專利名稱：重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子在制備治療或預(yù)防乙型肝炎藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子在制備抗乙型肝炎藥物中的用途。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是危害人類健康的世界性問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2000年世界范圍內(nèi)已有4億人感染乙型肝炎病毒，我國人群乙型肝炎帶毒率高達10％左右，接種乙型肝炎疫苗是預(yù)防和控制乙型肝炎傳播的重要措施。
基因工程乙型肝炎疫苗，包括哺乳動物細胞(如CHO細胞)來源和酵母來源(如啤酒酵母細胞)，是一種乙型肝炎表面抗原(HBsAg)亞單位疫苗，它系采用現(xiàn)代生物技術(shù)將乙型肝炎病毒表達表面抗原的基因進行質(zhì)粒構(gòu)建，克隆進入CHO細胞或啤酒酵母細胞中，通過培養(yǎng)這種基因工程細胞來表達乙型肝炎表面抗原亞單位。這種乙型肝炎表面抗原亞單位具有原料易得、產(chǎn)量大、安全、高效等特點，在我國乃至世界的乙型肝炎計劃免疫中日益發(fā)揮著重要作用，成為控制乙型肝炎流行的主要疫苗之一。目前使用的基因工程乙型肝炎疫苗均以鋁佐劑作為常規(guī)佐劑。鋁佐劑雖然能增強Th2類免疫應(yīng)答和體液免疫，但對Th1類免疫應(yīng)答和細胞免疫有抑制作用，這也可能是部分人群對現(xiàn)有乙型肝炎疫苗反應(yīng)低下或無反應(yīng)的因素之一(Gupta R K，Siber G.R，Adjuvants for humanvaccines-current status，problems and future prospects[J].Vaccine，1995，13(14)1263-1276.)。而且，對乙型肝炎病毒(HBV)免疫病理學的研究表明，細胞免疫應(yīng)答在機體清除HBV的過程中起了很重要的作用，有利于慢性乙型肝炎的治療(周康鳳，毛子安，錢汶，等.含CpG基序的寡聚脫氧核苷酸佐劑對乙型肝炎疫苗免疫效果的影響[J]。國外醫(yī)學·流行病學傳染病學分冊，2004，No.2第86-90頁)。因而，提高Th1類免疫應(yīng)答和增強細胞免疫從而研究出治療乙型肝炎的藥物一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員著力解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容
重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGm-csf)作用于造血祖細胞，促進其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、單核巨噬細胞成熟，促進成熟細胞向外周血釋放，并能促進巨噬細胞及噬酸性細胞的多種功能。作為一種具有多種潛能的造血生長因子，可治療各種粒細胞減少癥及惡性腫瘤化療、放療后的白細胞減少、骨髓移植、白血病、抗感染、再生障礙貧血、骨髓異常綜合癥等。因為它不僅能夠促進造血前體細胞的增殖、分化和成熟，而且可以通過多種機制誘導(dǎo)分化、增殖和激活機體的T細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞免疫活性細胞等，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。由于Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β等細胞因子，參與激活細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并促進IgG2a和IgG2b產(chǎn)生，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6以及IL-10等細胞因子，參與激活B細胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，并促進IgG1和IgE的合成(《核酸疫苗》孫樹漢，第二軍醫(yī)大學出版社上海2000，第105頁)，所以，在應(yīng)用乙型肝炎疫苗免疫機體時，若能輔以某種佐劑，使之誘導(dǎo)機體產(chǎn)生以Th1型反應(yīng)為主的細胞免疫應(yīng)答，將有助于有效預(yù)防及治療HBV感染。
本發(fā)明的發(fā)明人采用了重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和基因工程乙型肝炎疫苗不同的聯(lián)合使用方式進行了大量的實驗，考察其對小鼠免疫應(yīng)答(細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答)的影響。在細胞免疫應(yīng)答中，通過脾細胞增殖反應(yīng)實驗、細胞毒T細胞(CTL)功能測定、細胞因子測定和抗體IgG1、IgG2a亞型滴度測定；在體液免疫應(yīng)答中，通過抗體滴度測定、肝組織切片并對結(jié)果進行系統(tǒng)分析。結(jié)果表明，同時給予重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和基因工程乙型肝炎疫苗可以促進機體的體液免疫，與單獨使用乙型肝炎疫苗相比，抗體產(chǎn)生的速度增加，抗體滴度提高，而對肝組織無損傷，這樣可以提高接種乙型肝炎疫苗后的免疫效果，從而達到預(yù)防乙型肝炎的目的；提前給予重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，再給予基因工程乙型肝炎疫苗，可以刺激動物產(chǎn)生細胞免疫，加快T淋巴細胞的轉(zhuǎn)化，可刺激Th1細胞主要分泌IFN-γ等細胞因子，促進IgG2a類型抗體產(chǎn)生，增加細胞毒T細胞(CTL)功能，從而達到治療乙型肝炎的效果。
