專利名稱：：含有吩嗪化合物作為活性成分的藥物組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及藥物組合物和用作藥物組合物的活性成分的新的化合物。本發(fā)明的組合物對治療和/或預防例如包括耐藥性癥疾的痞疾病、利什曼病、包括非洲昏睡病和恰加斯氏病的錐蟲病、弓形體病和隱孢子蟲病等與感染寄生蟲有關的疾病特別有用。發(fā)明背景目前主要在熱帶和亞熱帶地區(qū)，仍能經(jīng)常發(fā)現(xiàn)寄生性原蟲感染疾病，包括例如疰疾、利什曼病、非洲錐蟲病(非洲昏睡病)、美洲錐蟲病(恰加斯氏病)、弓形體病、、淋巴絲蟲病、巴貝蟲病和隱；包子蟲病。它們分為僅人受感染的疾病和人類與家畜或小動物均受感染的疾病，兩者都會造成嚴重的、經(jīng)濟和社會損失。一些感染上述疾病的病人表現(xiàn)出嚴重的癥狀以至于他們不能過正常的社會生活，或者他們不得不長期躺在床上需要護理。上述疾病甚至可能發(fā)展成致命的癥狀。然而，臨床上沒有能有效抵抗上述疾病的疫苗，并且認為這樣的疫苗在未來也難于開發(fā)出來。對一些上述疾病沒有治療藥物。一些上述疾病的治療藥物有以下問題它們可造成耐原蟲的出現(xiàn)和擴散及其嚴重的副作用。例如，現(xiàn)有利什曼病的治療劑葡萄糖酸銻，在其分子中有銻原子，因銻原子引起的中毒在治療中的副作用是不可避免的。用于非洲錐蟲病的初期治療的美拉胂醇在其分子中具有砷原子，其因砷原子的中毒將造成嚴重的副作用。鑒于上述原因，強烈希望盡快研制出可以口服、注射給藥等有效的治療制劑。已知具有低氧化水平的下面通式(2)表示的吩喝溱化合物對衍生自將會造成錐蟲病的鼠弓形體的脫氬葉酸還氧酶具有抑制活性(專利文獻1),表明所迷化合物對寄生蟲感染疾病也許有效。然而，仍不清楚該化合物對除了弓形體屬以外的寄生蟲、活的寄生蟲或在宿主中實際上為寄生狀態(tài)的寄生蟲，即在細胞水平或個體水平下是否也能顯示出任何療效。完全不清楚這些化合物與它們對寄生蟲感染疾病的潛在效果的因果關系并且不能預測。[化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(2)已知下述式表示的亮曱酚藍在體外(細胞)分析系統(tǒng)中顯示出對將會造成瘧疾的鐮狀瘧原蟲W2的增殖抑制作用(非專利文獻1).然而，它在使用活的動物的體內(nèi)分析中沒有顯示出對瘧疾的高的治療效果。因此，不能從非專利文獻l的公開內(nèi)容預測具有兩個雙取代的氨基的吩-惡。秦對疾疾具有任何療效。除此之外，該文獻也完全沒有提及除了癡疾之外，對其它寄生蟲感染疾病的療效的任何可能性。而且完全不清楚該化合物與其對寄生蟲感染疾病的潛在效果的因果關系且不能預測。[化合物2](3)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>非專利文獻1顯示出通式(3)的吩哺嗪和下面與其相類似的化合物對惡性瘧原蟲的增殖抑制作用(在體外下的鐮狀瘧原蟲W2)。這些化合物對上述原蟲的EC5。值總結在表1中。[化合物3]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>[表1]化合物EC5o(nM)『2)亮曱酚藍5.52±3.06梧花青674±159焦寧Y449±201藏紅034.8±17.2天青B12.7±7.36亞曱藍3.99±2.31治愈率(抑制率)，即按照5mg/kg/天腹腔給藥方案，連續(xù)4天治療感染疰疾的小鼠后，獲得血液中受瘧疾感染的紅細胞數(shù)目的減少比率。結果示于表2中。抑制率100%表明完全治愈。[表2]化合物抑制率(％)亮曱酚藍11.0梧花青15.6焦寧Y20.6藏紅014.0天青B9.1亞曱藍15.9上述結果教導了在非專利文獻1中公開的化合物沒有顯示出在體內(nèi)分析系統(tǒng)下高的增殖抑制效果，并且不能預期它們的實際療效。除此之外，用該化合物治療的動物與未治療的動物相比，生命僅能延長大約1天或2天。因具有高的急性毒性，它們不適合于大量給藥，并且用這些化合物將很難實現(xiàn)高的治療效果。[專利文獻1]PCT/US00/01968[非專利文獻1]AntimicrobialAgentsandChemotherapy,1995,Vol.39pp.2671-2677發(fā)明概述因此本發(fā)明的目的在于提供藥物組合物，特別是用于治療和/或預防原蟲寄生感染的藥物組合物，該藥物組合物對原蟲寄生感染具有高的療效和選擇毒性或者延命效果。本發(fā)明人進行深入研究，最終發(fā)現(xiàn)含有通式(1)表示的化合物的藥物組合物即使在體內(nèi)分析系統(tǒng)中對原蟲寄生感染也顯示出高的增殖抑制效果。