防治神經(jīng)精神疾病和損傷的神經(jīng)干細胞裂解液的制作方法

專利名稱：防治神經(jīng)精神疾病和損傷的神經(jīng)干細胞裂解液的制作方法
防治神經(jīng)糖神疾病和損傷的神經(jīng)干細胞裂解液發(fā)明背景神經(jīng)精神疾病，如神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙、神經(jīng)退行性疾病、周圍神經(jīng)疾病、癲 癇、兒童注意力缺陷多動癥、抑郁癥、神經(jīng)官能癥和精神分裂癥等，以及腦缺氧 缺血和中樞、周圍神經(jīng)損傷，已經(jīng)發(fā)展成為人類公共衛(wèi)生的重大難題之一。神經(jīng)退行性疾病，包括阿爾茨海默病(Alzheiraer's disease)、帕金森病 (Parkinson's disease)、亨廷頓舞蹈病(Huntington's chorea) 、 HIV-相關(guān)的癡 呆、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化、青光眼等，其病程緩慢，呈進行性發(fā)展，主 要病理表現(xiàn)為神經(jīng)元的大量喪失。隨著人口的老齡化，神經(jīng)退行性疾病，特別是 阿爾茨海默病的發(fā)病率日漸升高。預防和治療阿爾茨海默病的藥物有膽堿能前體物質(zhì)，膽堿酯酶抑制劑、膽堿 能激動劑、兒茶酚胺類藥物、5-羥色胺能藥物、多種類型的神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽類 鴉片類拮抗劑(如納絡酮)、抗氧化劑和神經(jīng)保護劑、神經(jīng)營養(yǎng)物、激素(如他 克林、雌激素)、代謝增強藥、生物膜調(diào)節(jié)劑、抗炎藥、解毒劑、抗淀粉樣蛋白 藥物等，中藥有效成分如石杉堿甲、銀杏葉提取物、兒茶酸、芹菜甲素、人參皂 苷、絞股蘭皂苷等。但迄今為止，尚沒有任何藥物、任何療法取得滿意的療效。 因此，尋找新的有效預防和治療阿爾茨海默病的療法或藥物是一項迫切的任務。兒童注意力缺陷多動癥(attention deficit hyperactivity disorder, ADHD)以多 動、注意力不集中、參與事件能力差為主要癥狀，并伴有沖動任性、情緒不穩(wěn)定 和各種行為障礙(如逃學、說謊、偷竊、打架)等表現(xiàn)，但智力基本正常為其特 點。患兒亦常出現(xiàn)不同程度的人格缺陷、社會適應能力下降和學習困難。14歲 以下兒童的患病率為7%~9%，半數(shù)患兒小于4歲發(fā)病，男女為4 6: 1。鑒于 ADHD對兒童身心健康成長的嚴重危害，已經(jīng)引起教育、醫(yī)務工作者，心理學 家等社會各界的普遍關(guān)注。ADHD的病因尚不清楚，目前也無好的預防措施。至于ADHD的治療，臨 床常用的有利太林(Retalin)又稱哌醋甲酯(methylphenidate)、地昔帕明(去甲3
丙咪嗪)、苯丙胺、苯異妥英(pemoline)又稱匹莫林、三環(huán)類抗抑郁藥如丙咪 嗪等藥物。然而，上述藥物的療效殊不能令人滿意，更重要的是它們都有不同程 度的毒副作用，如廣泛使用的地昔帕明，就有中毒致死的病例，而利太林則被美 國食品和藥物管理局(FDA)列為與鴉片、可待因、嗎啡等同的二類限制藥品， 三環(huán)類抗抑郁藥可導致心電圖改變，苯異妥因的副作用有失眠、厭食、體重下降 等。利太利、苯丙胺的不良反應則是應激性升高、抽搐、厭食、腹痛和失眠?？?之，目前還沒有預防和治療ADHD的安全、有效、可靠的藥物，開發(fā)防治ADHD 的新藥是醫(yī)藥界的一項迫切任務。抑郁癥(depression)的特征性癥狀是悲觀心境，自身感覺很壞；睡眠障 礙，失眠或早醒；食欲很差，動力不足；缺乏活力，興趣和愉快感消失；自責自 罪，消極想死；體重下降；性欲降低。抑郁癥常有便秘、各種疼痛，焦慮、恐怖 的申訴，疑惑或強迫癥狀很普遍，抑郁性的先占觀念尤為常見。抑郁癥可分為原 發(fā)性抑郁癥(雙相或單相抑郁癥)和繼發(fā)性抑郁癥(繼發(fā)于其他精神疾病或軀體 疾病)。抑郁癥正成為全球第五大疾病，預計到2020年，將躍升為第二大疾病，并 將成為致命疾病。世界衛(wèi)生組織己將抑郁癥、癌癥及艾滋病并列為21世紀的三 大疾病及衛(wèi)生教育預防重點工作。鎮(zhèn)靜劑或安眠藥，副作用大，容易造成藥物依 賴，治療效果也不好，不適用于抑郁癥。目前流行的抗抑郁癥藥物，包括有名的 Prozac(氟西汀)、Celexa (西普蘭)和Effexor(怡諾思)，都得在服用幾周后才開 始見效，而且有副作用，其中包括降低性功能等。此外，這些藥對大約三分之 一的病人不起作用。血清素調(diào)節(jié)劑屬新一代抗抑郁藥，效果較好且副作用小，但 國內(nèi)尚未生產(chǎn)。腦組織不能儲存能量，也不能進行糖的無氧酵解，因此其對氧和血供的要求 特別高。缺氧缺血4分鐘即可造成神經(jīng)元的死亡。腦缺血的組織病理學變化在缺 血12小時以后才較明顯神經(jīng)元出現(xiàn)中央性Nissl小體溶解和壞死(紅色神經(jīng)元)； 髓鞘和軸突崩解。腦缺氧缺血、創(chuàng)傷及再灌注損傷引起腦細胞死亡，再灌注損傷 主要與Ca2+超載和氧自由基損傷有關(guān)。谷氨酸通過激活 NMDA(N-methyl-D-aspartic acid receptor)受體等途徑引起細胞內(nèi)〔&2+超載，進而 誘導氧自由基生成，在腦缺氧缺血及創(chuàng)傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷過程中起重要作