發(fā)明人經(jīng)過實驗證實，提前3～7天連續(xù)給予重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(5～20μg/只/天)后，再給予基因工程乙型肝炎疫苗(1～4μg/只)，與單純給予基因工程乙型肝炎疫苗相比，可以刺激動物產(chǎn)生細胞免疫，加快T淋巴細胞的轉(zhuǎn)化，可刺激Th1細胞主要分泌IFN-γ等細胞因子，促進IgG2a類型抗體產(chǎn)生，增加細胞毒T細胞(CTL)功能，從而達到治療乙型肝炎的目的。與單純給予基因工程乙型肝炎疫苗相比，同時給予重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(5～20μg/只)和基因工程乙型肝炎疫苗(1～2μg/只)可以促進機體的體液免疫，增加抗體產(chǎn)生的速度，提高抗體滴度，而對肝組織無損傷，提高接種乙型肝炎疫苗后的免疫效果，從而達到預(yù)防乙型肝炎的目的。并且，各種基因工程乙型肝炎疫苗(CHO細胞疫苗、漢遜酵母疫苗、啤酒酵母疫苗)與重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的組合治療或預(yù)防乙型肝炎的對比實驗表明，基因工程CHO細胞乙型肝炎疫苗與重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的組合治療或預(yù)防乙型肝炎的效果最好。
具體地，本發(fā)明公開了 (1)重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和基因工程乙型肝炎疫苗的組合在制備治療或預(yù)防乙型肝炎藥物中的用途。
(2)根據(jù)項(1)的用途，其中乙型肝炎為慢性乙型肝炎。
(3)根據(jù)項(1)或(2)的用途，其中基因工程乙型肝炎疫苗為CHO細胞表達的基因工程乙型肝炎疫苗。
(4)根據(jù)項(1)-(3)任一用途，其中重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和基因工程乙型肝炎疫苗同時給藥。
(5)根據(jù)項(1)-(3)任一用途，其中重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子在基因工程乙型肝炎疫苗給藥前給藥。
(6)根據(jù)項(1)-(5)任一用途，其中基因工程乙型肝炎疫苗與重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子用量的質(zhì)量配比為1∶0.8-60。
附圖1實驗例2實驗方法2二次免疫后血清抗體滴度結(jié)果圖。
附圖2實驗例2實驗方法3挑戰(zhàn)實驗(免疫記憶)后血清抗體滴度結(jié)果圖。
附圖3實驗例2實驗方法4肝組織HE染色圖(100×)。其中，圖3a為空白對照組肝組織HE染色圖，圖3b為GM+疫苗組肝組織HE染色圖。
附圖4實驗例4實驗方法2二次免疫后血清抗體滴度結(jié)果圖。
具體實施例方式 下面實驗例將對本發(fā)明做更詳細的說明，它們并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
除非特別說明，本發(fā)明實驗例中的實驗數(shù)據(jù)均為各組中每只小鼠得到的數(shù)值的平均值。
實驗例1重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子與基因工程乙型肝炎疫苗協(xié)同誘導(dǎo)小鼠細胞免疫應(yīng)答材料與儀器 實驗動物BALB/C小鼠，SPF級，雌性，體重16～18g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。
實驗材料基因工程(CHO細胞)乙型肝炎疫苗[Recombinant Hepatitis BVaccine(CHO)]，10μg/1.0ml，注射用重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子[Recombinant Human Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor forInjection](以后簡稱rhGm-csf)，300μg/支，CHO表達的基因工程乙型肝炎疫苗原液(HBsAg原液)均由華北制藥集團金坦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。
主要試劑和儀器RPMI 1640培養(yǎng)液(Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物公司)；IL-2、IFN-γ、和IL-5的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海雄森科技實業(yè)有限公司)；抗-HBs用“乙型肝炎病毒表面抗體酶聯(lián)免疫法診斷試劑盒”(北京萬泰生物藥業(yè)有限公司)；MTT、SDS、HRP標記羊抗鼠IgG1、IgG2a均購自Sigma公司；其它試劑如果沒有說明，均為市售。
酶聯(lián)檢測儀(Model450，BIO-RAD)、離心機(Labofuge 400R，Heraeus)、倒置顯微鏡(XDS-1B，重慶光學儀器廠)； 檢測方法 1.脾細胞增殖實驗檢測方法 ①制備脾細胞無菌方法取小鼠脾臟，在無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中制備細胞懸液，3000r/min離心5min，棄上清，加0.75％NH4Cl 2ml，充分混合4min，加無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液至10ml，1500r/min離心7min，棄上清，加RPMI1640培養(yǎng)液5ml混懸后，3000r/min離心5分鐘，用含20％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液2ml，記數(shù)并調(diào)整細胞密度為1×107/ml。
②取上述懸液加入96孔板中，每孔100μl，每份細胞懸液分裝6個孔，其中3孔為對照組，加100μl無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液；另3孔為實驗組，每孔加入100μl CHO表達的HBsAg 10μg/ml，混勻后，置37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)72小時后，每孔加入MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，每孔再加入10％SDS100μl，置37℃，濕盒中過夜，用酶聯(lián)檢測儀在570nm/630nm波長下讀取各孔OD值，以O(shè)D值高低判定淋巴細胞增殖程度。