本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)而完成的。因此，本發(fā)明涉及以下方面。1.含有由下面通式(1)表示的化合物作為活性成分的藥物組合物。[化合物4]其中Rl和R2可以相同或不同，獨立地表示烷基、芳基或雜環(huán)基、它們可以任選具有取代基羥基、烷氧基、卣素、氨基、氰基、磺酸基、羧基、酯基、酰氨基或硝基，或者可以縮合形成環(huán)；R3和R4可以相同或不同，獨立地表示烷基、芳基或雜環(huán)基、它們可以任選具有取代基羥基、烷氧基、卣素、氨基、氰基、磺酸基、羧基、酯基、酰氨基或硝基，或者可以縮合形成環(huán)；R5和R6可以相同或不同，獨立地表示卣素、烷基、芳基或雜環(huán)基、羥基、烷氧基、酰氧基、氨基、氰基、磺酸基、羧基、酯基、酰氨基或硝基、或可以形成脂族環(huán)、芳環(huán)、脂族雜環(huán)或芳香雜環(huán)；m和n獨立地表示0~3的整數(shù)；并且Q是藥物上可接受的陰離子。2.上述l所述的藥物組合物，其中R1、R2、R3和R4獨立地表示具有1~6個碳原子的烷基。3.上述1或2所述的藥物組合物，其中Q是卣素離子或高氯酸離子。4.上述l-3任一項所述的藥物組合物，其中R1和R2、或R3和R4縮合形成環(huán)。5.上述4所述的藥物組合物，其中所述環(huán)是哌嗪環(huán)或嗎啉環(huán)。6.含有任何一種下述化合物作為活性成分的藥物組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>7.用于治療和/或預防原蟲寄生感染的上述l6任一項所述的藥物組合物。8.上述7所述的藥物組合物，其中寄生感染是疾疾、利什曼病、非洲昏睡病(Africansleepingdisease)、'險力口其斤氏病、弓開》體病、'淋巴絲蟲病(lymphofilariasis)、巴貝蟲病或5求蟲病。9.上述8所述的藥物組合物，其中寄生感染是疾疾、利什曼病、非洲昏睡病或恰加斯氏病。10.上述9所述的藥物組合物，其中寄生感染是癡疾。11.用于治療和/或預防原蟲寄生感染的上述1-10任一項所述的藥物組合物，含有通式(1)表示的化合物1mg~10,000mg。12.用于治療和/或預防原蟲寄生感染的上述l-ll任一項所述的藥物組合物，其中所述組合物是液體、片劑、丸劑或膠體形式。13.由命名為A-8、A-9和A-ll的任意一種結構表示的吩-惡溱镥化(phenoxazinium)合物。在本發(fā)明的藥物組合物中所含有的作為活性成分的化合物即使在低給藥量的情況下，也將特別對原蟲寄生感染顯示出增殖抑制效果。即使在它們的給藥劑量比對寄生蟲原蟲顯示出增殖抑制效果的劑量高的情況下，也不會傷害哺乳動物的細胞。因此，它們具有高的選擇毒性。還證實了在體內(nèi)分析試驗中，上述化合物能夠抑制寄生蟲原蟲的生長而沒有顯示出任何例如急性毒性的副作用，并且顯示出療效和顯著的延命效果。除此之外，由于本發(fā)明的化合物不含有例如銻或砷等有毒原子，因此它們沒有造成任何副作用的危險。具體實施方式下面更具體地說明本發(fā)明的藥物組合物。對于各種化合物，測定其對作為致病因素的寄生蟲原蟲的增殖抑制效果，并針對它們對哺乳動物細胞的細胞毒性進行分析。以各種量和形式對作為宿主模型的感染瘧疾的小鼠給藥，以便分析它們的療效。使用上述體內(nèi)分析系統(tǒng)，以5~10mg/kg的劑量，尋找與沒有治療的情況相比顯示50%以上疾疾原蟲增殖抑制效果的化合物。結果發(fā)現(xiàn)，由通式(l)表示的化合物顯示出上述效果。下面更詳細地說明這些化合物。通式(1)中的烷基R1~R4優(yōu)選具有1~12個碳原子，更優(yōu)選1~6個碳原子，可以是直鏈狀、支鏈狀或環(huán)狀。例如包括曱基、乙基和丁基在內(nèi)的烷基。烷基可以具有取代基。通式(1)中的芳基R1~R4優(yōu)選具有5-15個碳原子，更優(yōu)選6~10個碳原子。通式0)中的的雜環(huán)基R1-R4優(yōu)選5-8元環(huán)，更優(yōu)選5或6元環(huán)。雜原子包括氮原子、氧原子、硫原子、硒原子、碲原子和磷原子。其中優(yōu)選氮原子、氧原子、硫原子和硒原子。雜環(huán)基的實例包括吡咯、呋喃、哌啶、嗎啉、哌。秦、吡啶和吡咯烷，它們可以具有取代基。Rl和R2或R3和R4可以縮合形成3~12元、優(yōu)選5~7元的々包和或不飽和環(huán)。飽和或不飽和環(huán)的實例包括雜環(huán)，例如旅咬、哌噪、嗎啉、吖庚因、p比。各和四氪p比。定。