用。高氧液用于腦血管病的治療。高氧液使腦組織和腦脊液氧含量增加，有利于 改善腦缺氧缺血，促進意識狀態(tài)和肢體功能的恢復。谷氨酸受體拮抗劑及通過多種途徑拮抗谷氨酸興奮毒性的抑制性遞質(zhì)？氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA )，可使突觸后神經(jīng)元處于保護性抑制狀態(tài)，減少缺血區(qū)域神經(jīng)元的 死亡，從而對腦缺血性損傷產(chǎn)生保護效應。先天遺傳和圍產(chǎn)期一些原因所引起的各種腦疾病，是由于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受 阻，神經(jīng)細胞參加腦的功能活動數(shù)量不足，或神經(jīng)細胞發(fā)育不良、神經(jīng)元功能低 下所致。中老年人因腦的老化、退化所引起的神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變，如腦萎縮、 老年性癡呆、帕金森氏病等，均屬腦神經(jīng)細胞功能減退、過早凋亡所致，但受損 傷神經(jīng)細胞并沒有完全死亡， 一部分受損細胞處于半死亡狀態(tài)，稱之為"休眠狀 態(tài)"。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的再生能力，只要我們給這些受損神經(jīng)細胞通 過腦的各個環(huán)節(jié)提供營養(yǎng)，改善缺氧缺血狀態(tài)和代謝障礙，增加磷脂類等營養(yǎng)物 質(zhì)，就可促進殘存神經(jīng)元的再生及恢復功能，提高神經(jīng)細胞活性及對外界刺激的 敏感性，使處于休眠狀態(tài)的神經(jīng)細胞和受損的神經(jīng)細胞重新復活。20世紀80年代以前一般把"腦細胞在成熟后只有死亡不會再生"或"中樞神 經(jīng)細胞沒有再生能力"列為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基礎(chǔ)特征。但20世紀80年 代以后，學者們先后發(fā)現(xiàn)紋狀體、丘腦、黑質(zhì)、皮層腹側(cè)區(qū)、未定區(qū)、海馬區(qū)、 杏仁區(qū)、屏狀核、室區(qū)、嗅覺區(qū)、延髓等不同部位的腦神經(jīng)元都可以再生。因此， 關(guān)于中樞神經(jīng)元保持一定程度的再生能力就已經(jīng)沒有什么疑問了。自20世紀90年代初提出神經(jīng)干細胞的概念以后，神經(jīng)干細胞在治療人類神 經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙、中樞神經(jīng)損傷、神經(jīng)退行性疾病等各種疾病中的潛在作用成為 人們關(guān)注的焦點。成年動物和人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的干細胞可增殖并分化為神經(jīng)系 統(tǒng)中的各種細胞。神經(jīng)干細胞移植后能在宿主的神經(jīng)組織中生存、增殖、遷移、 整合及分化。神經(jīng)干細胞移植是修復和代替受損腦組織的有效方法。移植到帕金 森病模型鼠腦的神經(jīng)干細胞，在其腦組織中遷移并修復損毀的鼠腦組織，且震顫 癥狀亦明顯減輕。鼠胚胎干細胞移植入癱瘓鼠體內(nèi)，恢復鼠的行走能力。神經(jīng)干 細胞移植治療小兒腦癱已有成功的病例。成人神經(jīng)干細胞自體移植己試用于臨 床。移植神經(jīng)干細胞培養(yǎng)增殖體系已經(jīng)建立。