2.細胞因子IFN-γ、IL-5含量測定方法 ①同上述檢測方法1中“①制備脾細胞”，將細胞懸液加入24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔500μl，每份細胞懸液分裝4個孔，其中2孔為對照組，加500μl無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液；另2孔為實驗組，每孔加入500μl CHO表達的HBsAg10μg/ml，混勻后，置37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)72小時后，收集細胞培養(yǎng)上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
②取細胞培養(yǎng)上清，按IFN-γ、IL-5檢測試劑盒使用說明書操作。
3.細胞毒T細胞(CTL)功能測定方法——乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗(《核酸疫苗》孫樹漢，第二軍醫(yī)大學出版社上海2000，第108頁) ①靶細胞制備取培養(yǎng)24~48小時的靶細胞YAC-1(GDC001購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，洗滌2次，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至3×106/ml。
②效應(yīng)細胞制備同檢測方法1中“①制備脾細胞”，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×107/ml。
③效、靶細胞作用按表1依次加樣(如E/T＝100∶1)于96孔板中，每份標本設(shè)3復(fù)孔，置37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)4小時。
表1乳酸脫氫酶LDH釋放試驗各組成份 ④酶促反應(yīng)取出培養(yǎng)板，吸取各孔上清0.1ml，加于另一培養(yǎng)板中，置37℃預(yù)溫10分鐘，每孔加入新鮮配制的底物溶液0.1ml，室溫避光反應(yīng)10～15分鐘，每孔加入1mol/L檸檬酸終止液30μl，終止酶促反應(yīng)。
⑤用酶聯(lián)檢測儀(Model 450，BIO-RAD)在570nm波長下讀取各孔OD值。
⑥以O(shè)D值計算LDH釋放率結(jié)果計算
4.細胞毒T細胞(CTL)功能測定方法——MTT法 將上述檢測方法3中“④酶促反應(yīng)”中取上清后的培養(yǎng)板中，每孔加入20μlMTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，每孔加入100μl 10％SDS，置37℃，濕盒中過夜，用酶聯(lián)檢測儀(Model 450，BIO-RAD)在570nm/630nm波長下讀取各孔OD值(何春艷，劉慶良。包裹天然骨架CpG ODN和HBsAg的非磷脂脂質(zhì)體疫苗的免疫效果[J]現(xiàn)代免疫學2004，1第43-47頁)、(賈茜，周興軍，等。MTT法測定三種基因工程細胞因子生物學活性方法研究[J]中國生化藥物雜志2000，No.1第8-11頁)，以O(shè)D值計算LDH釋放率。計算公式
5.抗體IgG1、IgG2a亞型滴度檢測方法 先將CHO表達的HBsAg原液2μg/ml，每孔100μl包被在酶標板上，4℃濕盒中過夜；次日，洗滌后加入按一定比例稀釋的小鼠血清，37℃培養(yǎng)1小時，洗板，然后每孔分別加入1∶4000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG1、IgG2a，37℃培養(yǎng)1小時，洗板，加顯色劑，37℃靜置10～15min，加入1mol/L的H2SO4終止，用酶標儀測各孔的OD值。以空白對照作為陰性對照，樣品OD值/陰性對照OD值＞2.1判為陽性，陰性對照OD值＜0.05按0.05計算，高于0.05按實際OD值計算，以出現(xiàn)陽性最高稀釋度作為該樣品的滴度。
實驗方法 1.將BALB/C小鼠，隨機分為5組，每組5只，分別為原液組給予基因工程乙型肝炎疫苗原液2μg/只；疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只；混合疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只，同時給予rhGm-csf20μg/只；GM+疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前三天，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只/天。分別在第0、14天皮下注射(二次免疫)，并在第21天放血處死，用CHO表達的HBsAg 10μg/ml，作抗原刺激物，檢測脾細胞增殖情況，以及脾細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子含量(見檢測方法1、2)。
2.將BALB/C小鼠，隨機分為5組，每組5只，分別為原液組給予基因工程乙型肝炎疫苗原液2μg/只；疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只；混合疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只，同時給予rhGm-csf20μg/只；GM+疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前三天，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只。分別在第0、14天皮下注射(二次免疫)，每只小鼠免疫的抗原量相當為2μg的HBsAg，并在第21天放血處死，測定細胞毒T細胞(CTL)功能(見檢測方法3、4)。
3.將“實驗方法1中放血處死”的小鼠血清收集到離心管中，3000rpm離心15分鐘，分離血清，抗體IgG1、IgG2a亞型滴度檢測(見檢測方法5)。
統(tǒng)計分析方法 實驗組與對照組比較用t檢驗判斷有無顯著性差異。
實驗結(jié)果 1.脾細胞增殖反應(yīng)實驗 二次免疫后7天，GM+疫苗組小鼠脾細胞增殖速度最快，比疫苗組高出21.8％，見表2。