可以通過R5和R6的縮合形成的脂族環(huán)、芳環(huán)、脂族雜環(huán)或芳香雜環(huán)的實例包括環(huán)己烯環(huán)、環(huán)戊烯環(huán)、苯環(huán)、萘環(huán)、二氫吡咯環(huán)、四氫吡。定環(huán)、吡咯環(huán)、呋喃環(huán)、吡啶環(huán)和吲哚環(huán)。上述取代基的優(yōu)選實例包括烷基例如曱基、乙基、丙基和異丙基；芳基例如苯基和萘基；氨基；二烷基氨基；羥基；烷氧基；酰氧基；羧基；烷氧基羰基；氨基羰基；腈基；磺酸基；硝基；氯；氟和溴。"Q"是在通式(l)的化合物中電荷平衡所必需的。關于"Q"的術語"藥物上可接受的陰離子"是指當對受體給藥時不會顯示出任何毒性并能使上述化合物溶解在含水系統(tǒng)中的離子。"Q"優(yōu)選的實例包括卣素離子例如氯離子、溴離子和碘離子；磺酸根離子例如包括曱磺酸根離子、三氟曱磺酸根離子、對甲苯磺酸根離子、萘磺酸根離子、2-羥基乙磺酸根離子在內(nèi)的脂族和芳香族磺酸根離子；氨基磺酸根離子例如環(huán)己烷氨基磺酸根離子；硫酸根離子例如曱基硫酸根離子和乙基硫酸根離子；硫酸氫根離子；硼酸根離子；烷基和二烷基磷酸根離子例如二乙基磷酸根離子和甲基磷酸氫根離子；焦磷酸根離子例如三甲基焦磷酸根離子；羧酸根離子，其羧基和羥基可以經(jīng)常被取代；碳酸根離子；碳酸氫根離子；高氯酸根離子；和氫氧化物離子。"Q"特別優(yōu)選的實例包括氯離子、乙酸根離子、丙酸根離子、戊酸根離子、檸檬酸根離子、馬來酸根離子、富馬酸根離子、乳酸根離子、琥珀酸根離子、酒石酸根離子、苯甲酸根離子、高氯酸根離子和氫氧化物離子。上述化合物的典型實例可以描述如下。然而，不能理解為用于本發(fā)明的化合物將受到上述實例的限制。命名為"A-8"、"A-9"和"A-ll"的化合物是新的化合物，并且本發(fā)明也涉及這些化合物本身。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>參考公知技術例如在非專利文獻1和M丄.Crossley等人的JournalofAmericanChemicalSociety,1952,Vol.74,p.578-584，和K.Andreas等人的EuropeanJournalofOrganicChemistry,1999,Vol.4,p.923-930中記載的技術，可以容易地由已知的起始原料合成本發(fā)明的由通式(l)表示的吩哺。秦鏡化合物。在本說明書中引入這些文獻的全部公開內(nèi)容作為參考。含有由下述通式(l)表示化合物的藥物組合物特別對治療和/或預防各種類型的與感染寄生性原蟲有關的病癥例如瘧疾、非洲錐蟲病(非洲昏睡病)、美洲錐蟲病(恰加斯氏病)、利什曼病、巴貝蟲病、淋巴絲蟲病、弓形體病(機會性傳染病例如AIDS)和隱孢子蟲病(熱帶腹瀉)有用。在本發(fā)明的藥物組合物中，可以含有一種或多種通式(l)的化合物作為活性成分，并可以任選與其它例如本領域技術人元7〉知用于寄生蟲感染疾病的治療劑組合使用。用于寄生蟲感染疾病的治療劑的優(yōu)選實例包括氯p奎、曱氟"lr、青蒿素(Altemisinin)、阿托伐醌(Atov叫uone)和乙胺嘧啶(用于瘧疾)；蘇拉滅(Suramin)、噴他脒、美拉胂醇和殼二孢呋喃酮(用于非洲昏睡病)；用于恰加斯氏病的卡噠唑；用于利什曼病的葡萄糖酸銻、兩性霉素B、米替福星、氟康唑?？膳c本發(fā)明的通式(1)的化合物組合使用的藥物載體或稀釋劑包括氯化鈉；氯化鎂；氯化鋅；葡萄糖；蔗糖；乳糖；乙醇；甘油；甘露糖醇；山梨糖醇；季戊四醇；二甘醇、丙二醇、雙丙二醇、聚乙二醇400和其它聚乙二醇；脂族酸的單-、雙-、三甘油酯例如三月桂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯；果膠；淀粉；海藻酸；木糖；滑石；石松子；油脂例如橄欖油、花生油、蓖麻子油、玉米油、紅花子油、小麥胚芽油、芝麻油、棉籽油、葵花籽油和魚肝油；明膠；卵磷脂；硅石；纖維素；纖維素衍生物例如曱基羥丙基纖維素、曱基纖維素和羥乙基纖維；具12-22個碳原子的脂族酸的鹽例如硬脂酸4丐、月桂酸鈣、油酸鎂、棕櫚酸輛、山崳酸鉤和》更脂酸鎂；環(huán)糊精例如a-環(huán)糊精、(3-環(huán)糊精、丫-環(huán)糊精、羥乙基-P-環(huán)糊精、羥丙基-P-環(huán)糊精、二羥丙基-P-環(huán)糊精、羧甲基乙基-(3-環(huán)糊精、Cycloawaodorin和二曱基-(3-環(huán)糊精；乳化劑例如具有222個碳原子，優(yōu)選10~18碳原子的飽和或不飽和脂族酸和具有1~20個碳原子的脂族一元醇或多元醇例如乙二醇、甘油、二甘醇、季戊四醇、乙醇、丁醇和十八烷醇的酯；和硅例如二曱基聚硅氧烷。