神經(jīng)干細胞產(chǎn)生一些神經(jīng)干細胞因子(neural stem cell factors)，這些神經(jīng) 干細胞因子有的是已知的，如神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)、堿性 成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和表皮生長因子 (印idermal growth factor, EGF)等，有的則是未知的。這些已知和未知的神經(jīng) 干細胞因子具有使神經(jīng)干細胞增殖、遷移、分化的潛能。 發(fā)明概要本發(fā)明涉及神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液及其制備方法。本發(fā)明涉及神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液的藥物組合物及其制備方法，該 藥物組合物包括神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液和可藥用的載體。本發(fā)明涉及神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液作為預防和治療多種神經(jīng)精神疾 病和神經(jīng)損傷以及腦缺氧缺血的藥物的用途。本發(fā)明涉及神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液的藥物組合物作為預防和治療多 種神經(jīng)精神疾病和神經(jīng)損傷以及腦缺氧缺血的藥物的用途。本發(fā)明涉及神經(jīng)干細胞因子作為預防和治療多種神經(jīng)精神疾病和神經(jīng)損傷以 及腦缺氧缺血的藥物的用途。本發(fā)明涉及神經(jīng)干細胞因子的藥物組合物作為預防和治療多種神經(jīng)精神疾病 和神經(jīng)損傷以及腦缺氧缺血的藥物的用途。神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液或神經(jīng)干細胞因子可在實驗室或工廠制備后 即刻供臨床使用，或以液體形式短期冷藏(4 °0保存后供臨床使用，或較長時間 冷凍(-20，-80 。C)保存，應用時再解凍。神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液或神經(jīng) 干細胞因子可與可藥用的載體，如乳糖、葡萄糖、甘露醇、鹽酸普魯卡因、鹽酸 利多卡因及抗壞血酸等，混合或溶解，按各生物制品工藝制備藥物。神經(jīng)干細胞 裂解液的無細胞濾液或神經(jīng)干細胞因子也可分裝安瓿，冷藏或冷凍保存。神經(jīng)干 細胞裂解液的無細胞濾液或神經(jīng)干細胞因子制劑還可冷凍干燥后冷藏或冷凍保 存。神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液或神經(jīng)干細胞因子或其藥物組合物可注入靜 脈、顱內(nèi)、腦室或蛛網(wǎng)膜下腔，也可局部直接應用到損傷的腦、脊髓和神經(jīng)組織 周圍。神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液含己知的和未知的神經(jīng)干細胞因子。 神經(jīng)干細胞因子可自胚胎神經(jīng)干細胞或成年神經(jīng)干細胞分離、純化，也可用組 織、細胞和基因工程技術(shù)工業(yè)化生產(chǎn)。下面列舉實驗研究的內(nèi)容及其結(jié)果，作為神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液及 神經(jīng)干細胞因子或其藥物組合物可用于預防和治療多種神經(jīng)精神疾病和神經(jīng)損 傷以及腦缺氧缺血藥物的用途的證據(jù)。 材料和方法動物SPF級NIH小鼠，8周齡，實驗室詞養(yǎng)3天后，腹腔注射5IU孕馬血清促性 腺激素，48h后腹腔注射5IU人絨毛膜促性腺激素。雌雄(2:1)合籠。翌日晨檢 査雌鼠，有陰道拴的記為受精后第1日。至第15日時，根據(jù)腹部隆起及乳頭發(fā) 育情況，確定為孕鼠者備用。SPF級Wistar大鼠，90日齡，參考上述方法促雌鼠 排卵，合籠交配，準備孕鼠。試劑Dulbecco's minimum essential medium (DMEM) 、 F12、 DMEM/F12培養(yǎng)基、2%B27、 D-Hanks液、胰蛋白酶、HEPES液(25 mM, pH 7.4)、絲裂霉素C、小牛血 清、胎牛血清、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體，白血病抑制因子(LIF, Sigma) ，bFGF (基因公司)，l-甲基-4苯基-1， 2， 3, 6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2，3，6- tetrahydropyridine, MPTP)，等。 儀器Y-迷宮，自主活動程序自動控制儀等。小鼠胚胎干細胞(Embryonic stem cells, ESCs)的分離和培養(yǎng)早期胚胎的收集 與培養(yǎng)小鼠受精后第4日用含有5 X小牛血清的DMEM從子宮中沖胚，獲得發(fā)育至 囊胚期的早期胚胎,接種在鋪有飼養(yǎng)層的4孔板中。飼養(yǎng)層細胞的制備:無菌取孕 14曰鼠胚，去頭和四肢,剪碎,按常規(guī)胰酶消化法制備原代鼠胚成纖維細胞。