表2不同實驗組小鼠脾細胞增殖情況 2.細胞毒T細胞(CTL)功能測定 (1)乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗 在四個效應(yīng)細胞(E)與靶細胞(T)配比(5∶1、10∶1、50∶1、100∶1)中，GM+疫苗組小鼠脾細胞細胞毒T細胞(CTL)功能均高于其他組，其中E∶T＝100∶1的GM+疫苗組有顯著性差異，說明GM+疫苗組小鼠脾細胞細胞毒T細胞(CTL)功能明顯高于其他組。見表3。表3不同實驗組乳酸脫氫酶(LDH)釋放率(％)(X±S) **與疫苗組相比P＜0.01 (2)MTT法 通過對活細胞的分析，在四個效應(yīng)細胞(E)與靶細胞(T)配比(5∶1、10∶1、50∶1、100∶1)中，GM+疫苗組小鼠脾細胞細胞毒T細胞(CTL)功能均高于其他組，其中除E∶T＝50∶1外，另外三個配比中GM+疫苗組均有顯著性差異，說明GM+疫苗組小鼠脾細胞細胞毒T細胞(CTL)功能均明顯高于其他組。見表4。
表4不同實驗組小鼠脾細胞對靶細胞殺傷率(％)(X±S) **與疫苗組相比P＜0.01 3.細胞因子 (1)IFN-γ GM+疫苗組脾細胞培養(yǎng)上清IFN-γ含量較多，GM+疫苗組明顯高于疫苗組。說明GM+疫苗組可刺激Th1細胞主要分泌IFN-γ等細胞因子，參與激活細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(《核酸疫苗》孫樹漢，第二軍醫(yī)大學出版社上海2000，第105頁)，見表5。
表5不同實驗組脾細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ含量(X±S) *與疫苗組相比P＜0.05 (2)IL-5 混合疫苗組脾細胞培養(yǎng)上清IL-5含量較多，故活化的Th2型T細胞，分泌IL-5細胞因子，參與激活B細胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答(《核酸疫苗》孫樹漢，第二軍醫(yī)大學出版社上海2000，第105頁)，見表6。
表6不同實驗組脾細胞培養(yǎng)上清液中IL-5含量(X±S) 4.抗體IgG1、IgG2a亞型滴度 GM+疫苗組小鼠血清抗體中IgG2a占優(yōu)勢，混合疫苗組小鼠血清抗體中以IgG1為主。提示GM+疫苗組可刺激Th1細胞，參與激活細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，促進IgG2a類型抗體產(chǎn)生；混合疫苗組可刺激Th2細胞，參與激活B細胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，并促進IgG1類型抗體合成(《核酸疫苗》孫樹漢，第二軍醫(yī)大學出版社上海2000，第105頁)，見表7。
表7抗體IgG1、IgG2a亞型滴度 實驗例2重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和基因工程乙型肝炎疫苗協(xié)同誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答 材料與儀器 實驗動物、材料、主要試劑和儀器同實驗例1。
檢測方法 1.血清抗體滴度測定方法 用“乙型肝炎病毒表面抗體酶聯(lián)免疫法診斷試劑盒”，樣品的OD值/陰性對照的OD值≥2.1判為陽性(陰性對照的OD值不足0.05，以0.05計算)，具體操作見說明書。
2.肝組織切片檢查方法(HE染色法) 小鼠處死后，用剪刀剪開腹腔，觀察肝組織，剪下肝組織中葉，立即投入生理鹽水清洗，以除去外周血液；然后浸在10％甲醛溶液中固定(《實用組織學技術(shù)》杜卓民主編，人民衛(wèi)生出版社，第8頁)；經(jīng)較長時間流速適中的流水沖洗，去掉固定后組織所附的固定液，將組織從70％酒精中開始脫水，然后轉(zhuǎn)入95％酒精及無水酒精，各換2～3次，進行脫水，再放入二甲苯中對組織最后脫水處理；用石蠟包埋(《實用組織學技術(shù)》杜卓民主編，人民衛(wèi)生出版社，第22～28頁)；用石蠟切片常規(guī)化蘇木精-伊紅染色法染色，在染藍色核后，經(jīng)伊紅復(fù)染，最后用95％酒精分色。(《實用組織學技術(shù)》杜卓民主編，人民衛(wèi)生出版社，第49頁)。
實驗方法 1.單次免疫 將BALB/C小鼠，隨機分為4組，每組10只，分別為疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗1μg/只；GM+疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)前三天，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只；混合疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)同時給予rhGm-csf，20μg/只；疫苗+GM組給予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)后，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只；分別于初次免疫后0天、7天、14天、21天、28天、35天，眼眶采血約200ul，3000rpm離心15分鐘，分離血清，檢測抗體滴度(見檢測方法1)。
2.二次免疫 將BALB/C小鼠，隨機分為5組，每組8只，分別為空白組給予生理鹽水0.1ml/只；疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗1μg/只；GM+疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)前三天，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只；混合疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)同時給予rhGm-csf，20μg/只；疫苗+GM組給予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)后，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只；初次免疫后21天，同樣免疫方法進行加強免疫一次；期間每周眼眶采血一次，每次采血約200ul，3000rpm離心15分鐘，分離血清，檢測抗體滴度(見檢測方法1)，結(jié)果見附圖1。