除此之外，本發(fā)明的藥物組合物還可進一步含有任何其他的一般用于藥物組合物中且對本領域技術人元來說公知的載體。本領域技術人元可以根據(jù)致病寄生蟲的種類、寄生蟲的寄生部位、疾病的嚴重程度、治療方案和病人的年齡、體重、性別、整體健康狀況和種族(基因)背景，任意地選擇本發(fā)明化合物的藥物有效量和給藥途徑或方法。一般來說，化合物的給藥量為體重的1mg~10,000mg/天/70kg,更一般性的為體重的50mg~2,000mg/天/70kg。根據(jù)給藥途徑、方法等等，本發(fā)明的藥物組合物可以制備成任何一種本領域技術人元公知的制劑。例如，藥物組合物與上述載體或稀釋劑可以以液體、片或膠體的形式給藥。液體制劑可以以溶解在5%葡萄糖水溶液中的形式或與上述載體或稀釋劑一起靜脈注射、腹腔內(nèi)注射或皮下注射。片劑可以口服給藥，膠體制劑可以涂在皮膚上。根據(jù)其目的和形式、給藥對象等，藥物組合物可以含有適當量的，例如通常約為1mg~10,000mg,優(yōu)選約為10mg~3,000mg的化合物。下面參照實施例舉例說明由通式(l)表示的化合物和含有這些化合物作為活性成分的藥物組合物的優(yōu)點。然而本發(fā)明的范圍不受這些實施例的限制。命名為"A-1(60%純度)"的化合物購自MPBiomedicalProduct,Co.，可以直接使用而不用任何進一步的純化。用于實施例中的其它化合物具有95°/。或更高的純度，如通過1H-NMR和元素分析所保證的。實施例1高氯酸3-二丁泉氨基-7-二乙基氨基吩嗜嗪鏡(化合物A-8)的合成在室溫下，將3-丁基氨基苯酚(l.OmL,4.43mmol)和N,N-二乙基-4-亞硝基苯胺(790mg,4.43mmol)的混合物懸浮在乙醇(55mL)中，并將60%的高氯酸水溶液(0.5mL)滴加到懸浮液中。將所得混合物加熱回流3小時，冷卻至室溫。然后在減壓下濃縮至其溶劑起始體積的一半，并冷卻至0。C。過濾除去所得沉淀物并將濾液濃縮。通過硅膠色譜(洗脫液氯仿乙酸乙酯=9:l)純化濃縮的粗物質(zhì)，得到粗制化合物。將所得粗制化合物溶解在甲醇中并冷卻至0°C,往其中加幾滴乙醚進行結晶。過濾所得深藍色結晶，得到高氯酸3-二丁基氨基-7-二乙基氨基吩喝。秦鏡(33.3mg，分離收率2%)。1H-NM,0MHz,CD3OD)5:7,77(d,2H.J=9.8Hz),7.38(dd,1H,J=9.8,2.6Hz)'7.35(dd,1H,J=9.8,2.6Hz),377(q,4H,J=7.1Hz),370(q,4H，J-7.8Hz),1.74(m,4H)，1,46(m,4H)，1.35(t，6H,J=7.1Hz),1.02(t,6H，J=7.5Hz).FAB-MS380.實施例2高氯酸3-乙基曱泉氨基-7-二曱基氨基吩^嗪,(化合物A-9)的合成在室溫下，將3-曱基乙基氨基苯酚(300mg,1.98mmol)和N,N-二甲基-4-亞硝基苯胺(298mg,1.98mmo1)的混合物懸浮在乙醇(15mL)中，并將70%的高氯酸水溶液(0.5mL)滴加到懸浮液中。將所得混合物加熱回流6小時，冷卻至室溫并在減壓下蒸餾以除去溶劑。通過硅膠色i普(洗脫液氯仿乙酸乙酯=9:1)將所得粗物質(zhì)純化，得到粗制化合物(216mg,粗收率27。/。)。將所得粗制化合物溶解在曱醇中并冷卻至0。C進行結晶。過濾所得深藍色結晶，得到高氯酸3-乙基甲基氨基-7-二曱基氨基吩嗜嗪镥(13.3mg，分離收率2%)。1H-NMR(400MHz,CDCI3)S:7.80(s，1H),7.78(s,1H),7.41(dd，1H,J=6.8,2.8Hz),7.39(dd,1H,J=6.8,2.8Hz),6.96(d,1H,J=2.8Hz),6.94(d,1H，J-2.8Hz),3.81(q，4H,J=7.2Hz)，3.41(s,6H),3.38(s,3H),1.34(t,3H，J-7.2Hz).FAB-MS282.實施例33-二甲基氨基-7-(l-哌嗪基)氯化吩，嗪鏡單鹽酸鹽(化合物A-ll)的合逸在室溫下，將3-(l-哌嗪基)苯酚(165mg,0.92mmo1)和N,N-二曱基-4-亞硝基苯胺(139mg,0.92mmo1)的混合物懸浮在乙醇(50mL)中，并將70%的高氯酸水溶液(0.5mL)滴加到懸浮液中。將所得混合物加熱回流6小時，冷卻至室溫并在減壓下蒸餾以除去溶劑。通過石圭膠色譜(洗脫液氯仿乙酸乙酯=9:1)將所得粗物質(zhì)純化，得到粗制化合物(65mg)。將所得粗制化合物溶解在曱醇中，與離子交換樹脂AmberlyteIRA-400(Cl)混合并在室溫下放置2小時。