向培 養(yǎng)基中加入IO pg/ml的絲裂霉素C ，作用2 3h ，充分洗滌后，接種在涂有明膠的4 孔板中。使用前更換新鮮培養(yǎng)基。胚胎干細胞的分離小鼠囊胚貼壁、內(nèi)細胞團 增殖后，用胰蛋白酶和E日TA消化離散成小的細胞團，接種于新的鋪有飼養(yǎng)層的4 孔板中。培養(yǎng)4 5日后獲得胚胎干細胞樣集落。挑取胚胎干細胞樣集落,消化離 散后接種于新的鋪有詞養(yǎng)層的4孔板中。培養(yǎng)(培養(yǎng)基含LIF)8-10日后，選生長旺 盛的胚胎干細胞集落消化成單細胞懸液。小(大)鼠胚胎神經(jīng)干細胞(neural st柳cells, NSCs)的分離和胚胎神經(jīng)干細胞裂 解液無細胞濾液(filtrate of neural stem cell lysates， FNSCL)的制備取上 述妊娠15日的小(大)鼠，頸椎脫臼法犧牲。無菌條件下剖腹取出妊娠子宮。以 預冷的PBS (—)液反復沖洗血污后，剪開子宮壁一一取出胚胎，放入盛有D-Hanks 液的無菌瓶中。再用D-Hanks液沖洗2-3次。胚胎經(jīng)酒精消毒后，剪開頭皮，去 除顱骨，剝離硬膜，分離胎鼠腦組織，放入盛有DMEM/F12培養(yǎng)液的無菌瓶中。 用眼科剪剪成約lmm3組織小塊，以微量加樣器反復輕柔吹打。再加0.25%胰酶， 混勻，倒入培養(yǎng)皿中。放入37。C培養(yǎng)箱消化。15分鐘后用含10%小牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。吸取消化液，通過250目不銹鋼篩網(wǎng)過濾到無菌瓶 瓶中。然后將濾液移入離心管，1000r/min，離心5min。棄上清，加入上述培養(yǎng) 基6-7ml,計數(shù)細胞，調(diào)整細胞數(shù)。將計數(shù)后的細胞取出一半，冰浴下超聲波破碎 (100W/cm2， 5min)。顯微鏡下觀察，細胞完全破碎后濾膜過濾。細胞懸液及無 細胞濾液無菌分裝備用。參考上述方法分離大鼠胚胎神經(jīng)干細胞并制備大鼠胚胎 神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液。腦室內(nèi)移植神經(jīng)干細胞及注射神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液各種動物模型的 NSCs與FNSCL組動物，于適當時間向腦室內(nèi)分別注射一定量同種動物胚胎神經(jīng)干 細胞懸液或一定量同種動物胚胎神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液。 一.小鼠興奮毒性腦損傷模型方法SPF級雄性NIH小鼠，8周齡，隨機分為對照、谷氨酸單鈉(MSG) 、 NSCs+MSG、 FNSCL+MSG組，每組10只動物。除對照組外，其他組動物MSG (3. 0 g/kg體重) 灌胃，每日1次，共計10日。MSG處理后第I，IO日NSCs+MSG組小鼠腦室內(nèi)移 植2xlOS神經(jīng)干細胞(10^d細胞懸液)各1次，F(xiàn)NSCL組注射2xlOS神經(jīng)干細胞裂 解液無細胞濾液各1次(10nl)。對照及MSG組腦室內(nèi)同時注射同體積DMEM培養(yǎng) 液。移植神經(jīng)干細胞或注射神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液后第12日進行Y迷宮 學習記憶試驗，第15日進行爬繩能力等行為學試驗。行為學試驗后進行組織病 理學檢査。Y迷宮實驗將小鼠放入Y型迷宮，黑暗中無電適應lmin后開始實驗。電擊小 鼠引起逃避反應，立即逃至燈光安全區(qū)作為正確反應。小鼠受電擊后逃到有燈光 安全區(qū)，燈光繼續(xù)作用10秒，熄燈后結(jié)束一次測定。安全區(qū)無規(guī)侓變換，以訓 練小鼠辨別燈光及安全方位的能力。每日訓練20次，訓練時房間保持黑暗、安 靜。每天同一時間段進行實驗，連續(xù)6日。結(jié)果以均
用重復測量資料的分析方法進行統(tǒng)計分析。爬繩實驗將小鼠逐一放置于一條2米長，距地面高1.5米的繩子中間，觀察在3 分鐘內(nèi)小鼠的握繩爬行情況。能握住繩且四肢協(xié)調(diào)爬繩的，記為會爬；握不住或 四肢不能協(xié)調(diào)爬繩的記為不會爬。記錄小鼠在3分鐘內(nèi)從繩上掉下來的次數(shù)。每 天的同一時間段進行實驗。結(jié)果用卡方檢驗法進行統(tǒng)計分析。 組織病理學檢査行為學實驗結(jié)束后給小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻 醉，拉脫頸椎犧牲動物。取全腦，迅速置于10%中性福爾馬林溶液中固定、脫水、 透明、浸蠟、包埋、全腦冠狀面切片(厚度4nm)、貼片、H.E染色，光鏡下檢査 腦海馬區(qū)組織病理學變化。