3.挑戰(zhàn)實驗(免疫記憶) 初次病原體感染后，患者通過獲得性免疫應(yīng)答得到康復(fù)。當再次感染相同病原體，多數(shù)感染性疾病可避免，因有保護性免疫存在。再感染發(fā)生在初感痊愈后較長時間，數(shù)年甚至數(shù)十年，宿主體卻仍然不發(fā)生感染。這種遠期的保護性免疫主要依賴免疫記憶應(yīng)答。[《免疫學原理》周光炎主編，上?？茖W技術(shù)文獻出版社出版，P247]。故小鼠二次免疫后，待到抗體量極低時，用乙型肝炎疫苗原液進行挑戰(zhàn)。挑戰(zhàn)實驗是將每只小鼠皮下注射乙型肝炎疫苗原液1μg/只，每周眼眶采血一次，每次采血約200ul，3000rpm離心15分鐘，分離血清，檢測抗體滴度(見檢測方法1)，見附圖2。
4.肝組織切片檢查 挑戰(zhàn)實驗小鼠血清抗體達到峰值回落后，將小鼠處死，做肝組織切片檢查(見檢測方法2)。
統(tǒng)計分析方法 實驗組與對照組小鼠血清抗-HBsAg抗體的幾何均數(shù)用t檢驗判斷有無顯著性差異。
實驗結(jié)果 1.抗體滴度 (1)單次免疫后7天，疫苗組的10只小鼠，有4只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，6只為陰性，陽性率為40％；GM+疫苗組有7只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，3只為陰性，陽性率為70％；混合疫苗組有9只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，1只為陰性，陽性率為90％；疫苗+GM組有7只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，7只為陰性，陽性率為70％；經(jīng)卡方檢驗，混合疫苗組與疫苗組相比有顯著性差異(P＜0.05)，見表8。
表8單次免疫后7天小鼠血清抗體情況 (2)單次免疫后14天，疫苗組的10只小鼠，有6只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，4只為陰性，陽性率為60％；GM+疫苗組有9只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，1只為陰性，陽性率為90％；混合疫苗組有10只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，0只為陰性，陽性率為100％；疫苗+GM組有8只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，2只為陰性，陽性率為80％；經(jīng)卡方檢驗，混合疫苗組與疫苗組相比有顯著性差異(P＜0.05)，見表9。
表9單次免疫后14天小鼠血清抗體情況 (3)單次免疫后28天，4個實驗組的小鼠血清抗體均為陽性，以混合疫苗組為最高，GM+疫苗組的血清抗體滴度比較高，緊隨其次?？梢娀旌弦呙缃M促進小鼠的體液免疫功能，見表10。
表10單次免疫后28天血清中抗體滴度(X±S) 與疫苗組相比*P＜0.05，**P＜0.01 (4)二次免疫14天后血清中抗體的含量結(jié)果如下，其中混合疫苗組與疫苗組相比有顯著性差異，見表11。
表11二次免疫后14天血清中抗體滴度(X±S) 與疫苗組相比**P＜0.01 (5)二次免疫后血清中抗體持續(xù)增加，GM+疫苗組、混合疫苗組和疫苗+GM組血清中抗體滴度都先后達到峰值，然后維持較高的水平第10周疫苗+GM組血清中抗體滴度達到峰值，約為疫苗組8.0倍；第14周混合疫苗組血清中抗體滴度達到峰值，約為疫苗組9.7倍；第23周GM+疫苗組血清中抗體滴度達到峰值，約為疫苗組10.2倍，見附圖1。
(6)免疫記憶小鼠血清中抗體在33周以后，基本達到穩(wěn)定狀態(tài)。挑戰(zhàn)3周后檢測抗體滴度，抗體滴度達到較高水平，隨后開始回落；挑戰(zhàn)實驗抗體最高值分別為挑戰(zhàn)前的8.9倍、5.3倍、12.9倍、4.8倍，見附圖2。
2.肝組織切片(HE染色)，證明肝細胞正常，肝組織未受到損傷，見附圖3。
實驗例3重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子與三種來源的基因工程乙型肝炎疫苗協(xié)同誘導(dǎo)小鼠細胞免疫應(yīng)答的比較 材料與儀器 實驗動物、主要試劑和儀器同實驗例1。
實驗材料基因工程(CHO細胞)乙型肝炎疫苗[Recombinant Hepatitis BVaccine(CHO)]，10μg/1.0ml，注射用重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子[Recombinant Human Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor forInjection](以后簡稱rhGm-csf)，300μg/支，CHO表達的基因工程乙型肝炎疫苗原液(HBsAg原液)均由華北制藥集團金坦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；重組(漢遜酵母)乙型肝炎疫苗[Recombinant Hepatitis B Vaccine(Yeast)](2005030306)，10μg/0.5ml，由大連漢信生物制藥有限公司生產(chǎn)；重組(酵母)乙型肝炎疫苗[Recombinant Hepatitis B Vaccine(Yeast)](2005010104)，10μg/1.0ml，由北京天壇生物制品股份有限公司生產(chǎn)。
檢測方法 1.脾細胞增殖實驗檢測方法同實驗例1。
2.細胞毒T細胞(CTL)功能測定方法——乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗同實驗例1。
3.細胞毒T細胞(CTL)功能測定方法——MTT法同實驗例1。
4.抗體IgG1、IgG2a亞型滴度檢測方法同實驗例1。
