(3.0月)相比，抗體治療與Taxo^的聯(lián)合應(yīng)用增加了患者的中位疾病進 展時間(6.9月)。Herceptii^與Taxof的聯(lián)合應(yīng)用在中位存活時間方面 也有輕微增加，單獨使用Taxo^是18個月，Herceptii^與Taxo產(chǎn)聯(lián)合 應(yīng)用的存活期是22個月。除此之外，Herceptii^與Taxol⑧聯(lián)合應(yīng)用與 單獨使用Taxo^相比，無論在完全應(yīng)答者(8: 2)，還是在部分應(yīng)答者 (34: 15)的數(shù)量方面都有增加。然而與單獨使用Taxo產(chǎn)相比，Herceptin 與Taxo產(chǎn)的聯(lián)合應(yīng)用導(dǎo)致了較高的心血管毒性發(fā)病率，兩者分別是1% 和13%。 Herceptii^治療也只對那些過表達人類表皮生長因子受體 2(Her2/neu)(通過免疫組化分析來確定)的患者有效，Her2/neu是一種目 前還不知其功能或生物學(xué)重要配體的受體；大約25%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌 患者過表達Her2/neu。因此遠遠不能滿足患乳腺癌的患者的治療需求。 即便那些從Herceptii^治療中受益的患者仍然需要化療，隨后還需要 不得不處理這類治療至少在一定程度上帶來的副作用。研究結(jié)腸直腸癌的臨床試驗涉及到針對糖蛋白和糖脂靶標的抗 體。對腺癌有某些特異性的諸如17-lA等抗體已經(jīng)進入了 II期臨床試 驗，其中60多個患者中，只有一例患者產(chǎn)生了部分反應(yīng)。在其他的試 驗中，52例患者使用17-lA的同時，還使用了環(huán)磷酰胺，只有l(wèi)例患 者產(chǎn)生了完全反應(yīng)，2個患者產(chǎn)生了輕微反應(yīng)。到目前為止，17-lA作為III期結(jié)腸癌輔助治療的in期臨床試驗還沒有顯示出改善的療效。最初被批準用來成像的人源化鼠單克隆抗體也沒能使腫瘤消退。只有到了最近，單抗的使用在結(jié)腸直腸癌的臨床試驗中才有一些 陽性結(jié)果。2004年，ERBITUX⑧被批準作為表達EGFR的轉(zhuǎn)移結(jié)腸直 腸癌患者的二線治療用藥，這些患者對于基于依立替康(irinotecan)的 化療是耐受的。雙臂II期臨床研究和單臂研究的結(jié)果表明， ERBITUX㊣與依立替康聯(lián)合應(yīng)用分別有23%和15%的反應(yīng)率，中位疾 病進展時間分別是4.1和6.5月。來自同一項雙臂II期臨床試驗和另 一項單臂研究的結(jié)果表明，ERBITLTX^單獨治療的反應(yīng)率分別是11% 和9%,中位疾病進展時間分別是1.5和4.2個月。因而在瑞士和美國，ERBITUX⑧與依立替康的聯(lián)合應(yīng)用，以及在 美國，ERBITUX⑧的單獨治療都已經(jīng)被批準作為二線治療藥物，用于那些在依立替康一線治療中失敗的結(jié)腸癌患者。因此，與Herceptin 一樣，ERBITUX⑧治療在瑞士只被批準作為單克隆抗體和化療聯(lián)合應(yīng) 用。此外，在瑞士和美國，ERBITUX②治療只被批準作為患者的二線 治療。同樣，在2004年，AVASTIN⑧被批準與基于靜脈注射5-氟尿嘧 啶的化療聯(lián)合應(yīng)用，作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的一線治療。III期臨床研 究結(jié)果表明，與單獨使用5-氟尿嘧啶相比，聯(lián)合應(yīng)用AVASTIN 和5-氟尿嘧咬延長了患者的中位存活時間(分別是20個月和16個月)。然 而，還是與Herceptin㊣和ERBITUX⑧一樣，AVASTIN⑧只被批準作為單 克隆抗體與化療聯(lián)合應(yīng)用。對于肺臟、腦、卵巢、胰腺、前列腺和胃癌的治療，療效仍然很 差。在II期臨床試驗中，得到了近期對于非小細胞肺癌最有希望的結(jié) 果，其治療包括與細胞殺傷藥物阿霉素偶聯(lián)的單抗(SGN-15;dox-BR96， 抗-Sialyl-LeX)和化療試劑TAXOTERE⑧的聯(lián)合應(yīng)用。TAXOTERE⑧是 唯一經(jīng)FDA批準的用于肺癌二線治療的化療藥物。初始數(shù)據(jù)表明，與 單獨使用丁八乂0丁￡1^@相比，總體存活率提高。參與本研究的62個患 者中，三分之二接受了 SGN-15與TAXOTERE㊣的聯(lián)合治療，剩下的 三分之一接受了 TAXOTERE 的單獨治療。接受SGN-15與 丁八乂0丁￡1^@聯(lián)合治療的患者中位總體存活時間是7.3個月，而接受 丁八乂0丁￡1^@單獨治療的患者中位存活時間是5.9個月。與接受 TAXOTERE⑧單獨治療的患者的1年和18個月的總體存活率為24%和 8%相比，接受SGN-15與TAXOTERE⑧聯(lián)合治療的患者是29。/。和18%。 進 一 步的臨床試^r在計劃中。臨床前試驗中，使用單克隆抗體治療黑色素瘤取得了有限的成功。 這些抗體中，極少有達到臨床試驗期的。直到目前為止，還沒有一種 得到批準，或在III期臨床試驗中顯示出良好效果的。治療疾病的新藥的發(fā)現(xiàn)由于缺乏在30， 000種已知基因的產(chǎn)物中 鑒別相關(guān)靶點而滯后，這些靶點明確促進疾病的發(fā)生。在腫瘤學(xué)研究 中，潛在的藥物靶點只因為在肺瘤細胞中過表達而經(jīng)常被選擇。隨后， 這樣鑒別的靶點通過與大量化合物的相互作用被篩選。就潛在抗體的 治療而言，這些候選化合物通常由制備單克隆抗體的傳統(tǒng)方法所產(chǎn)生，該方法依據(jù)Kohler和Milstein所發(fā)表的基本原理(1975， Nature, 256, 495497， Kohler and Milstein)。從抗原免疫過的小鼠(舉例來說，全細 胞，細胞成分，純化的抗原)收集脾細胞，并與永生的雜交瘤細胞伴 侶融合。根據(jù)與靶抗原密切結(jié)合的抗體的分泌來篩選所產(chǎn)生的雜交瘤。 許多針對癌細胞診斷和治療的抗體，包括Herceptin⑧和RITUXIMAB， 已經(jīng)用這些方法制備，并已基于它們的親和性篩選出來。這項策略的 缺陷是雙重的。首先，與用于診斷和治療的抗體結(jié)合的合適的靶標的 選擇是有限的，這是由于對組織特異性的癌癥過程的認識貧乏和產(chǎn)生 結(jié)果的過分單純化的方法，比如通過過表達鑒別靶標來篩選。其次， 通常認為與受體有最大親和性的藥物分子啟動或抑制信號通路的可能 性最大，但并不總是如此。盡管乳癌和結(jié)腸癌的治療取得了 一些進展，但是有效的抗體治療 (作為單一試劑應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用)的鑒定與開放對所有類型癌癥是不夠的。現(xiàn)有專利美國第5,750,102號專利公開了一種方法，用MHC基因轉(zhuǎn)染患者 的腫瘤細胞，該基因可從患者的組織或細胞中克隆。然后用這些轉(zhuǎn)染 的細胞免疫患者。美國專利4,861,581公開了一種方法，包括獲取單克隆抗體，該 抗體對哺乳動物腫瘤細胞和正常細胞的細胞內(nèi)成分是特異的，對細胞外成分沒有特異性；標記單克隆抗體；將該標記的抗體與哺乳動物的 組織接觸，該哺乳動物已接受殺滅腫瘤細胞的治療；及，通過測量該 標記抗體與退化的肺瘤細胞的細胞內(nèi)成分的結(jié)合來確定治療的有效 性。在制備針對人類細胞內(nèi)抗原的抗體時，專利權(quán)所有人認識到腫瘤 細胞是這類抗原的一個方便來源。美國專利5,171,665提供了一種新型抗體及其制備方法。具體的， 該專利敘述了 一種單克隆抗體的制備，該抗體與人類腫瘤(例如腸癌和 肺癌)相關(guān)的蛋白抗原強烈結(jié)合，而與正常細胞的結(jié)合弱得多。美國專利5,484,596提供了一種癌癥治療的方法，包括手術(shù)切除人癌癥患者的腫瘤；處理腫瘤組織以獲得腫瘤細胞；照射腫瘤細胞， 使其能成活但不致瘤；用這些細胞來制備抑制原發(fā)性腫瘤復(fù)發(fā)，同時 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的患者疫苗。該專利講述了能夠與腫瘤細胞表面抗原反 應(yīng)的單克隆抗體的開發(fā)。如在第4欄，第45行等處提到的，專利權(quán)所 有人在研發(fā)單克隆抗體中應(yīng)用了自體腫瘤細胞，該單克隆抗體對人類 腫瘤表現(xiàn)出活性特異的免疫治療。美國專利5，693，763講述了人類癌細胞的糖蛋白抗原特性且不依 賴于來源的上皮組織。美國專利5,783,186涉及誘導(dǎo)表達Her2的細胞凋亡的抗-Her2抗 體，產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細胞系，用該抗體治療癌癥的方法和包括所 述抗體在內(nèi)的藥物組合。美國專利5,849,876描述了產(chǎn)生單克隆抗體的新的雜交瘤細胞系， 該抗體是針對從腫瘤細胞和非腫瘤細胞來源純化的粘液素抗原。美國專利5,869,268公開了 一種制備產(chǎn)生特異針對目標抗原的人 類淋巴細胞的方法，制備單克隆抗體的方法及該方法制備的單抗。該 專利特別公開了用于癌癥診斷和治療的抗-HD人類單克隆抗體的制 備。美國專利5,869,045涉及與人類癌細胞反應(yīng)的抗體、抗體片段、抗 體偶聯(lián)物和單鏈免疫毒素。這些抗體的作用機制是雙重的，其中該分 子可與人類癌細胞表面的細胞膜抗原反應(yīng)，而且該抗體可進一步內(nèi)化 入癌細胞內(nèi)，隨后是結(jié)合，這對形成抗體-藥物，抗體-毒素的偶聯(lián)物 尤其有用。未經(jīng)修飾的抗體在特定濃度下，也表現(xiàn)出細胞毒性質(zhì)。美國專利5,780,033公開了用于腫瘤治療和預(yù)防的自身抗體的使 用。不過，這種抗體是來自老年哺乳動物的抗核自身抗體。這里，自 身抗體是指一種存在于免疫系統(tǒng)的天然抗體。因為自身抗體來自"老 年哺乳動物"，所以就不要求自身抗體必須來自受治患者。除此之外， 該專利公開了來自成年哺乳動物的天然單克隆抗核自身抗體及產(chǎn)生單 克隆抗核自身抗體的雜交瘤細胞系。發(fā)明概述本申請利用美國專利6,180,357講述的制備患者特異性的抗癌抗 體的方法，以分離編碼調(diào)節(jié)癌性疾病的單抗的雜交瘤細胞系。這些抗 體可以針對一個腫瘤而特別制備，從而使癌癥的個體化治療成為可能。 在本申請公開的內(nèi)容中，有殺細胞(細胞毒的)或抑制細胞生長(細胞生 長抑制的)特性的抗癌抗體將在下文被稱為細胞毒性作用的。