結(jié)果較之正常對照組，MSG組小鼠的學習記憶、爬繩能力顯著降低，差異顯著 (P<0.05)。 NSCs+MSG和FNSCL+MSG組小鼠的學習記憶、爬繩能力接近正常對 照組。圖1顯示Y迷宮實驗的結(jié)果。表1顯示爬繩實驗的結(jié)果。病理檢査結(jié)果 顯示，MSG組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞明顯變性、壞死和增生，而NSCs+MSG和 FNSCL+MSG組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)與正常對照組無明顯差別(圖2)。表1腦室內(nèi)注射神經(jīng)干細胞裂解液濾液對MSG所致成年小鼠高空協(xié)調(diào)運動能力 損傷的恢復作用時間組別動物數(shù)會爬繩動物數(shù)P值-(FNSCL注射后)(只)(只)15曰對照109MSG(3.0g/kg)103<0.01MSG+NSCs106>0.05MSG+簡CL106>0.0530曰對照1010MSG(3.0g/kg)10<0.01MSG+NSCs108>0.05MSG+FNSCL108>0.05*與對照組比；MSG+NSCs組vs. MSG組PO.05; MSG+FNSCL組vs. MSG組: P<0.05。重復上述實驗，但增加bFGF+MSG組，即小鼠隨機分為對照、MSG、 NSCs+MSG、 FNSCL+MSG、 bFGF+MSG組，每組10只動物。MSG處理后第1， 10日bFGF+MSG組
組小鼠腦室內(nèi)注射bFGF液(2.0 |_ig, 10 pl DMEM培養(yǎng)液溶解)各1次，其他處理 同上。行為學試驗和病理檢査結(jié)果表明，bFGF對MSG造成的腦損傷也有顯著的 修復作用，但效果遜于NSCs和FNSCL。二. FNSCL和bFGF誘導胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞分化方法胚胎干細胞的誘導分化實驗小鼠胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)方法同前。(1) 對照組:在胚胎干細胞常規(guī)培養(yǎng)基(不含LIF)中培養(yǎng)。(2)FNSCL組:在胚胎干細胞 常規(guī)培養(yǎng)基(不含LIF)中加入FNSCL培養(yǎng)。每2日換液1次。(3)bFGF組在胚胎干細 胞常規(guī)培養(yǎng)基(不含LIF)中加入bFGF培養(yǎng)。用形態(tài)學和NSE免疫細胞化學染色法對 細胞分化進行鑒定。結(jié)果FNSCL組細胞貼壁培養(yǎng)第24h，大部分細胞的胞體拉長，從細胞的兩極長出兩 條短小且無分支的突起(圖3) 。NSE免疫細胞化學染色法實驗結(jié)果表明，F(xiàn)NSCL組神 經(jīng)干細胞誘導分化率達50%以上。bFGF也有顯著的誘導分化作用，但效果遜于 FNSCL。三. 小鼠腦偏癱模型方法45mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠不動后，用眼科剪剪開頭 部正中線處皮膚，暴露顱骨。找出矢狀縫、冠狀縫及人字縫，于矢狀縫上冠狀縫 及人字縫中點旁開2-3mm處(左或右)垂直進針，穿過顱骨損傷腦組織，造成對 側(cè)腦偏癱。除正常對照組外，術(shù)后偏癱者再隨機分為偏癱、NSCs治療、FNSCL 治療組，每組10只動物。術(shù)后第1,10日NSCs組小鼠腦室內(nèi)移植2xlOS神經(jīng)干 細胞(10pl細胞懸液)各1次，F(xiàn)NSCL組注射2xlOS神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液 各1次(10pl)。對照和偏癱組腦室內(nèi)同時注射同體積DMEM培養(yǎng)液。腦室內(nèi)移植 神經(jīng)干細胞和注射神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液后密切觀察動物行為。 結(jié)果腦室內(nèi)移植神經(jīng)干細胞或注射神經(jīng)干細胞裂解液濾液后3-7日，NSCs和 FNSCL治療組分別有5/10和4/10小鼠偏癱恢復，能進食、飲水，并自由行動， 2/10和3/10小鼠部分恢復，能勉強進食、飲水。對照組小鼠無異常，而偏癱組小鼠則未見恢復，之后悉數(shù)死亡。四. Meynert基底核損毀模型方法SPF級雄性Wistar大鼠，體重260-280g。腹腔注射氯胺酮(80-100mg/kg) 麻醉。固定于立體定位儀上，調(diào)節(jié)固定平面使門齒比內(nèi)耳連線中點低2nm。清潔 頭頂皮膚作正中豎切口，撥開皮下筋膜暴露頂骨，在兩側(cè)冠狀縫后鉆出小孔，取 出碎骨屑，保持硬腦膜完整。定位坐標前囟后0.9mm，中線外側(cè)2.6mm，硬 腦膜下6.8mm。