實驗方法 1.將BALB/C小鼠，隨機分為4組，每組6只，分別為空白對照組連續(xù)四天給予生理鹽水0.2ml/只；CHO細胞疫苗組連續(xù)三天給予rhGm-csf(10μg/只/天)后，給予華北制藥集團金坦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的CHO細胞表達乙型肝炎疫苗(2μg/只)；漢遜酵母疫苗組連續(xù)三天給予rhGm-csf(10μg/只/天)后，給予大連漢信生物制藥有限公司生產(chǎn)的漢遜酵母表達乙型肝炎疫苗(2μg/只)；啤酒酵母疫苗組連續(xù)三天給予rhGm-csf(10μg/只/天)后，給予北京天壇生物制品股份公司生產(chǎn)的酵母表達乙型肝炎疫苗(2μg/只)。14天后同樣方法加強免疫一次，并在二次免疫后7天放血處死，用CHO表達的HBsAg 10μg/ml，作抗原刺激物，檢測脾細胞增殖情況(見檢測方法1)。
2.將BALB/C小鼠，隨機分為4組，每組6只，分別為空白對照組連續(xù)四天給予生理鹽水0.2ml/只；CHO細胞疫苗組連續(xù)三天給予rhGm-csf(10μg/只/天)后，給予華北制藥集團金坦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的CHO細胞表達乙型肝炎疫苗(2μg/只)；漢遜酵母疫苗組連續(xù)三天給予rhGm-csf(10μg/只/天)后，給予大連漢信生物制藥有限公司生產(chǎn)的漢遜酵母表達乙型肝炎疫苗(2μg/只)；啤酒酵母疫苗組連續(xù)三天給予rhGm-csf(10μg/只/天)后，給予北京天壇生物制品股份公司生產(chǎn)的酵母表達乙型肝炎疫苗(2μg/只)。14天后同樣方法加強免疫一次，并在二次免疫后7天放血處死，測定細胞毒T細胞(CTL)功能(見檢測方法2、3)。
3.將“實驗方法1中放血處死”的小鼠血清收集到離心管中，3000rpm離心15分鐘，分離血清，抗體IgG1、IgG2a亞型滴度檢測(見檢測方法4)。
統(tǒng)計分析方法 實驗組與對照組比較用t檢驗判斷有無顯著性差異。
實驗結(jié)果 1.脾細胞增殖反應(yīng)實驗 二次免疫后7天，三個實驗組小鼠的脾細胞增殖率均高于空白對照組，而CHO細胞疫苗組小鼠的脾細胞增殖率明顯高于啤酒酵母疫苗組和漢遜酵母疫苗組，見表10。
表10不同實驗組小鼠脾細胞增殖情況 **與CHO細胞疫苗組P＜0.01 2.細胞毒T細胞(CTL)功能測定 (1)乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗 在三個效應(yīng)細胞(E)與靶細胞(T)配比(20∶1、50∶1、100∶1)中，三個實驗組小鼠的脾細胞細胞毒T細胞(CTL)功能均高于空白對照組，而CHO細胞疫苗組和啤酒酵母疫苗組小鼠的脾細胞細胞毒T細胞(CTL)功能明顯高于漢遜酵母疫苗組，說明CHO細胞疫苗組和啤酒酵母疫苗組小鼠的脾細胞細胞毒T細胞(CTL)功能均明顯高于漢遜酵母疫苗組，見表11。
表11不同實驗組小鼠脾細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率(％)(X±S) **與漢遜酵母疫苗組P＜0.01 (2)MTT法 通過對活細胞的分析，在三個效應(yīng)細胞(E)與靶細胞(T)配比(20∶1、50∶1、100∶1)中，三個實驗組小鼠的脾細胞細胞毒T細胞(CTL)功能均高于空白對照組，見表12。
表12不同實驗組小鼠脾細胞對靶細胞殺傷率(％)(X±S) 3.抗體IgG1、IgG2a亞型滴度 CHO細胞疫苗IgG1含量是啤酒酵母疫苗的1.4倍，是漢遜酵母疫苗的5.2倍；CHO疫苗IgG2a含量是啤酒酵母疫苗的9.7倍，是漢遜酵母疫苗的565.6倍；見表13。表13抗體IgG1、IgG2a亞型滴度 實驗例4重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子與三種來源的基因工程乙型肝炎疫苗協(xié)同誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的比較 材料與儀器 實驗動物、主要試劑和儀器同實驗例1。
實驗材料同實驗例3。
檢測方法 1.血清抗體滴度測定方法同實驗例2。
實驗方法 將BALB/C小鼠，隨機分為3組，每組10只，分別為CHO細胞疫苗組皮下給予華北制藥集團金坦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的CHO細胞表達乙型肝炎疫苗(1μg/只)，同時給予10μg/只rhGm-csf；漢遜酵母疫苗組皮下給予大連漢信生物制藥有限公司生產(chǎn)的漢遜酵母表達的乙型肝炎疫苗(1μg/只)，同時給予10μg/只rhGm-csf；啤酒酵母疫苗組皮下給予北京天壇生物制品股份公司生產(chǎn)的啤酒酵母表達的乙型肝炎疫苗(1μg/只)，同時給予10μg/只rhGm-csf。分別在第0、14天皮下注射乙型肝炎疫苗。分別于初次免疫后，每周眼眶采血約200ul，3000rpm離心15分鐘，分離血清，檢測抗體滴度(見檢測方法1)。
統(tǒng)計分析方法 實驗組與對照組小鼠血清抗-HBsAg抗體的幾何均數(shù)用t檢驗判斷有無顯著性差異。
實驗結(jié)果 1.初次免疫后7天 CHO細胞疫苗組的10只小鼠，有9只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，1只為陰性，陽性率為90％；漢遜酵母疫苗組的10只小鼠，僅有1只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，9只為陰性，陽性率為10％；啤酒酵母疫苗組的10只小鼠，沒有1只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，10只均為陰性，陽性率為0；經(jīng)卡方檢驗，CHO細胞疫苗組與漢遜酵母疫苗組和啤酒酵母疫苗組相比有顯著性差異(P＜0.01)，見表14。 表14初次免疫后7天血清中抗體情況 2.初次免疫后14天 CHO細胞疫苗組的10只小鼠，有10只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，陽性率為100％；漢遜酵母疫苗組的10只小鼠，有4只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，6只為陰性，陽性率為40％；啤酒酵母疫苗組的10只小鼠，有4只血清中抗HBsAg抗體呈陽性，6只為陰性，陽性率為40％；經(jīng)卡方檢驗，CHO細胞疫苗組與漢遜酵母疫苗組和啤酒酵母疫苗組相比有顯著性差異(P＜0.01)，見表15。 表15初次免疫后14天血清中抗體情況 3.二次免疫后7天 三個實驗組小鼠血清中抗HBsAg抗體均呈陽性，陽性率為100％，見表16；三個實驗組小鼠血清抗體滴度無顯著性差異，見表17。