這些抗體 可以輔助癌癥的分期和診斷，可以用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移。這些抗體也可 以通過預(yù)防性治療來預(yù)防癌癥。與傳統(tǒng)的藥物發(fā)現(xiàn)模式下制備的抗體 不同，用本方法制備的抗體把在以前沒有表明對惡性組織生長和/或存 活必需的分子和通路作為目標。此外，這些抗體的親和性滿足啟動細 胞毒性作用事件的要求，該事件可不順從于更強的親和性相互作用。 同樣，本發(fā)明的范圍還包括將傳統(tǒng)的化療調(diào)節(jié)物質(zhì)，比如放射核，與 本發(fā)明中的CDMAB偶聯(lián)，從而使所述的化療作用集中。該CDMAB 也可與毒素、細胞毒性部分、酶(例如生物素結(jié)合酶)或造血細胞偶聯(lián)， 由jt匕形成抗體^f禺聯(lián)物。個體化抗癌治療前景將會帶來癌癥患者治療方式的變化。 一個可 能的臨床情境就是在腫瘤出現(xiàn)時，就獲取腫瘤樣本并入庫。通過該樣 本，從預(yù)存在的調(diào)節(jié)癌性疾病的抗體組中對該腫瘤進行分型?？沙Ｒ?guī) 地對該患者進行分期，但提供的抗體可用于該患者的進一步分期?？?以用已有的抗體直接對該患者進行治療，而腫瘤特異性的抗體組可以 通過本文中列出的方法來制備或通過噬菌體顯示庫與本文公開的篩選 方法合用來制備。既然其他腫瘤可能攜帶與被治療腫瘤相同的抗原表 位，制備的所有抗體將被加入到抗癌抗體庫中。按照本方法制備的抗 體可以用于治療許多患有與這些抗體結(jié)合的癌癥的患者的癌性疾病。除抗癌抗體之外，患者可以選擇接受目前推薦治療作為多模式治 療方案的一部分。通過本方法分離的抗體對于非癌細胞相對無毒性這 一事實允許大劑量使用抗體組合，要么單獨應(yīng)用，要么與傳統(tǒng)的治療 聯(lián)合應(yīng)用。高治療指數(shù)也允許短期內(nèi)的重復(fù)治療，從而降低了治療抗 性細胞出現(xiàn)的可能性。如果患者對治療的初始階段產(chǎn)生抗性或發(fā)生轉(zhuǎn)移，可以重復(fù)腫瘤 特異性抗體的制備過程用于再次治療。而且，該抗癌抗體可以與vMv該患者體內(nèi)獲得的紅細胞偶聯(lián)，重新輸注到患者體內(nèi)用于治療轉(zhuǎn)移腫瘤。 目前幾乎沒有有效的治療轉(zhuǎn)移癌的方法，而轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著導(dǎo)致死亡 的不良結(jié)果。然而，轉(zhuǎn)移癌通常血管豐富，通過紅細胞來運輸抗癌抗 體可以使抗體富集在腫瘤部位。即便在轉(zhuǎn)移之前，大多數(shù)癌細胞也要 依賴于宿主的血供來存活，與紅細胞結(jié)合的抗癌抗體對原位腫瘤同樣 有效。或者，抗體可以與其他的血細胞，比如、淋巴細胞、巨噬細胞、 單核細胞、自然殺傷細胞等結(jié)合?？贵w有五類，每類都與其重鏈所賦予的功能相關(guān)。通常認為通過 抗體依賴的細胞毒性作用或補體依賴的細胞毒性作用來介導(dǎo)棵抗體(naked antibodies)的癌細胞殺傷功能。例如，鼠IgM和IgG2a抗體能 夠結(jié)合補體系統(tǒng)的C-1組分來活化人補體，從而活化導(dǎo)致腫瘤裂解的 補體活化的經(jīng)典途徑。對于人類抗體，最有效的補體激活抗體通常是 IgM和IgGl。鼠IgG2a和IgG3同種型抗體可以有效地召集具有Fc 受體的細胞毒細胞，導(dǎo)致單核細胞、巨噬細胞、粒細胞和某些淋巴細 胞的細胞殺傷作用。人IgGl和IgG3同種型抗體介導(dǎo)ADCC?？贵w介導(dǎo)的癌癥殺傷功能的另 一可能機制是使用能夠催化細胞膜 及其相關(guān)糖蛋白或糖脂中不同的化學(xué)鍵水解的抗體，即所謂的催化抗 體?？贵w介導(dǎo)的癌細胞殺傷功能還有三種機制。第 一種是抗體作為疫 苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對癌細胞推定抗原的免疫反應(yīng)。第二種是用抗體靶 向生長受體，干擾其功能或下調(diào)受體，導(dǎo)致其功能有效喪失。第三種 是這類受體與細胞表面部分直接結(jié)合，這可導(dǎo)致細胞的直接死亡，比 如與i者如TRAIL Rl或TRAIL R2的死亡受體結(jié)合，或是與"^如o!V/5 3 等的整合素分子結(jié)合?？拱┧幬锏呐R床應(yīng)用是基于該藥物在可接受的風險范圍下對患者 的益處。在癌癥治療過程中，存活率通常是最重要的目的。但是，除 了延長壽命之外，還有一些其他公認的益處。這些對存活率沒有負面 影響的其他益處包括癥狀減輕、防止副作用、延長復(fù)發(fā)時間或無疾病 存活時間及延長病情進展時間。這些標準是被普遍接受的，像美國食 品藥品管理局(F.D.A.)等管理機構(gòu)批準產(chǎn)生這些益處的藥物(HirschfeldW a/. Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 2002》除了這 些標準之外，還有一些其他的指標，可以預(yù)測這些類型的益處。在某 種程度上，美國FDA準許的快速審批程序肯定了可能預(yù)測患者效益的 替代品的存在。到2003年末，有16種藥物在這種程序下得到批準， 在這些藥物中，有四種進入了完全審批，即后續(xù)的研究已經(jīng)顯示了直 接的患者受益，正如替代指標預(yù)測的那樣。決定藥物對實體腫瘤療效 的一個重要的指標是通過測定對治療的反應(yīng)來評價腫瘤負荷 (Therasse " a/. Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000)。這類評價的臨床標準(RECIST criteria)已經(jīng)由實體腫瘤反應(yīng)評 價標準工作組(Response E valuation Criteria in Solid Tumors Working Group), —個國際癌癥專家組公布。正如RECIST標準的客觀療效顯 示的，與適當?shù)膶φ战M相比，對腫瘤負荷有確切作用的藥物易于最終 對患者產(chǎn)生直接的益處。通常，能夠更直接地評價和記錄臨床前設(shè)置 的腫瘤負荷。因為臨床前研究可以轉(zhuǎn)化成臨床設(shè)置，所以在臨床前模 型中延長患者存活率的藥物應(yīng)該有最大的預(yù)期臨床效用。與臨床治療 產(chǎn)生的積極作用相似，在臨床前設(shè)置中減輕腫瘤負擔的藥物也對疾病 有明顯的直接影響。盡管延長生存時間是癌癥藥物治療結(jié)果中最關(guān)注 的臨床結(jié)果，但仍有其他有臨床作用的益處，顯然，降低腫瘤負荷也 能導(dǎo)致直接的益處，并具有臨床作用，其與疾病進展的延遲、生存時 間的延長或兩者都有關(guān)系(Eckhardt & a/. Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds(發(fā)展的治療學(xué)靶化合物的臨床試驗設(shè)計的成功與失敗); ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, pages 209-219)。本發(fā)明描述了 AR59A269.5的開發(fā)和應(yīng)用，其通過在細胞毒性作 用分析和人類癌癥的動物模型中的作用得到鑒定。本發(fā)明描述了特異 性結(jié)合存在于靶分子上的一個或多個抗原決定簇的試劑，其作為棵抗 體，在體外對惡性腫瘤細胞也有細胞毒性作用，對正常細胞沒有毒性 作用，也可作為棵抗體直接介導(dǎo)腫瘤生長的抑制作用。更進一步的優(yōu) 點是應(yīng)用諸如此類的抗癌抗體靶向表達同類抗原標志物的腫瘤以實現(xiàn) 腫瘤生長的抑制及癌癥治療的其他陽性目標。總之，本發(fā)明講述了 AR59A269.5抗原作為治療試劑靶點的應(yīng)用， 當給予AR59A269.5時，可以減輕哺乳動物中表達該抗原的癌癥的腫 瘤負荷。本發(fā)明也講述了 CDMAB(AR59A269.5)及其衍生物、其抗原 結(jié)合片段和其細胞毒誘導(dǎo)性配體，在耙向它們的抗原，降低哺乳動物 的表達該抗原的癌癥的腫瘤負荷中的應(yīng)用。而且，本發(fā)明也講述了在 癌細胞內(nèi)檢測AR59A269.5抗原的應(yīng)用，其用于攜帶表達該抗原的腫 瘤的哺乳動物的i貪斷、治療的預(yù)測及預(yù)后。因此，本發(fā)明的目的是利用產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)方 法，該抗體針對來自特定個體的癌細胞，或一個或多個特定癌細胞系， 該CDMAB對癌細胞有細胞毒性作用，而同時對非癌細胞相對無毒， 該方法是為了分離雜交瘤細胞系和該雜交瘤細胞系編碼的相應(yīng)的分離 單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的另一個目的是說明癌性疾病調(diào)節(jié)抗體、配體及其抗原結(jié) 合片段。本發(fā)明進一步的目的是制備癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其細胞毒性作用 由抗體依賴的細胞毒性作用介導(dǎo)。本發(fā)明另 一個目的是制備癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其細胞毒性作用由 補體依賴的細胞毒性作用介導(dǎo)。本發(fā)明還有進一步的目的是制備癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其細胞毒性 作用是其催化細胞化學(xué)鍵水解的能力。本發(fā)明還有進一步目的是制備癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其用于癌癥診 斷、預(yù)后和監(jiān)測的結(jié)合分析。本發(fā)明其他的目的和優(yōu)點通過本發(fā)明下述的說明、舉例和一些實 施方式的描述將變得顯而易見。附圖簡要說明本專利或申請文件包含至少 一張彩色圖片。依據(jù)請求并支付必要 費用后，專利局會提供帶彩色附圖的本專利或申請文件公開文本的復(fù) 印件。