每側(cè)用微量注射器分別注入25nmo1鵝膏蕈氨酸，0.1 pl/min ，每 側(cè)總體積lpl。注完后留針5-10min。術(shù)后牙托粉封固顱骨孔，縫合皮膚。3天內(nèi) 每日肌肉注射IO萬單位青霉素G。除對照組外，Meynert基底核損毀大鼠再隨 機分為Meynert基底核損毀、NSCs治療、FNSCL治療組，每組10只動物。術(shù)后 第1, 10日NSCs治療組大鼠腦室內(nèi)移植2xlOS神經(jīng)干細胞(10pl細胞懸液)各1 次，F(xiàn)NSCL組注射2xl05神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液各1次(10pl)。對照和 Meynert基底核損毀組大鼠腦室內(nèi)同時注射同體積DMEM培養(yǎng)液。腦室內(nèi)移植神 經(jīng)干細胞或注射神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液，15日后進行被動逃避反應、學 習記憶等行為學試驗。結(jié)果Meynert基底核損毀大鼠表現(xiàn)為一次性被動逃避反應潛伏期縮短，但操作 性行為不受影響。Y迷宮實驗結(jié)果顯示，學習記憶能力顯著降低。NSCs和FNSCL 治療組大鼠的被動逃避反應和學習記憶能力，大部分大鼠(6/10， 5/10)接近對照 組，小部分大鼠(4/10， 5/10)不如對照組，但優(yōu)于Meynert基底核損毀組。 五.小鼠帕金森病模型方法10-12周齡，體重25-30g的成年C57/BI褐小鼠。小鼠隨機分為對照、MPTP 損傷組、NSCs治療組和FNSCL治療組，每組10只動物。除對照組外，每日每次 腹腔注射MPTP4mg/kg，持續(xù)20日。MPTP損傷后第1， 10日NSCs組小鼠腦室 內(nèi)移植2xlOS神經(jīng)干細胞(10^U細胞懸液)各1次，F(xiàn)NSCL組注射2xlOS神經(jīng)干細 胞裂解液無細胞濾液各1次(10pl)。對照和MPTP損傷組小鼠腦室內(nèi)同時注射同 體積DMEM培養(yǎng)液。腦室內(nèi)移植神經(jīng)干細胞、注射神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液 20日后進行爬桿、懸尾和游泳等行為學試驗。爬桿試驗將一直徑為25cm的軟木固定于一根長50cm粗lcm的木桿頂端，木 桿上纏紗布以防打滑，然后將被測小鼠放到小球上，并記錄以下幾個時間(1) 小鼠從小球上下來所需的時間；(2)小鼠爬完桿子上半部分所需時間；G)小鼠 爬完桿子下半部分所用時間。然后按以下標準記分3s內(nèi)完成上述某一動作的 記3分，6s內(nèi)完成的記2分，超過6s完成的記l分，最后計算得分情況，并做 統(tǒng)計學分析。
懸尾實驗將受試小鼠懸掛于一根水平電線上，如小鼠用兩后爪抓住電線則記3 分，如用一后爪抓住電線則記2分。如果小鼠兩后爪均抓不住電線則記1分，最 后計算得分情況，并做統(tǒng)計學分析。游泳實驗將受試小鼠放入一個20cmx30cm規(guī)格的水箱中，水溫為22 25°C。 評分標準如下在受試時間內(nèi)連續(xù)不斷游泳者記3.0分；大部分時間游泳僅偶爾 漂浮者記2.5分；漂浮時間占整個受試時間50%以上者記2.0分；偶爾游泳者記 1.5分；偶爾用后肢游動并漂浮在一邊者記1.0分。最后計算得分情況，并做統(tǒng) 計學分析。結(jié)果MPTP損傷組小鼠的爬桿、懸尾和游泳試驗結(jié)果顯然不及對照組，而NSCs 和FNSCL治療組則接近對照組，。六. 大鼠(利血平)帕金森病模型方法SPF級、雄性、體重200-300g的Wistar大鼠，隨機分為對照組、利血平組， NSCs和FNSCL治療組，每組10只動物。除對照組外，每日皮下注射利血平(l mg/kg 體重)l次，連續(xù)10天。利血平處理后1,10日NSCs組大鼠腦室內(nèi)移植3xlOS神 經(jīng)干細胞(10pl細胞懸液)各1次，F(xiàn)NSCL組注射3xlOS神經(jīng)干細胞裂解液無細胞 濾液各l次(l(Hil)。腦室內(nèi)移植神經(jīng)干細胞、注射神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液 后每日測量體溫，并觀察大鼠毛發(fā)、體型、體態(tài)、步態(tài)及行為學的變化。 結(jié)果利血平組大鼠眼瞼下垂，尾及四肢震顫，尾張力增加，軀體僵硬，曲背， 前肢腕關(guān)節(jié)彎曲并貼近軀干，步態(tài)失常，行動遲緩，脫毛，體溫下降；而腦室內(nèi) 移植神經(jīng)干細胞、注射神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液組大鼠的體溫，毛發(fā)、體型、 體態(tài)、步態(tài)及行為接近對照組大鼠。七. 大鼠嗅球切除模型方法。