表16二次免疫后7天血清中抗體情況表17二次免疫后7天血清中抗體滴度 4.二次免疫后，三個實驗組小鼠血清中抗體持續(xù)增加，第12周CHO細胞疫苗組的達到峰值，分別為漢遜酵母疫苗組和啤酒酵母疫苗組的2.5倍和2.2倍，見附圖4。
實驗例5重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子不同注射次數(shù)與基因工程乙型肝炎疫苗協(xié)同誘導(dǎo)小鼠細胞免疫應(yīng)答的比較 材料與儀器 實驗動物、實驗材料、主要試劑和儀器同實驗例1。
檢測方法 1.脾細胞增殖實驗檢測方法同實驗例1。
2.細胞毒T細胞(CTL)功能測定方法——乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗同實驗例1。
3.細胞毒T細胞(CTL)功能測定方法——MTT法同實驗例1。
4.抗體IgG1、IgG2a亞型滴度檢測方法同實驗例1。
實驗方法 1.將BALB/C小鼠，隨機分為4組，每組6只，分別為疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只；GM高劑量組給予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前七天，連續(xù)七天給予rhGm-csf，20μg/只/天；GM中劑量組給予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前三天，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只/天；GM低劑量組給予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前一天，給予rhGm-csf，20μg/只/天；初次免疫14天后，加強免疫1次。并在二次免疫后14天放血處死，用CHO表達的HBsAg 10μg/ml，作抗原刺激物，檢測脾細胞增殖情況(見檢測方法1)。
2.將BALB/C小鼠，隨機分為4組，每組6只，分別為疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只；GM高劑量組給予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前七天，連續(xù)七天給予rhGm-csf，20μg/只/天；GM中劑量組給予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前三天，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只/天；GM低劑量組給予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前一天，給予rhGm-csf，20μg/只/天；初次免疫14天后，加強免疫1次。并在二次免疫后14天放血處死，測定細胞毒T細胞(CTL)功能(見檢測方法2、3)。
3.將“實驗方法1中放血處死”的小鼠血清收集到離心管中，3000rpm離心15分鐘，分離血清，抗體IgG1、IgG2a亞型滴度檢測(見檢測方法4)。
統(tǒng)計分析方法 實驗組與對照組比較用t檢驗判斷有無顯著性差異。
實驗結(jié)果 1.脾細胞增殖反應(yīng)實驗 二次免疫后14天，三個不同劑量GM+疫苗組小鼠的脾細胞增殖率均高于疫苗組，且與劑量相關(guān)，見表18。
表18不同實驗組小鼠脾細胞增殖情況 **與疫苗組相比P＜0.01 2.細胞毒T細胞(CTL)功能測定 (1)乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗 在三個效應(yīng)細胞(E)與靶細胞(T)配比(20∶1、50∶1、100∶1)中，三個不同劑量GM+疫苗組小鼠的脾細胞細胞毒T細胞(CTL)功能均高于疫苗組，且與劑量相關(guān)，見表19。
表19不同實驗組小鼠脾細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率(％)(X±S) *與疫苗組相比P＜0.05，**與疫苗組相比P＜0.01 (2)MTT法 通過對活細胞的分析，在三個效應(yīng)細胞(E)與靶細胞(T)配比(20∶1、50∶1、100∶1)中，三個不同劑量GM+疫苗組小鼠的脾細胞細胞毒T細胞(CTL)功能均高于疫苗組，見表20。
表20不同實驗組小鼠脾細胞對靶細胞殺傷率(％)(X±S) *與疫苗組相比P＜0.05，**與疫苗組相比P＜0.01 3.抗體IgG1、IgG2a亞型滴度 三個不同劑量GM+疫苗組小鼠的抗體IgG2a亞型滴度均高于疫苗組，其中GM高劑量組顯著高于疫苗組，是疫苗組的4.3倍；見表21。 表21抗體IgG1、IgG2a亞型滴度 **與疫苗組相比P＜0.01 實驗例6重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子與不同劑量的基因工程乙型肝炎疫苗協(xié)同誘導(dǎo)小鼠細胞免疫應(yīng)答的比較 材料與儀器 實驗動物、實驗材料、主要試劑和儀器同實驗例1。
檢測方法 1.脾細胞增殖實驗檢測方法同實驗例1。
2.細胞毒T細胞(CTL)功能測定方法——乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗同實驗例1。
3.細胞毒T細胞(CTL)功能測定方法——MTT法同實驗例1。
4.抗體IgG1、IgG2a亞型滴度檢測方法同實驗例1。
實驗方法 1.將BALB/C小鼠，隨機分為4組，每組6只，分別為疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只；GM+疫苗高劑量組給予基因工程乙型肝炎疫苗(4μg/只)前三天，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只/天；GM+疫苗中劑量組給予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前三天，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只/天；GM+疫苗低劑量組給予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)前三天，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只/天；初次免疫14天后，加強免疫1次。并在二次免疫后14天放血處死，用CHO表達的HBsAg 10μg/ml，作抗原刺激物，檢測脾細胞增殖情況(見檢測方法1)。