然后過濾所得混合物，并進一步用曱醇洗滌樹脂。在減壓下濃縮收集的濾液進行結晶。過濾所得深藍色晶體，得到3-二曱基氨基-7-(l-哌。秦基)氯化吩喵。秦像單鹽酸鹽(49.2mg,分離收率14%)。1H穆R(400MHz,CD3OD)S:7.91(d,1H,J=9.3Hz),7.84(d,1H，J=9.6Hz),7.59(dd,1H,J=9.6,2.7Hz),7,49(dd,1H,J=9.3,2.7Hz),7.22(d，1H,J=2.7Hz),7.07(d,1H,J=2.7Hz),4.04(t,4H,J=5.3Hz)，3.52(s,6H),3.46(t，4H，J-5.3Hz).FAB-MS309.用類似方法合成本發(fā)明的其它化合物(A-l~A-20)。實施例4耐氯p奎的惡性瘧原蟲的原蟲培養(yǎng)使用惡性癡原蟲Kl抹作為耐氯喹的惡性瘧原蟲。往經(jīng)過濾消毒的RMI-1640中添加人血清至最終濃度為5%，將其作為培養(yǎng)基。瘧疾原蟲在02濃度3%、C02濃度4%、N2濃度93%、37。C下進行培養(yǎng)。對耐氯喹的惡性瘧原蟲的體外增殖抑制效果的篩選試驗將本發(fā)明的試驗化合物和陽性對照藥(氯喹)溶解在DMSO中并使其達到預定的濃度來制備試驗樣品。通過離心分離收集感染了瘧疾原蟲的紅細胞并用未感染的紅細胞稀釋，使初期感染率為0.15%。這時的血細胞比容值為2.5%。將上述感染瘧疾的培養(yǎng)基的培養(yǎng)混合物(200|iiL)放入96培養(yǎng)皿孔的每個孔中，并將含有預定量的試驗化合物的試驗樣品和沒有試驗化合物的DMSO加入到孔中，一式兩份。在37。C下培養(yǎng)48小時后，將用放射性氚("H)標記的次黃嘌呤0.5nCi加到每個孔中。在相同條件下進一步培養(yǎng)24小時后，將樣品取出放在玻璃纖維過濾器上并用蒸餾水洗潦。通過(3-平板液體閃爍計數(shù)器(WallacCo.)測量放射強度，計算出試驗樣品添加組和對照組的癥疾原蟲感染率。然后按照下述公式，由所得感染率計算出增殖抑制率，求出50%增殖抑制濃度(EC5Q)。增殖抑制率(%)=[l-(b-a)/(c-a)]x100a:初期感染率；b:試驗樣品的感染率；和c:對照組的感染率義虞L6細胞體外增殖抑制試驗在添加了1%L-谷氨酰胺(200mM)和胎牛血清(10%)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在"/。C02濃度和37。C下，培養(yǎng)大鼠L6細胞(大鼠骨骼肌原細胞)。將本發(fā)明的試驗化合物和陽性對照藥溶解在DMSO中并使其達到預定的濃度來制備試驗樣品。預培養(yǎng)完成后，將含有在對數(shù)生長期的細胞的培養(yǎng)基放入96孔培養(yǎng)皿的每個孔中，并將含有預定量的試驗化合物的試驗樣品和沒有試驗化合物的DMSO加入到孔中，一式兩份。在醉化器中醉化培養(yǎng)皿72小時后，如下分析增殖抑制活性。往每個孔中加入AlamarBlue水溶液(10iliL),接著進一步培養(yǎng)2小時。然后把培養(yǎng)皿裝到熒光微量滴定平板讀數(shù)器(SpectramaxGemeniXS;U.S.MolecularDeviceCo.)上，用536nm激發(fā)波長照射，檢測588nm處的熒光強度。計算出試驗樣品添加組和對照組的L6細胞的殘存比率。按照下述公式，由所得殘存比率計算出對L6細胞的增殖抑制率，求出50%增殖抑制濃度(ECso)。增殖抑制率(％)=[l-(C-A)/(B-A)]x100A:初期細胞數(shù)B:3天后對照組的細胞數(shù)；和C:3天后試驗樣品添加組的細胞數(shù)對耐氯喹瘧疾的藥效測定通過耐氯喹惡性癥原蟲和大鼠L6細胞的EC5o值，評價樣品的抗瘧疾效果。通過下面的公式計算出用作對耐氯喹的惡性瘧原蟲的選擇性毒性指標的化學療法系數(shù)，并確定藥效?；瘜W療法系數(shù)=(試驗樣品對大鼠L6細胞的EC5Q值)/(試驗樣品對耐氯壹的惡性瘧原蟲的EC50值)對大鼠L6細胞和耐氯喹的惡性癡原蟲的EC5o值，以及本發(fā)明化合物和陽性對照藥的選擇性毒性示于表3中。這些結果表明本發(fā)明的化合物確實對耐氯喹的惡性疾原蟲顯示出非常優(yōu)異的增殖抑制效果和高選擇性毒性。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>氯喹150--實施例5^過^^染7瘧疾的V、》^C^繪^的沐力浴^試-發(fā)根據(jù)通常對于抗瘧疾化合物的活性的體內(nèi)試驗的4天抑制試驗進行該試驗。