SPF級、雄性、體重300-350g的Wistar大鼠，隨機分為對照組、假手術(shù) 組、NSCs治療組和FNSCL治療組，每組10只動物。經(jīng)過4天每日數(shù)次的撫摸之 后，用三溴乙醇(250mg/kg, ip)麻醉大鼠。從大鼠囟前l(fā)cm至前囟后lcm正中線 處縱切頭皮，暴露顱骨。在距離前囟前面8mm、正中線兩側(cè)2mtn處分別鉆通顱 骨，使出現(xiàn)兩個2mm直徑的小孔。用連在水泵上的鈍的皮下注射針，借助負壓 將嗅球吸出。嗅球吸出后即向NSCs組大鼠腦嗅球部位移植106神經(jīng)干細胞(1(^1 細胞懸液)、向FNSCL組大鼠腦嗅球部位注射106神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液(10pl)。用止血海綿填充小孔，四環(huán)素粉末灑在傷口上，縫合皮膚。假切除大鼠 手術(shù)方式同上，只是不吸除嗅球。術(shù)后每日撫摸動物數(shù)次。術(shù)后第5、 10日再向 NSCs組大鼠腦室內(nèi)移植106神經(jīng)干細胞(10|11細胞懸液)各1次，F(xiàn)NSCL組注射 106神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液各1次(10pl)。術(shù)后20日后進行下述實驗。 開場活動實驗采用自動記錄分析攝像儀。觀察記錄3min內(nèi)大鼠運動量。 跳臺被動回避實驗在電擊箱內(nèi)放一個木制平臺，平臺高出電擊箱底大約5cm左 右。將大鼠先置于電擊箱(不予電擊)中使之熟悉環(huán)境lmin。然后將大鼠放于 平臺上，只要其4個爪全部接觸到電擊箱底部就給予一次2s 0.6mA左右的電擊， 觀察3min，記錄大鼠遭電擊的總次數(shù)。結(jié)果嗅球切除大鼠活動量和遭受電擊次數(shù)都明顯多于假切除組大鼠和對照組，而腦嗅球部位移植神經(jīng)干細胞或注射神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液組大鼠的活動量和遭受電擊次數(shù)都明顯減少，接近假手術(shù)組和對照組大鼠。八.新生大鼠缺氧缺血腦損傷模型方法缺氧缺血腦損傷模型SPF級7日齡體重12克以上的Wistar新生大鼠。乙醚吸 入麻醉，75%酒精消毒皮膚，仰臥位，行頸部正中切口，長約l-1.5cra。依次分 離皮膚、皮下脂肪及肌肉，分離出左側(cè)頸總動脈并用7.0滅菌絲線雙線結(jié)扎，縫 合傷口并再次消毒皮膚。整個手術(shù)過程在15min內(nèi)完成。休息2h后，將大鼠置 于有機玻璃低氧艙內(nèi)(30 cmX40 cmX50 cm)，兩側(cè)各有一直徑為1 cm小孔與外 界相通， 一側(cè)通氮氧混合氣，另一側(cè)與測氧儀相通，底層鋪有鈉石灰以吸收C02 及濕氣。按8%02/92%&比例輸入氧氣和氮氣，測氧儀監(jiān)測氧濃度在7 %-9%。艙 內(nèi)溫度控制在(36士2)。 C，濕度為(70士5H。缺氧時間持續(xù)lh。實驗結(jié)束后將 大鼠放回鼠籠由母鼠行母乳喂養(yǎng)。分組除對照組外，按上述方法造缺氧缺血腦損傷模型，將造模成功的大鼠再隨 機分為缺氧缺血腦損傷模型組和NSCs、 FNSCL治療組。于術(shù)后1, 10日向NSCs 組大鼠腦室內(nèi)移植3xl()S神經(jīng)干細胞(l(Hd細胞懸液)各1次，向FNSCL組大鼠腦 室內(nèi)注射3xlOS神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液(l(^l)各l次。21日齡時斷奶，斷 奶后按性別分籠飼養(yǎng)。腦室內(nèi)移植神經(jīng)干細胞或注射神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾 液20閂后進行行為學實驗和肉眼觀察。肉眼觀察取出鼠腦，肉眼觀察將腦病變 分為正常、輕度、中度及重度改變。正常肉眼未見明顯異常；輕度:左腦病變范 圍〈1/3，中度1/2>左腦病變范圍>1/3;重度:左腦病變范圍>1/2。 結(jié)果缺氧缺血腦損傷模型組部分動物(6/10)提起鼠尾時向患側(cè)旋轉(zhuǎn)；部分動 物(4/10)處于精神抑制狀態(tài)，不能自發(fā)活動。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)左腦病變范圍〉1/2。 NSCs治療組部分動物(5/10)行為接近正常，部分動物(5/10)提起鼠尾時健側(cè)前 肢不能前伸。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)本組部分鼠(5/10)，左腦接近正常，部分鼠(5/10)左腦 病變范圍〈1/3。FNSCL治療組小部分動物(4/10)行為接近正常，左腦接近正常；大 部分動物(6/10)提起鼠尾時健側(cè)前肢不能前伸，左腦病變范圍〈1/3。九.