圖1比4交了雜交瘤上清液對MDA-MB-231、 OVCAR-3、 SW1116、Lovo和CCD-27sk細胞系的細胞毒性作用百分比及結(jié)合水平。圖2顯示AR59A269.5和抗-EGFR對照組與癌細胞及正常細胞系 的結(jié)合。以相對于同種型對照的倍增來表示平均熒光強度，數(shù)據(jù)以表 格形式呈現(xiàn)。圖3包括針對幾種癌細胞和非癌細月包系的AR59A269.5和抗 -EGFR抗體的典型FACS圖。圖4顯示AR59A269.5在預(yù)防性LoVo結(jié)腸癌-漠型上對腫瘤生長 的影響。垂直線表示給予抗體的階段。數(shù)據(jù)點代表平均值+A標準誤。圖5顯示AR59A269.5在預(yù)防性LoVo結(jié)腸癌模型上對體重的影 響。數(shù)據(jù)點代表平均值+A標準誤。附圖6顯示AR59A269.5在預(yù)防性DLD-1結(jié)腸癌^t型上對腫瘤生 長的影響。垂直線表示給予抗體的階段。數(shù)據(jù)點代表平均值+/-標準誤。附圖7顯示AR59A269.5在預(yù)防性DLD-1結(jié)腸癌才莫型上對體重的 影響。數(shù)據(jù)點代表平均值+/-標準誤。圖8以表格的形式比較了 AR59A269.5與陽性、陰性對照在人體 異種移植腫瘤組織中IHC的結(jié)果。圖9A， 9B, 9C和9D是代表性的顯孩i照片，顯示AR59A269.5與 乳腺MDA-MB-231 (A)或結(jié)腸SW1116 (B)異種移植胂瘤組織的結(jié)合模 式或者緩沖液對照與乳腺MDA-MB-231(C)或結(jié)腸SW1116 (D)異種移 植肺瘤組織的結(jié)合才莫式。AR59A269.5在肺瘤細胞內(nèi)顯示了陽性染色。 》文大倍數(shù)是200倍。發(fā)明的詳細描述下面用于概述、描述、實施例和權(quán)利要求書中的字詞或短語通常 都有其指定的含義。術(shù)語"抗體"使用其最廣泛的涵義，且特別包括，例如單克隆抗 體(包括激動劑、拮抗劑和中和抗體，脫免疫的、鼠科的、嵌合的或人 源化的抗體)、攜帶有多表位特異性的抗體組合物、單鏈抗體、抗體的 免疫偶聯(lián)物和抗體片段(見下文)。本發(fā)明中使用的術(shù)語"單克隆抗體，，指從一群基本上同質(zhì)的抗體中獲得的一種抗體，也就是說，包括這群抗體的單個抗體是相同的， 除了可以少量存在的可能的自然變異。單克隆抗體針對單一抗原位是 高度特異性的。而且，與包含針對不同決定基(抗原決定簇)的不同抗 體的多克隆抗體制劑相比，每一種單克隆抗體針對抗原上的單一的決 定基。除了特異性之外，單克隆抗體在合成方面也是有優(yōu)勢的，其合 成可以不受其他抗體的污染。修飾語"單克隆的"指從基本同質(zhì)的抗 體群中獲得的抗體的特征，而不能解釋為通過任何特定的方法需要抗體生產(chǎn)的。例如，本發(fā)明中4吏用的單克隆抗體可以通過由Kohler^a/., A^mm, 256:495 (1975)首次描述的雜交瘤(鼠源或人源)方法制備或由 重組DNA方法制備(參見，例如，美國專利第4,816,567號)。"單克 隆抗體"也可以從噬菌體抗體庫中分離，使用的技術(shù)在例如Clackson W a/"胸匿，352:624- 628 (1991)和Marks " a/, J. Mol. Biol, 222:581 -597 (1991)中描述過。"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包括其抗原結(jié)合區(qū)域 或可變區(qū)。例如，抗體片段包括非全長的抗體、Fab、 Fab'、 F(ab')2 和Fv片段；微型雙功能抗體(diabodies);線形抗體；單鏈抗體分子； 單鏈抗體，單結(jié)構(gòu)域抗體分子，融合蛋白，重組蛋白和由抗體片段形 成的多特異性抗體。"完整"抗體指不但包含輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)CH1、 CH2、 CH3，還包含結(jié)合抗原的可變區(qū)的抗體。恒定區(qū)可以是天然序 列的恒定區(qū)(例如，人天然序列恒定區(qū))或其氨基酸序列的變體。優(yōu)選 地，完整抗體有一個或多個效應(yīng)器功能。依據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，完整抗體可以分為不同的"種 類，，。有五種完整的抗體IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM，其中幾 種可進一步分成"亞類，，(同種型)，例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA和IgA2。與不同種類抗體對應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別被稱為S, e, 7 和m。不同種類的免疫球蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)和亞結(jié)構(gòu)是公知的。抗體"效應(yīng)器功能"指那些由抗體Fc區(qū)引起的(天然序列的Fc區(qū) 或氨基酸序列變異的Fc區(qū))的生物活性?？贵w效應(yīng)器功能的例子包括 CIq結(jié)合；補體依賴的細胞毒性作用；Fc受體結(jié)合；抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體的下調(diào)(例如B 細胞受體；BCR)等。"抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用"和"ADCC"指一種細 胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性的細胞毒細胞(例 如自然殺傷(NK)細胞，噬中性粒細胞和巨噬細胞)識別結(jié)合在靶細胞上 的抗體，隨后導(dǎo)致該靶細胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細胞，NK細 胞，只表達Fc7Rin,而單核細胞表達FcryRI, Fc7Ri1和Fc7RIIL關(guān)于 造血纟田月包FcR表達的總結(jié)見Ravetch and Kinet, 7m附wwo/ 9:457-92 (1991)464頁的表3。為了測定目標分子的ADCC活性，可以 進行例如美國專利5,500,362或5,821,337描述的體外ADCC活性測 定。用于這類分析的效應(yīng)細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷 (NK)細胞。選擇地或附加地，目標分子的ADCC活性可以在體內(nèi)評價， 例如在諸如Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)中^>開的動物 模型中。"效應(yīng)細胞"指表達一種或多種FcR、執(zhí)行效應(yīng)器功能的白細胞。 優(yōu)選地，這些細胞至少表達Fc7Rin,并執(zhí)行ADCC效應(yīng)器功能。介 導(dǎo)ADCC的人類白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)、自然殺 傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒T細胞和中性粒細胞；優(yōu)選PBMC和 NK細胞。效應(yīng)器細胞可以從其天然來源中分離，例如從本文中描述 的血液或PBMC中分離。術(shù)語"Fc受體"或"FcR"用于描述結(jié)合于抗體Fe區(qū)的受體。優(yōu) 選的FcR是天然序列的人類FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合于IgG抗 體(受體)的受體，并包^舌Fc7RI， Fc7RH，和Fcy RIII亞類的受體，其包 括這些受體的等位基因變體和選擇性的剪切形式。Fc7RH受體包括 Fc7RIIA("激活性受體")和Fc7RIIB("抑制性受體")，兩者的氨基 酸序列相似，主要不同在于其胞漿區(qū)。激活性受體F(ryRIIA在其胞漿 區(qū)含有免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受體Fc7RIIB在其胞 漿區(qū)含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)。(參見綜述M. in Dagron, i ev. 7wmwwo/. 15:203-234 (1997)。 Ravetch and Kinet， i ev. 7m聽m / 9:457-92(1991》Capel & a/" /m聽wCAoA 4:25-34 (1994)和de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)對FcR進行了綜述。 本發(fā)明中的術(shù)語"FcR"包括將來要被確認的FcR在內(nèi)的其他FcR。 該術(shù)語也包括負責將母體的IgG轉(zhuǎn)運到胎兒體內(nèi)的新生受體， FcRn(Guyer e《a/.， 《/. /mmwwo/, 1 17:587 (1976)和Kim W a/.， /. /mm謹/. 24:2429 (1994))。"補體依賴性細胞毒性作用"或"CDC"指分子在補體存在下， 裂解靶細胞的能力。補體激活途徑通過補體系統(tǒng)的第一組分(CIq)與交 聯(lián)了同類抗原的分子(比如，抗體)的結(jié)合啟動。為了評價補體激活， 可以進4亍長口 Gazzano-Santoro & a/.，7m附wwo/. A/eAo^s 202:163 (1996) 中描述的CDC分析。術(shù)語"可變的"指可變區(qū)某些部分的序列在抗體間高度不同，并 用于每一種特定抗體與其特定抗原的結(jié)合及其特異性。然而，變異并不是均勻分布在抗體的可變區(qū)域內(nèi)。在輕鏈和重鏈的可變區(qū)域內(nèi)，變 異集中在所謂的高度可變區(qū)的三個區(qū)域內(nèi)?？勺儏^(qū)內(nèi)更加高度保守的 部分被稱為骨架區(qū)(FR)。每個天然的重鏈和輕鏈可變區(qū)，包含主要采 用/3-片層構(gòu)型的四個FR,由三個高度可變區(qū)連接在一起，形成環(huán)狀連 接，在一些情況下形成部分〉片層結(jié)構(gòu)。每條鏈的高度可變區(qū)由FR以 密切靠近的方式結(jié)合一起，并與其他鏈的高度可變區(qū)一起，有助于抗 體的4元原結(jié)合部4立的形成(參見Kabat a/， Se《wewc&s o/ iVW">w o/ 7mmwwo/og/ca/7n^ra^(06瘦夢《^^蛋々的y^/力，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991))。