2.將BALB/C小鼠，隨機分為4組，每組6只，分別為疫苗組給予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只；GM+疫苗高劑量組給予基因工程乙型肝炎疫苗(4μg/只)前三天，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只/天；GM+疫苗中劑量組給予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前三天，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只/天；GM+疫苗低劑量組給予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)前三天，連續(xù)三天給予rhGm-csf，20μg/只/天；初次免疫14天后，加強免疫1次。并在二次免疫后14天放血處死，測定細胞毒T細胞(CTL)功能(見檢測方法2、3)。
3.將“實驗方法1中放血處死”的小鼠血清收集到離心管中，3000rpm離心15分鐘，分離血清，抗體IgG1、IgG2a亞型滴度檢測(見檢測方法4)。
統(tǒng)計分析方法 實驗組與對照組比較用t檢驗判斷有無顯著性差異。
實驗結(jié)果 1.脾細胞增殖反應(yīng)實驗 二次免疫后14天，GM+不同劑量疫苗的三個實驗組小鼠的脾細胞增殖率均高于疫苗組，且與劑量相關(guān)，見表22。
表22不同實驗組小鼠脾細胞增殖情況 *與疫苗組相比P＜0.05，**與疫苗組相比P＜0.01 2.細胞毒T細胞(CTL)功能測定 (1)乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗 在三個效應(yīng)細胞(E)與靶細胞(T)配比(20∶1、50∶1、100∶1)中，GM+三個不同劑量疫苗的實驗組小鼠的脾細胞細胞毒T細胞(CTL)功能均高于疫苗組，且與劑量相關(guān)，見表23。 表23不同實驗組小鼠脾細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率(％)(X±S) **與疫苗組相比P＜0.01 (2)MTT法 通過對活細胞的分析，在三個效應(yīng)細胞(E)與靶細胞(T)配比(20∶1、50∶1、100∶1)中，GM+三個不同劑量疫苗的實驗組小鼠的脾細胞細胞毒T細胞(CTL)功能均高于疫苗組，見表24。表24不同實驗組小鼠脾細胞對靶細胞殺傷率(％)(X±S) *與疫苗組相比P＜0.05，**與疫苗組相比P＜0.01 3.抗體IgG1、IgG2a亞型滴度 GM+三個不同劑量疫苗的實驗組小鼠的血清抗體IgG2a亞型滴度均高于疫苗組，其中GM高劑量組顯著高于疫苗組，是疫苗組的4.0倍；見表25。
表25抗體IgG1、IgG2a亞型滴度 *與疫苗組相比P＜0.05 實驗結(jié)論 綜合上述實驗結(jié)果，得到以下結(jié)論GM+疫苗組，初次免疫后7天開始，血清抗體滴度比較高，血清抗體中IgG2a占優(yōu)勢，小鼠脾細胞增殖速度最快，比疫苗組高出21.8％；在四個效應(yīng)細胞(脾細胞)與靶細胞配比中，細胞毒T細胞(CTL)功能均高于其他組，其中E∶T＝100∶1的GM+疫苗組有顯著性差異。結(jié)果表明，提前給予rhGm-csf，再給予基因工程乙型肝炎疫苗，可以刺激動物產(chǎn)生細胞免疫，同時可以提高體內(nèi)血清中抗體滴度。
混合疫苗組，初次免疫后7天開始，小鼠血清抗體滴度為最高，直至免疫后35天混合疫苗組仍為最高；二次免疫14天后血清中抗體的含量與其他組相比有顯著性提高。結(jié)果表明，同時給予rhGm-csf和基因工程乙型肝炎疫苗可以促進機體的體液免疫，增加抗體產(chǎn)生。
權(quán)利要求
1.重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和基因工程乙型肝炎疫苗的組合在制備治療或預(yù)防乙型肝炎藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中乙型肝炎為慢性乙型肝炎。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中基因工程乙型肝炎疫苗為CHO細胞表達的基因工程乙型肝炎疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的用途，其中重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和基因工程乙型肝炎疫苗同時給藥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的用途，其中重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子在基因工程乙型肝炎疫苗給藥前給藥。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子在基因工程乙型肝炎疫苗給藥前1-7天給藥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的用途，其中基因工程乙型肝炎疫苗與重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子用量的質(zhì)量配比為1∶0.8-60。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子在制備治療或預(yù)防乙型肝炎藥物中的用途，包括同時或先后給予重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和基因工程乙型肝炎疫苗，用于預(yù)防或治療乙型肝炎。
文檔編號A61P31/00GK1990043SQ200610167110
公開日2007年7月4日 申請日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月12日
發(fā)明者周興軍, 宋欣, 李立敏, 王惠欣, 董愛華, 王世聰, 賀建功, 謝德娟, 封華 申請人:華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司