神經(jīng)干細胞裂解液的臨床應用自體和異體干細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病是一種有廣闊應用前景的新的治療途徑。目前應用最多、治療效果最好的是腦組織神經(jīng)干細胞移植治療帕 金森病。從患者受損腦組織中提取神經(jīng)干細胞，體外培養(yǎng)、擴增后再植入損傷部 位，患者可恢復部分認知功能?；颊咦泽w骨髓間質(zhì)干細胞亦可作為干細胞來源。 人類胚胎干細胞的培養(yǎng)成功和體外定向誘導人類胚胎干細胞分化為神經(jīng)細胞的 研究和開發(fā)為長期困擾醫(yī)學界的難題，如阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性側(cè) 索硬化的治療，腦和神經(jīng)損傷后的修復，帶來了希望。鑒于l)在人類羊水、毛囊、骨髓和其他一些組織中發(fā)現(xiàn)了干細胞,就研究和 開發(fā)新藥而言，成年干細胞比胚胎干細胞快得多；2)胚胎干細胞移植可能有潛在 的副作用；3)神經(jīng)干細胞裂解液具有使神經(jīng)干細胞增殖、遷移、分化的潛能;4) 神經(jīng)干細胞裂解液中起作用的一些神經(jīng)干細胞因子可被分離、純化,進而人工制 備、批量生產(chǎn);5)神經(jīng)干細胞裂解液及神經(jīng)干細胞因子的研發(fā)不涉及倫理、道德、 法律，因此，神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液及神經(jīng)干細胞因子的制劑有可能在 預防和治療多種神經(jīng)精神疾病和神經(jīng)損傷以及腦缺氧缺血中廣泛應用。


圖1.腦室內(nèi)注射神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液對成年小鼠MSG灌胃所致Y迷宮 學習和記憶能力損傷的修復作用圖2.腦室內(nèi)注射神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液對成年小鼠MSG灌胃所致海馬損 傷的修復作用A:對照(HE，x50) ; B: MSG(HE, x50) ;C: MSG+NSCs(HE, x50) D: MSG+FNSCL(HE, x50)圖3.神經(jīng)干細胞裂解液無細胞濾液誘導胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞分化 A:對照(x50); B: FNSCL(x50)
權(quán)利要求
1.神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液的制備方法。
2. 神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液作為預防和治療多種神經(jīng)精神疾 病和神經(jīng)損傷以及腦缺氧缺血的藥物的用途。
3. 神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液的藥物組合物及其制備方法。
4. 神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液的藥物組合物作為預防和治療多種神經(jīng)精神疾病和神經(jīng)損傷以及腦缺氧缺血的藥物的用途。
5. 神經(jīng)干細胞因子作為預防和治療多種神經(jīng)精神疾病和神經(jīng)損傷以 及腦缺氧缺血的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及防治神經(jīng)精神疾病和損傷的神經(jīng)干細胞裂解液的制備及其藥用。胚胎神經(jīng)干細胞分離自胎腦，成年神經(jīng)干細胞分離自成年動物的神經(jīng)組織。神經(jīng)干細胞經(jīng)超聲波破碎后過濾制得神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液。神經(jīng)干細胞裂解液的無細胞濾液含已知的和未知的神經(jīng)干細胞因子。這些已知和/或未知的神經(jīng)干細胞因子具有使神經(jīng)干細胞增殖、遷移、分化的潛能。神經(jīng)干細胞裂解液誘導胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞分化。神經(jīng)干細胞裂解液對小鼠興奮毒性腦損傷、腦偏癱，大鼠Meynert基底核損毀所致的阿爾茨海默氏病、小鼠和大鼠帕金森病、大鼠嗅球切除所致的抑郁癥和新生大鼠缺氧缺血腦損傷模型，都具有與神經(jīng)干細胞移植相似的治療效果。
文檔編號A61K38/18GK101156944SQ20061013583
公開日2008年4月9日 申請日期2006年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月7日
發(fā)明者于廷曦 申請人:于廷曦