恒定區(qū)并不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，而是呈現(xiàn)各種效應(yīng) 器功能，例如參與抗體在抗體依賴性的細胞毒效應(yīng)(ADCC)中的作用。 本發(fā)明中使用的術(shù)語"高度可變區(qū)"指抗體上負責與抗原結(jié)合的 氨基酸殘基。高度可變區(qū)通常包括"互補決定區(qū)"或"CDR"的氨基 酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的氨基酸殘基24-34 (LI )、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)及重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基31 -35 (Hl)、 50-65 (H2)和 95-102 (H3); Kabat d a/， 5^wewcas o/ iVotoVw /mmwwo/og/ca/ 瘦夢《^^蛋冷的^/y」，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda， Md. pp 15-17; 48-53 (1991))和/或"高變環(huán)"區(qū)的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基2632 (Ll)、 50-52 (L2)和91 -96 (L3)及重鏈可變區(qū)的26-32 (Hl)、 53-55 (H2)和96-101 (H3); ChothiaandLeskJ. Mo/.歷o/. 196:901-917 (1987))。"骨架區(qū)，， 或"FR"殘基指除了本發(fā)明定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變區(qū)的殘 基。木瓜蛋白酶水解抗體產(chǎn)生了兩個相同的被稱為"Fab"片段的抗原 結(jié)合片段和一個殘余的"Fc"片段，每個"Fab"片段都有單一的抗原 結(jié)合部位，"Fc"片段的名稱反映了其易結(jié)晶的能力?？贵w經(jīng)胃蛋白 酶處理后，產(chǎn)生F(ab')2片段，其有兩個抗原結(jié)合部位，仍能夠與抗原 交聯(lián)。"Fv，，是攜帶完整的抗原識別和抗原結(jié)合部位的最小抗體片段。此 區(qū)域由以非共價4定的方式緊密結(jié)合的一條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)的二 聚體構(gòu)成。以這種每個可變區(qū)的三個高變區(qū)相互作用的結(jié)構(gòu)決定 VH-VL 二聚體表面的抗原結(jié)合部位。六個高變區(qū)域共同賦予了抗體的 抗原結(jié)合特異性。然而，即便單一的可變區(qū)(或只含有三個抗原特異性 高變區(qū)的部分Fv)仍能夠識別和結(jié)合抗原，雖然比完整結(jié)合位點的親 和性低。Fab片段也含有輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。 Fab' 片段與Fab片段的不同在于重鏈CH1區(qū)的羧基末端多了幾個氨基酸 殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab'-SH在本發(fā)明 中指代Fab'，其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基至少攜帶一個游離的硫基。 最初的F(ab')2抗體片段以Fab'片段對產(chǎn)生，之間有鉸鏈的半胱氨酸。 其他的抗體片段的化學(xué)偶聯(lián)也是公知的。來自任一脊推動物的抗體的"輕鏈"都可以歸于兩種截然不同的 所謂kappa (k)和lambda (X)鏈中的一種，k和X鏈的分類基于其恒定區(qū) 的氨基酸序列。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的Vh和Vl區(qū)，其中這 些區(qū)域存在于單一的多肽鏈上。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽進一步包含VH和VL 區(qū)之間的多肽連接子，使scFv形成適于抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv 的綜述參見 Pltickthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(單克隆抗體藥理學(xué))，vol. 1 13， Rosenburg and Moore eds" Springer-Verlag， New York, pp. 269- 315 (1994)。術(shù)語"雙功能抗體(Diabodies)'，指帶有兩個抗原結(jié)合位點的小型 抗體片段，其在同 一多肽鏈上(VH-VJ含有與輕鏈可變區(qū)(VO結(jié)合的重 鏈可變區(qū)(VH)。使用連接子，該連接子過短不能在同一條鏈上使兩個 區(qū)域成對，這些區(qū)域被迫與另一條鏈上的互補區(qū)域配對，由此產(chǎn)生了 兩個抗原結(jié)合位點。例如在EP 404,097; WO 93/11161;和Hollinger " a/. , A^/Sc/. t/&4， 90:6444-6448 (1993).中對于雙功能抗體作了更詳細的描述。"分離"抗體是指從其天然環(huán)境的組分中鑒別、分離和/或恢復(fù)的 抗體。其天然環(huán)境下的污染成分是指干擾抗體診斷或治療作用的物質(zhì)， 可能包括酶、激素和其它的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。因為抗體的天然 環(huán)境中的至少一種組分可能不存在，分離抗體包括重組細胞內(nèi)部的原 位抗體。但是，通常分離抗體會經(jīng)過至少一步的純化步驟來制備。"結(jié)合"目的抗原的抗體是指對該抗原有充分親和力的抗體，以 致該抗體在耙定表達該抗原的細胞時，可以作為治療或診斷試劑。如 果抗體能結(jié)合抗原性部分，它通常會優(yōu)先結(jié)合其抗原性部分，而不是 其它受體，這不包括偶然的結(jié)合，像非特異性的Fc接觸或與其他抗原 共有的翻譯后修飾成分結(jié)合，該抗體不會與其他蛋白有明顯的相互作 用。檢測與目的抗原結(jié)合的抗體的方法在本領(lǐng)域中是公知的，可包括 但并不局限于例如FACS 、細胞ELISA和Western印跡等分析。正如本發(fā)明中使用的，"細胞"、"細胞系"、"細胞培養(yǎng)物" 的表述可以交替使用，所有這些用法都包括其子代。也可以理解為由 于人為的或非人為的突變，所有的子代在DNA組成上不可能完全相 同。在原始轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)篩選的有相同功能或生物學(xué)活性的突變子代包 括在內(nèi)。在上下文中，能夠清楚有意使用不同的指代。"治療"既指治療性處理，也指預(yù)防性或防止的措施，其目的就 是預(yù)防或減緩(減輕)目標的病理狀態(tài)或病癥。需要治療的個體不僅包 括那些將發(fā)展為該病癥的或名夂對其病癥進行預(yù)防的個體，還包括那些 已經(jīng)存在所述病癥的個體。因此，本文中欲被治療的哺乳動物可已經(jīng) 被i會斷為患有該病癥可傾向于或易感于該病癥。術(shù)語"癌癥"和"癌性(的)"是指或描述哺乳動物的生理狀態(tài)，其典型特征是細胞生長或死亡不受調(diào)控。癌癥的例子包括但不限于癌、 淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴惡性腫瘤。這些腫瘤更多具 體的例子包括鱗狀細胞癌(例如鱗狀上皮細胞癌)，包括小細胞癌、非 小細胞癌、腺癌和鱗癌在內(nèi)的肺癌，腹膜癌，肝細胞癌，包括胃腸道 癌在內(nèi)的胃癌，胰腺癌，膠質(zhì)母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝臟癌癥， 膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi) 膜癌，唾液腺肺瘤，腎癌，前列腺癌，外陰肺瘤，曱狀腺癌，肝癌， 肛癌，陰莖癌，還有頭頸部癌。"化療劑"是用于癌癥治療的化合物?；焺┑睦影ㄖT如 p塞替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化劑；例如白消安(busulfan)、 英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯類；如苯佐 替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)、烏瑞替派(uredopa) 的氮丙。定類；包括六曱蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基 磷酰胺、三亞乙基疏代磷酰胺 和三曱基奧羅蜜胺 (trimethylolomelamine)在內(nèi)的乙烯亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類 (methylamelamine);如瘤可寧(chlorambucil)、萘氮芥、環(huán)磷酰胺、雌 莫司汀(estramustine)、異環(huán)石岸酰胺、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸曱氧 氮芥、美法侖、新氮芥(novembichin)、 苯乙酸氮芥(phenesterine)、 潑 尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司汀(uracil mustard)等氮芥類藥物；如卡氯 芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀等硝脲類 (nitrosureas);如阿克拉霉素類、放線菌素、安曲霉素、重氮絲氨酸、 博來霉素、放線菌素C、加里剎霉素、洋紅霉素、碳霉素(carnomycin)、 嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托咪定、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依達比星、麻西羅 霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、灰霉素、otfiromycin、 