在該試驗中使用嚙齒類瘧疾原蟲(柏格氏鼠瘧原蟲NK65抹)。如下制備感染的血液對ICR雄性小鼠(5周齡；SPF)腹腔內(nèi)給藥使之感染，然后傳代培養(yǎng)(繼代培養(yǎng))。從感染了瘧疾的小鼠尾巴的靜脈抽取血液，確定其感染率。證實感染率已經(jīng)增加至適當?shù)乃?10-20%)之后，從小鼠的心臟抽取感染了瘧疾的血液。確定紅細胞感染率和和數(shù)目(細胞數(shù)/mL)。然后給未感染的小鼠(ICR雄性，5周齡)的尾巴靜脈注射用PBS稀釋的感染的紅細胞，注射量為每個劑量(0.2mL)含有1.0x10-4個原蟲。將本發(fā)明的試驗化合物溶解在生理鹽水(OtsukaPharmaceuticalsIndustries)中并使其達到預定的濃度來制備試驗樣品。在化合物不溶于水的情況下，將其溶解在DMSO或Tween20中來制備試驗樣品。僅用生理鹽水來治療對照組(不給藥組)。確定小鼠的重量，從而確定劑量是每lkg體重為5.0mg。一組為5只小鼠。從開始感染疾疾2小時后，開始腹腔給藥試驗樣品，連續(xù)4天，每次間隔24小時給藥。從最后一次給藥24小時后，從受感染的小鼠的尾巴抽取血液來制備薄層血涂片，在顯微鏡下對對照組和試驗樣品組的感染了痞疾原蟲的紅細胞計數(shù)。除去兩只顯示出最大或最小抑制水平的小鼠，計算中間三只小鼠的平均值，獲得寄生蟲血癥即疾疾原蟲的感染率。然后根據(jù)下面的公式，從所得寄生蟲血癥計算出治愈率(抑制率)。治愈率抑制率(％)=(b-a)/bx100a:試驗樣品組的感染率；b:對照組的感染率。觀察小鼠體重的變化和諸如毛發(fā)的光澤等狀況，以便分析由于給藥造成的急性毒性等副作用。治療4天(5mg/kg/天，通過腹腔給藥)后，感染了疾疾的小鼠的治愈率(％)示于表4中[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>沒有觀察到可能因腹腔給藥(5mg/kg)帶來的副作用所引起的小鼠體重減少或狀況改變。與未處理相比，本發(fā)明的所有試驗化合物顯示出顯著的延命效果。與在非專利文獻1中公開的已知化合物相比，它們還顯示出非常高的治愈率。除此之外，在上述4天抑制試驗中，通過化合物A-1(60。/。純度)、A_4和A-ll以各種劑量腹腔給藥，來分析治愈率。觀察小鼠體重的變化和諸如毛發(fā)的光澤等狀況，以便分析由于給藥造成的急性毒性等副作用。治療4天(2.5-20mg/kg/天，或5.0-30mg/kg/天，通過腹腔給藥)后，感染了瘧疾的小鼠的治愈率(％)示于表5中。[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>除A-1給藥20mg/kg和A-11給藥30mg/kg的情形之外的所有劑量中，未觀察到可能因副作用引起的小鼠體重減少或狀況改變。然而，在上述兩種情形下，也觀察到給藥完成后體重的增加。所有的治療顯示出顯著的延命效果。實施例6通過對感染了痢疾的小鼠口服藥的體內(nèi)治療試驗根據(jù)實施例5,用A-l(60%純度)治療(25-100mg/kg/天，通過口服給藥)后，感染瘧疾5天后小鼠的治愈率(％)示于表6中。從感染瘧疾2小時后開始，口服給藥4次，每次間隔24小時、口服給藥12次，每次間隔8小時或者單劑量給藥。用A-l(100mg/kg/天，通過口服給藥4次，每次間隔24小時或單劑量口服給藥)治療，感染癡疾5天后小鼠的治愈率(％)示于表7中。[表6]<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>在口服給藥時，由于技術差錯，5只小鼠中的1只死亡。在所有劑量方案中沒有觀察到可能因副作用引起的小鼠體重減少或狀況改變。所有治療顯示出顯箸的延命效果。特別是，在給藥劑量100mg/kg,給藥4次，每次間隔24小時的方案中，其中1組中的4只小鼠中的3只(1只小鼠在第21天死亡)在30天后仍然存活。36天后從這3只存活的小鼠抽取血液，以便觀察在它們的紅細胞中是否存在原蟲。顯示出在血液中不存在癡疾原蟲。[表7]<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在所有劑量方案中沒有觀察到可能因副作用引起的小鼠體重減少或狀況改變。所有治療顯示出顯著的延命效果。實施例7非洲錐蟲病原蟲的培養(yǎng)使用分布在血流中的羅德西亞布氏錐蟲(STIB900株)的原蟲錐鞭毛體進行該試驗。往過濾滅菌過的MEM培養(yǎng)基中添加25mMN-2-羥基乙基哌溱-2-乙磺酸(HEPES)、lg/L葡萄糖、1%的MEM非必需氨基酸、0.2mM2-巰基乙醇、2mM丙酮酸鈉、lmM次黃噪呤和15%熱處理過的馬血清。