噤呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、 烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星類抗生素；甲氨碟呤和5-氟尿嘧啶(5-FU) 類抗代謝類藥；如二曱葉酸、氨曱喋呤、蝶羅呤、三甲曲沙等葉酸擬 似物；如氟達拉濱、6-巰嘌呤、》危米嘌呤、碌^鳥嘌呤類噪呤類似物； 如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU等嘧啶類似物；如卡魯睪 酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯酮等男性激素類藥 物；如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦等抗腎上腺類藥物；如亞葉酸等 葉酸補充物；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶； bestrabucil;比生群；依達曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌依氟 鳥氨酸；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達 明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇；尼曲吖啶；噴司他丁；蛋氨氮 芥；吡柔比星；足葉草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐 喃；鍺螺胺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2'，2"-三氯三乙胺；烏拉 坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇； 哌泊渙烷；gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");環(huán)磷酰胺；塞替派； 如紫杉醇(TAXOL， Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.)和 多西4也賽(TAXOTERE㊣，Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France) 等紫杉烷類；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；曱氨蝶 呤；如順鉑和卡柏等柏類似物；長春堿；柏；依托泊苷(VP-16);異環(huán) 磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；去曱長春堿； 諾消靈(novantrone);替尼泊苷；柔紅霉素；氨蝶呤鈉；希羅達；伊班 膦酸鈉；CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000; 二氟曱基鳥氨酸 (DMFO);視黃酸；esperamicins;卡培他濱；以及上述4壬一種藥物在 藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。調(diào)節(jié)或抑制激素對胂瘤作用的抗激 素類藥物也包括在本定義內(nèi)，像抗雌激素藥物，例如，包括它莫西芬、 雷洛昔芬、芳香化酶抑制劑4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、 雷諾昔芬，LY117018、奧那司酮、托瑞米芬(法樂通)；抗雄激素物質(zhì)， 例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林；以及上述 任一種藥物在藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。用于治療目的的"哺乳動物"指任何一種可歸于哺乳類的動物， 包括人類、小鼠、免疫缺陷鼠或棵鼠或品系小鼠、家畜和農(nóng)場動物及 動物園內(nèi)的動物、體育動物或?qū)櫸?，比如綿羊、狗、馬、貓、母牛等。 優(yōu)選地，本發(fā)明中的哺乳動物指人類。"寡核香酸"指短長度、單鏈或雙鏈多聚脫氧核苷酸，其可利用已知的方法化學(xué)合成(例如磷酸三酯、亞磷酸鹽、亞磷酰胺化學(xué)，利用例如發(fā)表于1988年5月4日的EP 266,032描述的固相4支術(shù)；或利用 Froehler e, a/,v4cz^s14:5399-5407, 1986描述的脫氧核苷H-磷酸鹽中間物)，然后用聚丙烯酰胺凝膠純化。"嵌合"抗體指免疫球蛋白，其部分重鏈和/或輕鏈與來源于特定 種屬或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體的對應(yīng)序列相同或同源，同時 鏈上余下序列與來源于另一種屬或?qū)儆诹硪环N類或亞類的抗體的對應(yīng) 序列相同或同源，此外還指這些抗體的片段，只要這些片段能夠表現(xiàn) 出所需的生物活性(美國專利4,816,567和Morrison C A^/. 顛& ,, 81 :6851 -6855 (1984》。非人類(例如鼠科)抗體的"人源化"形式指特殊的嵌合免疫球蛋 白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv， Fab, Fab', F(ab)2或抗體的其他抗 原結(jié)合序列)。在絕大多數(shù)情況下，人源化抗體是人的免疫球蛋白(受 者抗體)，其中，互補決定區(qū)的氨基酸殘基被諸如具有所需的特異性、親和力、能力的小鼠、大鼠或兔等的非人類抗體(供者抗體)的CDRs 的殘基所替代。在一些情況下，人類免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)(FR)殘 基被相應(yīng)的非人類FR殘基所替代。此外，人源化抗體可能還包含既 不在受者抗體也不在供者抗體的CDR或FR序列的殘基。這些修飾 進一步改善和優(yōu)化了抗體的性能。通常，人源化抗體包含至少一個， 通常是兩個可變區(qū)的幾乎所有的部分，其中所有或幾乎所有的CDR 區(qū)對應(yīng)非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)，而所有或幾乎所有的FR殘基是 人類免疫球蛋白共有序列的FR殘基。人源化抗體也最適宜包含至少 一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)序列，通常是人類免疫球蛋白的序列。"去免疫化"抗體是對給定的物種沒有免疫原性或免疫原性較差 的免疫球蛋白。通過改造抗體的結(jié)構(gòu)可以實現(xiàn)去免疫化。任何本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的去免疫化技術(shù)都可以-使用。例如，在發(fā)表于2000年6 月15日的WO 00/34317中，描述了 一項使抗體去免疫原性的適當?shù)?技術(shù)。誘導(dǎo)"細胞凋亡"的抗體是指通過任一方式誘導(dǎo)程序性細胞死亡 的抗體，該方式例如但不局限于結(jié)合annexin V(膜聯(lián)蛋白V)、caspase(半胱天冬酶)活性、DNA斷裂、細胞皺縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、細胞 破碎和/或膜嚢泡(所謂的凋亡小體)的形成。在本說明書中，雜交瘤細胞系及其產(chǎn)生的分離單抗可選擇用內(nèi)部 分類號AR59A269.5或保藏號IDAC 170505-01來表示。本發(fā)明中使用的"抗體-配體"包括至少對靶抗原的一個抗原決定 簇有結(jié)合特異性的部分，可以是完整的抗體分子、抗體片段和至少有例如，F(xiàn)v分子、Fab分子、Fab'.sub.2分子、雙特異性抗體、融合蛋白 或任一基因工程分子，其特異性識別和結(jié)合至少一個抗原決定簇，該 抗原可與IDAC 170505-01雜交瘤細胞系(IDAC 170505-01抗原)產(chǎn)生 的分離的單抗結(jié)合。本發(fā)明中使用的"癌性疾病調(diào)節(jié)抗體"(CDMAB)指能夠以有益于 患者的方式，例如通過減輕腫瘤負荷或延長腫瘤患者的生存期的方式， 改善癌性疾病進程的單克隆抗體和其抗體-配體。本發(fā)明中使用的"抗原結(jié)合區(qū)"指識別靶抗原的分子的部分。本發(fā)明中使用的"竟爭性抑制"是指能夠識別和結(jié)合由IDAC 170505-01雜交瘤細胞系產(chǎn)生的單抗(IDAC 170505-01抗體)針對的抗 原決定表位，通過常規(guī)的抗體相互竟爭測定來檢測。(Belanger L.,Sylvestre C. and Dufour D. (1973)， Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures(竟爭和夾心法 的曱胎蛋白的酶耳關(guān)免疫測定).Clinica Chimica Acta 48, 15)。本發(fā)明中使用的"靶抗原"指IDAC 170505-01抗原或其部分。本發(fā)明中使用的"免疫偶聯(lián)劑"指諸如抗體的任一分子或CDMAB 以化學(xué)或生物學(xué)方式與細胞毒素、放射物質(zhì)、酶、毒素、抗腫瘤藥或 治療劑結(jié)合。只要能夠與其靶標結(jié)合，該抗體或CDMAB可以在其分 子的任一部位與細胞毒素、放射物質(zhì)、抗腫瘤藥或治療劑連接。免疫 偶聯(lián)劑的例子包括，抗體毒素化學(xué)偶聯(lián)劑和抗體-毒素融合蛋白。本發(fā)明中使用的"融合蛋白"指任一嵌合蛋白，其抗原結(jié)合區(qū)與 例如毒素、酶或蛋白藥物的生物活性分子連接。為了更充分理解本文中描述的發(fā)明，進行下述說明。本發(fā)明提供CDMAB (即IDAC 170505-01 CDMAB)，其特異性識 別和結(jié)合IDAC 170505-01抗原。以保藏號170505-01保藏于IDAC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆 抗體CDMAB可以呈現(xiàn)任一形式，只要其具有竟爭性抑制IDAC 170505-01雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體與靶抗原的免疫特異性結(jié) 合的抗原結(jié)合區(qū)。這樣，具有與IDAC 170505-01抗體結(jié)合特異性相 同的任何重組蛋白(例如融合蛋白，其中抗體與諸如淋巴因子或腫瘤生 長抑制因子的另 一種蛋白結(jié)合)都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一個實施方案中，CDMAB是IDAC 170505-01抗體。在其他實施方案中，CDMAB是一個抗原結(jié)合片段，其可以是具 有IDAC 170505-01抗體的抗原結(jié)合區(qū)的Fv分子(例如單鏈Fv分子)、 Fab分子、Fab'分子、F(ab')2分子、融合蛋白、雙特異性抗體、異種抗 體或任一重組分子。本發(fā)明中的CDMAB針對的抗原決定簇是IDAC 170505-01單克隆抗體針對的決定簇。本發(fā)明中的CDMAB可以被修飾，即通過分子內(nèi)的氨基酸修飾， 產(chǎn)生出衍生分子。也可能是化學(xué)修飾。衍生分子要保留多肽的功能，也就是說，具有這些取代的分子仍 能夠^吏該多肽與IDAC 170505-01抗原或其部分結(jié)合。氨基酸取代包括在本領(lǐng)域中公知的保守氨基酸置換，但并不局限 于此。舉例來說，某些被稱為"保守氨基酸取代"的氨基酸取代能夠在 蛋白中經(jīng)常出現(xiàn)，但并不改變該蛋白的構(gòu)象或功能，這是蛋白質(zhì)化學(xué) 中已建立的法則。這些改變包括以下氨基酸任一異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和亮氨酸 (L)取代任何其他的疏水氨基酸；天門冬氨酸(D)取代谷氨酸(E),反 之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N),反之亦然；以及絲氨酸(S) 取代蘇氨酸(T)，反之亦然。其他的取代也可被認為是保守的，取決 于特定氨基酸的環(huán)境和其在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的作用。例如，甘氨酸 (G)和丙氨酸(A)可經(jīng)常互換，丙氨酸和纈氨酸(V)也是。相對疏水 的蛋氨酸(M)可經(jīng)常與亮氨酸和異亮氨酸互換，有時與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)經(jīng)?；Q，其發(fā)生部位氨基酸的明顯特征是 其帶電特性，這兩種氨基酸的不同pK的差別并不明顯。在特定情境 下，仍有其他的一些變化可以被認為是"保守的，，。給定一種抗體，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以生產(chǎn)出竟爭性抑制的 CDMAB，例如竟爭性抗體，其可識別相同的抗原決定簇(Belanger L " a/. C//m'cfl CA/m/ca爿"a 48:15- 18 (1973))。 一種方法是用表達該4元體識 別抗原的免疫原產(chǎn)生免疫。該樣本可以包括組織、分離的蛋白或細胞 系，但并不局限于這些。用竟爭性測定方法篩選產(chǎn)生的雜交瘤，該方 法其能鑒別抑制所檢測抗體結(jié)合的抗體，例如ELISA 、 FACS或 Western印跡。另 一種方法是利用噬菌體展示抗體庫，淘選至少識別 所述抗原一個抗原決定簇的抗體(Rubinstein JL et al. Anal Biochem 314:294-300 (2003))。在任一情況下，抗體的篩選都是基于其與至少一 個靶抗原決定簇的結(jié)合能力竟爭超出原標記抗體。因此，這些抗體的 特征是可以識別該抗原的至少一個抗原決定簇，正如原抗體一樣。實施例1雜交瘤制備一雜交瘤細胞系A(chǔ)R59A269.5依據(jù)布達佩斯條約，雜交瘤細胞系A(chǔ)R59A269.5于2005年5月 17日保藏于加拿大國際微生物保藏單位(IDAC),位于加拿大馬尼托巴 省溫尼伯市阿林頓街道1015的加拿大衛(wèi)生部微生物局，保藏號為 170505-01。依據(jù)37 CFR 1.808的規(guī)定，保藏者保證在專利授權(quán)時將不 可撤銷地取消對公眾獲取該保藏材料的所有限制。如果保藏中保藏樣 本不存活，應(yīng)替換保藏物。為了制備產(chǎn)生AR59A269.5抗癌抗體的雜交瘤，在PBS中制備轉(zhuǎn) 移到肝組織(Genomics Collaborative, Cambridge, MA)的冷凍人結(jié)腸腫 瘤組織的單細胞懸液。將IMMUNE AS YTM (Qiagen, Venlo, Netherlands) 佐劑輕輕混合后備用。通過皮下注射含2百萬個細胞的50微升抗原-佐劑來免疫5到7周齡的BALB/c小鼠。初次免疫2到5周后，用新 鮮制備的含2百萬個細胞的50微升抗原-佐劑腹腔注射加強免疫鼠。 末次免疫3天后，取出脾臟用于融合。將分離的脾細胞與NSO-I骨髓瘤細胞伴侶融合，制備雜交瘤細胞。檢測雜交瘤亞克隆融合細胞的上 清。為了檢測雜交瘤分泌的抗體是IgG，還是IgM同種型，進行ELISA 分析。用包被緩沖液(0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，pH 9.2-9.6)中的 濃度2.4 jtig/ml的山羊抗小鼠的IgG + IgM (H+L), 4。C按100^1/孔加入 ELISA板過夜。該ELISA板用洗滌緩沖液(PBS + 0.05% Tween)洗三 次。按100jiil/孔加入封閉緩沖液(5%脫脂乳洗滌緩沖液)，室溫1小 時，隨后用洗滌緩沖液洗三次。按100/d/孔加入雜交瘤上清，將該板 室溫孵育1小時。該板用洗滌緩沖液洗三次，按100/xl/孔加入山羊抗 小鼠的IgG或IgM辣根過氧化物酶偶聯(lián)物的1/100,000稀釋液(用含 5。/。牛奶的PBS稀釋)。室溫孵育1小時后，反應(yīng)板用洗滌緩沖液洗三 次。按100/d/孔加入TMB溶液，室溫孵育1-3分鐘。按50jd/孔加入 2M H2S04，終止顏色反應(yīng)，用Perkin-Elmer HTS7000酶標儀在450 nm 波長讀數(shù)，參考過濾器波長為595 nm。如圖1所示，AR59A269.5雜 交瘤主要分泌IgG同種型抗體。采用小鼠單克隆抗體同種型分析試劑盒(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit)(HyCuIt Biotechnology, Frontstmat, Netherlands) 進行同種型分型(isotyping)實驗來檢測雜交瘤細胞分泌抗體的亞類。在 含大鼠抗小鼠特異性抗體亞類的檢測條上加入500 ]Lil緩沖液。在試管 中加入500jLil雜交瘤上清，輕攪使其浸入。通過與膠體粒偶聯(lián)的另一 大鼠單抗，可以直接檢測到被俘獲的小鼠免疫球蛋白。這兩種蛋白的 結(jié)合產(chǎn)生了一個肉眼可見的信號，用于分析抗體同種型?？拱┛贵w AR59A269.5為IgG2a, K同種型。經(jīng)過一輪限制稀釋，在細胞ELISA測定系統(tǒng)中，檢測雜交瘤上清 中與輩巴細胞結(jié)合的抗體。檢測了一種人乳腺癌細胞系、 一種人卵巢癌 細胞系、 一種人結(jié)腸癌細胞系和一種人正常皮膚細胞系分別是 MDA-MB-231, OVCAR-3, Lovo和CCD-27sk。所有細胞系來自美國典 型培養(yǎng)物保存中心(ATCC; Manassas， VA)。板內(nèi)的細胞在4吏用前先固 定。室溫下，該板用含MgCl2和CaCl2的PBS洗三次。每孔加PBS稀 釋的2%的多聚曱醛100 /xl，室溫10分鐘，然后棄掉多聚曱醛。對該反應(yīng)板再用含MgCl2和CaCl2的PBS室溫洗三次。每孔加100/il用洗 滌液(PBS + 0.05% Tween)稀釋的5%奶來封閉，室溫封閉1小時。該 反應(yīng)孔;f反用洗滌液洗三次，接75 ]ul/孔加入雜交瘤上清，室溫孵育1 小時。該反應(yīng)板用洗滌緩沖液洗三次，按100/il/孔加入辣根過氧化物 酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠的IgG或IgM的1/25,000稀釋液(用含5%奶的 PBS稀釋)。室溫孵育l小時后，該反應(yīng)板用洗滌緩沖液洗三次，每孔 加入100/ilTMB底物，室溫孵育1-3分鐘。每孔加入50/xl2M硫酸 終止反應(yīng)，用Perkin-Elmer HTS7000酶標儀在450 nm波長處讀凄t, 參考過濾器波長為595 nm。如圖1列表所示，結(jié)果表示為與實驗室的 IgG同種型對照比較，高出背景的倍數(shù)，事先已經(jīng)證明該對照不與所 ;險測的細胞系結(jié)合。AR59A269.5雜交瘤分泌的抗體對結(jié)腸癌細月包系 Lovo顯示了中等強度的結(jié)合，其次是卵巢癌細胞系OVCAR-3。沒有 檢測與其他結(jié)腸癌細胞系SW1116的結(jié)合(ND)。 AR59A269.5與正常 的皮膚細胞系CCD-27sk的結(jié)合力最差。進行抗體結(jié)合試—險的同時，在MDA-MB-231、 0VCAR-3 、 SW1116、 Lovo和CCD-27sk這些細胞系上，檢測了雜交瘤上清的 細胞毒性。4丐黃綠素AM(Eugene, OR)購自Molecular Probes 乂>司，才艮 據(jù)下述操作進行分析。在分析前，將細胞根據(jù)預(yù)先確定的適當密度進 行鋪板。兩天后，將75/il來自雜交瘤微孔板的上清轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)板 中，在5。/。C02孵箱中孵育5天。將陽性對照孔吸凈，加入100jLd疊 氮鈉(NaNs大于〉.01%, Sigma， Oakville， ON)、放線菌酮(cycloheximide) (CHX, 0.5 /iM, Sigma, Oakville, ON)或抗-EGFR抗體(c225, IgGl, k, 5 /ig/mL, Cedarlane， Hornby, ON)。經(jīng)過5天的處理后，倒空反應(yīng)板的液 體并吸干。通過多通道塑料擠瓶，將含MgCl2和CaCl2的室溫 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)分到每孔中，叩打三次，倒 出液體并吸干。每孔加入50jLd用含MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋的 熒光染料鈣黃綠素(calcein)，在37°C含5% C02的孵箱內(nèi)孵育30分鐘。 反應(yīng)板置于Perkin-Elmer HTS7000熒光讀板儀內(nèi)讀數(shù)，數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel進行分析。