在(302濃度5。/。和37。C下培養(yǎng)原蟲。^潛遂^伊浙放果的傳,A廢這試-發(fā)將本發(fā)明的試驗化合物和陽性對照藥(美拉胂醇)溶解在DMSO中并使其達到預定的濃度來制備試驗樣品。把含有8><103個原蟲的培養(yǎng)基和含有預定量的試驗化合物的試驗樣品以及不含試驗化合物的DMSO加入到96孔培養(yǎng)皿的每個孔中，至最終濃度100(iL，一式兩份。在孵化器中醉化培養(yǎng)皿72小時后，如下分析增殖抑制活性。往每個孔中加入AlamarBlue水溶液(10pL)，接著進一步培養(yǎng)2小時。然后把培養(yǎng)皿裝到焚光微量滴定平板讀數(shù)器(SpectramaxGemeniXS;U.S.MolecularDeviceCo.)上，用536nm激發(fā)波長照射，；險測588nm處的萸光強度，計算出試驗樣品添加組和對照組的原蟲感染率。然后按照下述公式，由所得感染率計算出增殖抑制率，求出50。/。增殖抑制濃度(EC50)。增殖抑制率(％)=[l-(b-a)/(c-a)]x100a:初期感染率；b:試驗樣品組的感染率；c:對照組的感染率。對非洲錐蟲病的藥效測定通過下面的公式算出用作對非洲錐蟲病原蟲的選擇性毒性指標的選擇性毒性系數(shù)，并確定藥效。選擇性毒性系數(shù)=(試驗樣品對大鼠L6細胞的EC5o值)/(試驗樣品對非洲錐蟲病原蟲的EC5。值)對大鼠L6細胞和非洲錐蟲病原蟲的EC5o值，以及本發(fā)明化合物和陽性對照藥的選擇性毒性示于表8中。這些結果表明本發(fā)明的化合物的毒性確實比已知的抗非洲錐蟲病的藥美拉胂醇的毒性低。[表8]<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實施例8美洲錐蟲病原蟲的培養(yǎng)使用存在于受感染的大鼠L6細胞中的克氏錐蟲(TulahuenC2C4抹)原蟲的錐鞭毛體和無鞭毛體進行該試驗。在加入了1%匸谷氨酰胺(200mM)和10%月臺牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在C02濃度5%和37°C下培養(yǎng)L6細胞。對美洲錐蟲病原蟲的增殖抑制效果的體外篩選試驗將本發(fā)明的試驗化合物和陽性對照藥(千噠唑)溶解在DMSO中并使其達到預定的濃度來制備試驗樣品。把含有5x103個原蟲的培養(yǎng)基加入到96孔培養(yǎng)皿的每個孔中，培養(yǎng)48小時。交換培養(yǎng)基后，把含有預定量的試驗化合物的試驗樣品和不含試驗化合物的DMSO加入到每個孔中，一式兩份。在將化器中孵化培養(yǎng)皿96小時后，如下分析增殖抑制活性。往每個孔中加入CPRG/Nonidet(50pL)，接著進一步培養(yǎng)2~6小時。然后把培養(yǎng)皿裝到吸光微量滴定平板讀數(shù)器(SpectramaxGemeniXS;U.S.MolecularDeviceCo.)上，檢測540nm處的吸光度，計算出試驗樣品添加組和對照組的原蟲感染率。然后按照下述公式，由所得感染率計算出增殖抑制率，求出50。/。增殖抑制濃度(EC50)。增殖抑制率(％)=[l-(b-a)/(c-a)]x100a:初期感染率；b:試驗樣品組的感染率；c:對照組的感染率。對美洲錐蟲病的藥效測定通過下面的公式算出用作對美洲錐蟲病原蟲的選擇性毒性指標的選擇性毒性系數(shù)，并確定藥效。選擇性毒性系數(shù)=(試驗樣品對大鼠L6細胞的EC5q值)/(試驗樣品對美洲錐蟲病原蟲的EC5Q值)對大鼠L6細胞和美洲錐蟲病原蟲的EC5o值，以及本發(fā)明化合物和陽性對照藥的選擇性毒性示于表9中。這些結果表明，本發(fā)明化合物的增殖抑制效果確實比已知的抗美洲錐蟲病的藥芐噠唑更優(yōu)異，選擇性毒性更高。[表9]<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實施例9利什曼原蟲的培養(yǎng)使用杜氏利什曼原蟲(MHOM/ET/67/L82株)進行該試驗。使用SyrianGolden倉鼠進行繼代培養(yǎng)，由此獲得無鞭毛體。在加入了10%熱處理過的胎牛血清的SM培養(yǎng)基(pH5.4)中，在C02濃度5。/。和37。C下培養(yǎng)無鞭毛體。對W/ff^^的潛遂浙浙放果的沐/A廢遂試驗將本發(fā)明的試驗化合物和陽性對照藥(米替福星)溶解在DMSO中并使其達到預定的濃度來制備試驗樣品。把含有預定數(shù)量的原蟲的培養(yǎng)基加入到96孔培養(yǎng)皿的每個孔中，用CASY細胞分析系統(tǒng)(Dermany,ScharfeCo.)