結(jié)果在圖1的表格中列出。AR59A269.5雜 交瘤上清對OVCAR-3細胞產(chǎn)生了 15%的特異性細胞毒性作用，陽性對照疊氮鈉和放線菌酮對OVCAR-3細胞產(chǎn)生的細胞毒性作用分別是 22%和42%。 AR59A269.5對SW1116細胞也產(chǎn)生了 46%的特異性細胞 毒性作用，高于放線菌酮產(chǎn)生的細胞毒性作用，高于針對表皮生長因 子受體的c225抗體產(chǎn)生的細胞毒性作用的2倍。圖1的結(jié)果表明 AR59A269.5的細胞毒效應(yīng)與其對這兩種癌細胞的結(jié)合水平并不成比 例。盡管AR59A269.5與Lovo的結(jié)合能力高于OVCAR-3,但在測定 中只沖全測到了對OVCAR-3細胞的離體毒性作用。如圖1所示， AR59A269.5對CCD- 27sk正常細胞系并沒產(chǎn)生細胞毒效應(yīng)。如預(yù)期 的 一致，已知的非特異性的細胞毒物質(zhì)放線菌酮和疊氮鈉產(chǎn)生了廣泛 的細胞毒性作用，抗EGFR抗體c225對SWl 116細胞產(chǎn)生了毒性作用。實施例2 離體結(jié)合試驗在轉(zhuǎn)瓶(Corning Inc. NY， USA)內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤細胞，10到14天后， 收集上清，制備AR59A269.5單克隆抗體。然后用蛋白G瓊脂糖4快 流(Protein G Sepharose 4 Fast Flow) (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe, QC)進行標準的抗體純化操作。本發(fā)明的范圍包括利用去免疫 原性的、人源化的、嵌合的或鼠源化的單克隆抗體。用流式細胞儀(FACS)評價了 AR59A269.5 與乳腺 (MDA-MB-231 )、結(jié)腸(DLD-1， Lovo, SW620和SWl 116)、前列腺(PC-3) 和卵巢(OVCAR-3)癌細胞系及來自皮膚(CCD-27sk)和肺臟(Hs888丄u) 的非癌細胞系的結(jié)合。所有細胞系來自美國典型培養(yǎng)物保存中心 (ATCC; Manassas, VA)。用DPBS(不含鉤離子和4美離子)洗滌單層細胞， 制備用于流式細胞術(shù)的細胞。然后在37。C條件下，用細胞解離緩沖液 將細胞從細胞培養(yǎng)板上分離出來。離心收集細胞，在4。C下，將細胞 重懸在含MgCl2、 CaCh和2%胎牛血清的DPBS (標記培養(yǎng)液)中，記 數(shù)，調(diào)整到合適的細胞密度，離心沉淀細胞，重懸在4。C的標記液中， 加入20 /xg/mL的測試抗體(AR59A269.5)或?qū)φ湛贵w(同種型對照，抗 -EGFR),冰上放置30分鐘。在加Alexa Fluor 546偶聯(lián)的二抗前，細 胞用標記液洗一次。然后加入溶于標記培養(yǎng)液中的Alexa Fluor 546偶聯(lián)的二抗，4°C置30分鐘。最后洗滌一次細胞，并重懸在固定液(含 1.5%多聚曱醛的標記培養(yǎng)液)中。通過在FACSarrayTM上運行樣本來評 測流式細胞計數(shù)的細胞獲取結(jié)果，F(xiàn)ACSarray 使用FACSarray 系 統(tǒng)軟件(BD Biosciences, Oakville, ON)。通過調(diào)整FSC和SSC探測 器上的電壓和振幅，設(shè)置細胞的前向角散射(FSC)和側(cè)向角散射(SSC)。 運行未標記的細胞來調(diào)整熒光(Alexa-546)通道的探測器，使這些細胞 有一個統(tǒng)一的約為1-5單位的中等熒光強度的波峰。對于每一個樣本， 約需要獲取10,000個門事件(著色的固定細胞)，用于分析，結(jié)果見圖 2。圖2把平均熒光強度高于同種型對照的倍增制成表格。圖3匯集 了 AR59A269.5抗體代表性的直方圖。AR59A269.5對結(jié)腸癌細胞系 DLD-1 (192.9倍)，Lovo (109.1倍)，和SW620 (138.3倍)的結(jié)合力最強。 對SW1116結(jié)腸癌細胞系(44.2倍)、卵巢癌細胞系OVCAR-3 (93.7倍) 和前列腺癌細胞系PC-3 (31.6倍)也有強的結(jié)合力。與乳腺癌細胞系 MDA-MB-231 (5.3倍)的結(jié)合弱。AR59A269.5不與正常的肺細胞系 Hs888丄u和皮膚細胞系CCD-27sk結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明AR59A269.5 可以與不同的人癌細胞系結(jié)合，與結(jié)腸癌細胞系的結(jié)合力最強。既然沒有4企測到AR59A269.5與兩種正常的人細胞系結(jié)合，表明 AR59A269.5呈現(xiàn)選擇性結(jié)合的特點。這些結(jié)果與實施例1獲得的結(jié) 果一致。實施例3在體Lovo細胞的腫瘤實驗實施例1和2表明AR59A269.5對結(jié)腸和卯巢癌細胞系有抗癌特 性，對結(jié)腸癌細胞系顯示出最高的結(jié)合活性。隨后在人類結(jié)腸癌的在 體模型中檢測了該抗體的作用。參見圖4和5，將100 /d含有l(wèi)百萬 個人結(jié)腸癌細胞(Lovo)的生理鹽水植入到4-6周雄性SCID小鼠頸背皮 下。這些小鼠被隨機分成兩個治療組，每組5只。移植癌細胞后的第 一天，按20 mg/kg的劑量給小鼠腹腔給予AR59A269.5測試抗體或緩 沖液對照，用含2.7 mM KC1, 1 mM KH2P04， 137 mM NaCl和20 mMNa2HP04的稀釋液將儲存液稀釋后，每組注射300/il的液體量。隨后 抗體組和對照組以相同的方式每周給藥一次， 一共7周。大約每7天 用測徑器測量腫瘤生長， 一直測到第8周或個體動物達到了加拿大動 物保護協(xié)會規(guī)定的極限。在試驗過程中， 一周記錄一次動物的體重。 試驗結(jié)束時，依據(jù)CCAC的指導(dǎo)方針，所有的動物都采取安樂死。在預(yù)防性人結(jié)腸癌在體;f莫型中，AR59A269.5抑制腫瘤生長，并 減輕腫瘤的負荷。在種植后的第49天，也是最后一次給藥的前1天， AR59A269.5治療組肺瘤的平均體積是緩沖液對照組胂瘤體積的 38。/。(p^.0335，t檢驗,圖4)。在整個實驗過程中，沒有出現(xiàn)臨床毒性癥狀。每周一次測得的體 重作為動物健康和發(fā)育停止的指標。如圖5所示，在處理結(jié)束時，兩 組的體重沒有明顯差異^=0.2391, t-4企驗)。在每組內(nèi)，動物的平均體 重從實-瞼開始到結(jié)束都沒有明顯變化(緩沖液處理組p=0.0752, t-4企-驗; AR59A269.5-治療組p=0.4234)。因此AR59A269.5在人類結(jié)腸癌異種移植模型中耐受性良好，能 夠降低腫瘤的負荷。實施例4在體DLD-1細胞的腫瘤實-瞼實施例3的結(jié)果延及人類結(jié)腸癌的不同模型。參見圖6和7,將 100 /xl含有5百萬個人結(jié)腸癌細胞(DLD-1)的生理鹽水皮下注入到4-6 周雌性SCID小鼠頸背皮下。這些小鼠被隨機分成兩個治療組，每組5 只。植入癌細胞后第一天，按20 mg/kg的劑量對每組腹腔給予 AR59A269.5測試抗體或i爰沖液對照，用含2.7 mM KC1, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀釋液將儲存液稀釋后，以300/xl 的液體量給藥。隨后抗體組和對照組樣品以相同的方式每周注射一次， 貫穿整個實驗過程。大約每7天用測徑器測量一次腫瘤的生長。注射 7次(48天)后，因為動物由于大的潰瘍達到了 CCAC規(guī)定的極限，結(jié) 束實驗。在整個實驗過程中， 一周記錄一次動物的體重。試驗結(jié)束時， 依據(jù)CCAC的指導(dǎo)方針，所有的動物都采取安樂死。在預(yù)防性的人結(jié)腸癌在體;f莫型中，AR59A269.5預(yù)防腫瘤生長， 減輕腫瘤負荷。在植入后的第48天，也是最后一次給藥后5天， AR59A269.5治療組腫瘤的平均體積是對照組腫瘤體積的19%(p==0.001 t檢驗，圖6)。在整個實驗過程中，沒有出現(xiàn)臨床毒性癥狀。每周一次測的體重 作為動物健康和發(fā)育停止的指標。如圖7所示，在整個實驗過程中， 兩組的體重沒有明顯差異。在組內(nèi)，動物的平均體重在整個實驗過程 中變化不明顯。因此AR59A269.5在兩種不同的人類結(jié)腸癌異種移植模型中耐受 性良好，都能夠降低胂瘤的負荷。實施例5人類腫瘤異種移植物染色利用免疫組化(IHC)研究來表征AR59A269.5抗原在人類腫瘤異種 移植物中的分布。IHC最優(yōu)化研究表明抗體不結(jié)合福爾馬林固定的組 織，但與冷凍組織切片結(jié)合。腫瘤異種移植物從SCID小鼠體內(nèi)獲得， 這些小鼠飼養(yǎng)在多倫多全科醫(yī)院的動物實驗室內(nèi)。小鼠注射了結(jié)腸癌 細胞SW1116或乳腺癌細胞MDA-MB-231。細胞系來自美國典型培養(yǎng) 物保藏中心(ATCC; Manassas, VA)。腫瘤浸入OCP包埋膠中并迅速凍 入液氮內(nèi)。組織塊送至多倫多全科醫(yī)院的病理研究項目實驗室進行處 理。組織切片從-80。C轉(zhuǎn)到-20。C, 1小時后，切片用冷(-20。C)丙酮固 定10分鐘，然后回到室溫中。切片用冷(4。C)PBS洗三次，每次2分 鐘。然后將切片浸入3%過氧化氫中孵育IO分鐘，PBS洗3次，每 次5分鐘，干燥后用通用的封閉液室溫孵育5分鐘。將AR59A269.5 用抗體稀釋緩沖液(Dako, Toronto, Ontario)稀釋到工作濃度(5/xg/mL)。 細胞角蛋白-7作為陽性的抗體對照(即用型；Dako, Toronto, Ontario)， 抗體稀釋緩沖液(Dako, Toronto, Ontario)作為陰性對照。 一抗室溫孵育 1小時。切片用PBS洗3次，每次5分鐘。加入HRP標記的二抗(即 用型；Dako Envision System, Toronto, Ontario),室溫孵育30分鐘，枱，測/觀察一抗的免疫反應(yīng)性。這步之后，將切片用PBS洗3次，每次5 分鐘，然后加入DAB (3,3'-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽，Dako， Toronto, Ontario)顯色底物液，室溫下進行免疫過氧化物酶染色10分鐘，發(fā)生 顏色反應(yīng)。自來水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。切片用Meyer's蘇木精 (Sigma Diagnostics, Oakville, ON)復(fù)染后，梯度酒精(75-100%)脫水，二 曱苯透明。用固定劑封片。使用Axiovert200型顯微鏡觀察切片，用 Northern Eclipse成像軟件獲取和儲存圖像。結(jié)果由組織病理學(xué)家讀 取、評價和解釋。AR59A269.5與人類異種移植物(結(jié)腸癌 SW1116和乳腺癌 MDA-MB-231)的結(jié)合活性檢測表明AR59A269.5與SW1116有強的結(jié) 合力，與MDA-MB-231的結(jié)合力較弱(圖8)。結(jié)合局限在腫瘤細胞。 AR59A269.5在SW1116細胞定位于膜，在MDA-MB-231細胞定位于 胞質(zhì)膜，染色呈彌散狀(圖9)。 SW1116細胞的陽性率超過50%， MDA-MB- 231細胞的陽性率不到50%。這些結(jié)果肯定了實施例2中這 些細胞系離體的FACS結(jié)果，表明在體內(nèi)的異種移植物中仍有該抗原 表達。此優(yōu)勢證據(jù)表明AR59A269.5通過與存在癌細胞和人類腫瘤組織 上的抗原決定簇結(jié)合介導(dǎo)了抗癌作用。進一步表明，利用例如(但并不 局限于)FACS、細胞ELISA或IHC等技術(shù)，AR59A269.5抗體可以用的技術(shù)人員的水平。所有專利和公開出版物通過引用的方式并入本文， 其引用程度如同每個出版物被特別單獨地指明以引用的方式并入本 文。應(yīng)該明白，盡管本發(fā)明以某種形式被說明，但這不是要將本發(fā)明 限定在本文所描述和顯示的特定形式或布局。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯 而易見的是，在不偏離本發(fā)明的范圍的前提下還可做出各種變化，本 發(fā)明并不局限于本說明書中所顯示和描述的內(nèi)容。本領(lǐng)域的技術(shù)人員 很容易看出使本發(fā)明較好地適合實現(xiàn)所描述的目的獲得最終結(jié)果和益處，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相關(guān)化合物、方法、流程和技術(shù)都是優(yōu)選實施方案中有代表性的， 其目的在于示例，并不是限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠 想到包括在本發(fā)明精神的范疇內(nèi)的變化和其它用途，并由所附權(quán)利要 求書的范圍所限定。盡管借助特定的優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但 是應(yīng)理解所要求保護的本發(fā)明并不僅僅局限于這些特定的實施方案。 事實上，所描述的實施本發(fā)明的一些方式的的各種變化，對本領(lǐng)域的 技術(shù)人員來說是顯而易見的，均在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。加拿大國際保藏機構(gòu) 電話(204)789-2070加拿大衛(wèi)生部國立微生物學(xué)實驗室 傳真(204)789-2097加拿大馬尼托巴省溫尼伯市阿林頓街1015R3E 3R2_國際IDAC/BP/4表微生物保藏證明(譯文)(根據(jù)布達佩其斤條約第7.1條發(fā)布)所附文件為原始保藏合同與活存聲明的副本1、 國際保藏機構(gòu)接受了以下具體描述的微4tl 保藏人姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦萊麗)地址 ARIUS Research. Inc. 55 York Street. Suite 1600. Toronto. ON M5J 1R7(加拿大多倫多阿里烏斯研究公司) 提交曰期2005年5月17日2、 保藏的標識保藏人對培養(yǎng)物指定的名稱和符號-AR59A269.5由該國際保藏機構(gòu)給予的保藏號:170505-01科學(xué)性描述和/或預(yù)計的分類學(xué)指定:□科學(xué)性描述□預(yù)計的分類指定3、國際保藏機構(gòu)IDAC授權(quán)代表簽^日期2005年5月17日
權(quán)利要求
1.由雜交瘤細胞產(chǎn)生的分離的單克隆抗體，該雜交瘤細胞系保藏于IDAC，保藏號為170505-01。
2. 由權(quán)利要求1所述分離的單克隆抗體產(chǎn)生的人源化抗體。
3. 由權(quán)利要求1所述分離的單克隆抗體產(chǎn)生的嵌合抗體。
4. 分離的雜交瘤細胞系，以保藏號170505-01保藏在IDAC。
5. 引發(fā)抗體i秀導(dǎo)的選自人類腫瘤的組織樣本中癌細胞的細胞毒 性作用的方法，其包括提供所述人類腫瘤的組織樣本；提供由保藏于IDAC、保藏號為170505-01的雜交瘤產(chǎn)生的分離的 單克隆抗體或其CDMAB,其中CDMAB的特征在于能夠竟爭性抑制 所述分離的單克隆抗體與其靶抗原的結(jié)合；以及將所述分離的單克隆抗體或其CDMAB與所述組織樣本接觸； 其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB與所述組織樣本的結(jié)合 誘導(dǎo)細胞毒性作用。
6. ^l利要求1所述分離的單克隆抗體的CDMAB。
7. 權(quán)利要求2所述的人源化抗體的CDMAB。
8. 權(quán)利要求3所述的嵌合抗體的CDMAB。
9. 權(quán)利要求l、 2、 3、 6、 7或8中的任一項所述的分離抗體或其 CDMAB,其與選自細胞毒部分、酶、放射活性化合物和造血細胞的 成員結(jié)合。
10. 確定選自人腫瘤的組織樣本中癌細胞存在的結(jié)合分析，所述 癌細胞特異性地被AR59A269.5雜交瘤細胞系產(chǎn)生的分離的單克隆抗 體結(jié)合，該雜交瘤細胞系在IDAC的保藏號為170505-01，所述分析包 括..提供所述人類胂瘤的組織樣本；提供至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB,所述單克隆抗體 或其CDMAB識別的一種或多種抗原決定》i與AR59A269.5雜交瘤細 胞系產(chǎn)生的分離的單克隆抗體識別的 一種或多種抗原決定簇相同，該 雜交瘤細胞系在IDAC的保藏號為170505-01;將所述的至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB與所述組織樣 本才妄觸；以及確定所述的至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB與所述組織 樣本的結(jié)合；由此指示出在所述組織樣本中所述癌細胞的存在。
11. 治療哺乳動物中人類胂瘤的方法，其中所述人類腫瘤表達至 少一種能特異性與分離的單克隆抗體或其CDMAB相結(jié)合的抗原決定 簇，該分離的單克隆抗體由保藏在IDAC、保藏號為170505-01的克隆 所編碼，其CDMAB的特征是具有竟爭性抑制所述分離的單克隆抗體 與其靶抗原結(jié)合的能力，所述方法包括給予所述哺乳動物降低所述哺 乳動物的腫瘤負荷的有效量的所述單克隆抗體或其CDMAB。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體與 細胞毒性部分偶聯(lián)。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述細胞毒性部分是放射性 同位素。
14. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體或其CDMAB活化補體。
15. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體或 其CDMAB介導(dǎo)抗體依賴的細胞毒性作用。
16. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體是 人源化的。
17. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體是 嵌合的。
18. 治療哺乳動物中對抗體誘導(dǎo)的細胞毒性作用敏感的人類腫瘤 的方法，其中所述的人類腫瘤表達至少一種與分離的單克隆抗體或其 CDMAB特異結(jié)合的抗原決定簇，該抗體由保藏在IDAC、保藏號為 170505-01的克隆所編碼，其CDMAB的特征是具有竟爭性抑制所述 分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述方法包括給予所述哺 乳動物降低所述哺乳動物的腫瘤負荷的有效量的所述單克隆抗體或其 CDMAB。
19. 如^L利要求18所述的方法， 細胞毒性部分偶聯(lián)。
20. 如;f又利要求19所述的方法, 同位素。
21. 如權(quán)利要求18所述的方法, 其CDMAB活化補體。其中所述的分離的單克隆抗體與其中所述細胞毒性部分是放射性其中所述的分離的單克隆抗體或
22.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體或 其CDMAB介導(dǎo)抗體依賴的細胞毒性作用。
23. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體是 人源化的。
24. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體是 嵌合的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用新型篩選模式制備患者癌性疾病調(diào)節(jié)抗體的方法。該方法利用癌細胞細胞毒性作用作為指標來分離抗癌抗體，使制備用于診斷和治療的抗癌抗體成為可能。該抗體可用于輔助腫瘤分期和診斷，還可用于治療原發(fā)性腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移。該抗癌抗體能夠與毒素、酶、放射性化合物和造血細胞偶聯(lián)。
文檔編號A61K47/48GK101277977SQ200680036742
公開日2008年10月1日 申請日期2006年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月2日
發(fā)明者利薩·M·切凱托, 大衛(wèi)·S·F·楊, 蘇姍·E·哈恩 申請人:阿里烏斯研究公司