測量無鞭毛體的濃度。把含有預定量的試驗化合物的試驗樣品和不含試驗化合物的DMSO加入到每個孔中，一式兩4分。在孵化器中孵化培養(yǎng)皿72小時后，如下分析增殖抑制活性。往每個孔中加入AlamarBlue水溶液(10^L),4矣著進一步培養(yǎng)2小時。然后把培養(yǎng)皿裝到熒光微量滴定平板讀數(shù)器(SpectmmaxGemeniXS;U.S.MolecularDeviceCo.)上，用536nm激發(fā)波長照射，檢測588nm處的熒光強度，計算出試驗樣品添加組和對照組的原蟲感染率。然后按照下述公式，由所得感染率計算出增殖抑制率，求出50。/。增殖抑制濃度(EC50)。增殖抑制率(％)=[l-(b-a)/(c-a)]x100a:初期感染率；b:試驗樣品組的感染率；c:對照組的感染率。對利什曼病的藥效測定通過下面的公式算出用作對利什曼原蟲的選擇性毒性指標的選擇性毒性系數(shù)，并確定藥效。選擇性毒性系數(shù)=(試驗樣品對大鼠L6細胞的EC5o值)/(試驗樣品對利什曼原蟲的EC5G值)對大鼠L6細胞和利什曼原蟲的EC5o值，以及本發(fā)明化合物和陽性對照藥的選擇性毒性示于表10中。這些結果表明本發(fā)明化合物的增殖抑制效果確實與已知的治療利什曼病的藥米替福星相當或較其更優(yōu)異，并且選擇性毒性高。[表IO]<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>發(fā)明優(yōu)點通過使用本發(fā)明的化合物作為活性成分，將提供優(yōu)異的治療和/或預防寄生蟲感染的優(yōu)異的藥物組合物。權利要求1.含有下述通式(1)表示的化合物作為活性成分的藥物組合物。其中R1和R2可以相同或不同，獨立地表示烷基、芳基或雜環(huán)基、它們可以任選具有取代基羥基、烷氧基、鹵素、氨基、氰基、磺酸基、羧基、酯基、酰氨基或硝基，或者可以縮合形成環(huán)；R3和R4可以相同或不同，獨立地表示烷基、芳基或雜環(huán)基、它們可以任選具有取代基羥基、烷氧基、鹵素、氨基、氰基、磺酸基、羧基、酯基、酰氨基或硝基，或者可以縮合形成環(huán)；R5和R6可以相同或不同，獨立地表示鹵素、烷基、芳基或雜環(huán)、羥基、烷氧基、酰氧基、氨基、氰基、磺酸基、羧基、酯基、酰氨基或硝基、或可以形成脂族環(huán)、芳環(huán)、脂族雜環(huán)或芳香雜環(huán)；m和n獨立地表示0～3的整數(shù)；并且Q是藥物上可接受的陰離子。2.權利要求1所述的藥物組合物，其中R1、R2、R3和R4獨立地表示具有1~6個碳原子的烷基。3.權利要求1或2所述的藥物組合物，其中Q是卣素離子或高氯酸根離子。4.權利要求1-3任一項所述的藥物組合物，其中R1和R2、或R3和R4縮合形成環(huán)。5.利要求4所述的藥物組合物，其中所述環(huán)是哌嗪環(huán)或嗎啉環(huán)。6.含有任意一種下面化合物作為活性成分的藥物組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>7.權利要求1-6任一項所述的藥物組合物，其用于治療和/或預防原蟲寄生感染。8.權利要求7所述的藥物組合物，其中寄生感染是瘧疾、利什曼病、非洲昏睡病、恰加斯氏病、弓形體病、、淋巴絲蟲病、巴貝蟲病或3求蟲病。9.權利要求8所述的藥物組合物，其中寄生感染是瘧疾、利什曼病、非洲昏睡病或恰加斯氏病。10.權利要求9所述的藥物組合物，其中寄生感染是瘧疾。11.權利要求1-IO任一項所述的藥物組合物，其用于治療和/或預防原蟲寄生感染，含有通式(1)表示的化合物lmg~10,000mg。12.權利要求1-11任一項所述的藥物組合物，其用于治療和/或預防原蟲寄生感染，其中所述組合物是液體、片劑、丸劑或膠體的形式。13.由命名為A-8、A-9和A-ll的任意一種結構表示的吩喁。秦鏡化合物。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供藥物組合物，特別是用于治療和/或預防原蟲寄生感染的藥物組合物，該藥物組合物具有高的療效和選擇性毒性或?qū)υx寄生感染具有延命效果。本發(fā)明因此涉及含有上面通式(1)表示的化合物作為活性成成分的藥物組合物，特別是那些用于治療和/或預防原蟲寄生感染的藥物組合物。文檔編號A61P33/06GK101132796SQ20068000508公開日2008年2月27日申請日期2006年2月7日優(yōu)先權日2005年2月17日發(fā)明者井原正隆,佐藤幸藏,北口博司,川上雅之,高須清誠申請人:獨立行政法人科學技術振興機構;富士膠片株式會社