專利名稱：聚乙二醇乙醛衍生物及其與藥物的結合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及聚乙二醇衍生物，尤其是涉及一種含乙醛基活性官能團的聚乙二醇衍生物以及這種新型的聚乙二醇衍生物在醫(yī)藥中的應用。
背景技術：
聚乙二醇及其衍生物作為蛋白藥物的修飾劑已經在生物技術領域得到了廣泛的應用，其修飾后的蛋白復合體具有低毒、低免疫原性、生理半衰期長等優(yōu)勢，在許多批準藥品中廣泛被使用，如PEG-intron，一種α-干擾素與聚乙二醇的鍵合物就表現出了更長的循環(huán)半衰期和更好的治療效果。
聚乙二醇醛基活性衍生物作為對蛋白質、多肽末端氨基的定點修飾材料，應用較為廣泛，目前普遍應用的是醛類衍生物主要集中在丙醛及以上的醛類衍生物。乙醛類化合物雖然具有較高的反應活性，但是通常的結構，如
這種結構由于旁側的烷氧基存在，促使烯醇負離子的生成，使縮合反應容易進行。在制備和儲存中極易發(fā)生羥醛縮合反應而導致副產物，產品質量和儲存使用均難以得到有效控制，在國內外未得到很好的開發(fā)和利用。
本發(fā)明用酰胺鍵取代了烷氧基類型的基團，使乙醛類衍生物具有了較高的穩(wěn)定性，產品質量和穩(wěn)定性得到大幅度提高，和蛋白質的連接也較為順利。極大的提高了醛類聚乙二醇衍生物的應用領域。
本發(fā)明所提供的一系列聚乙二醇(PEG)乙醛衍生物克服了醛類聚乙二醇在乙醛類衍生物的合成障礙，并且其優(yōu)異的反應活性使其可以替代現有的醛類產品，可以有效的提高相應藥物的穩(wěn)定性和生物降解特性。
發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種通式I的化合物
其中， 所述的PEG是分子量為150～60,000的聚乙二醇聚合物或其衍生物，所述的聚乙二醇聚合物或其衍生物具有分支、直鏈、星形或樹形的結構； 所述的X是選自由O、C1-12烷基、芳烷基、酯基、碳酸酯基、酰胺基、酰胺酯基、醚基、氨基甲酸酯基組成的組的連接基團； 所述的Y是聚乙二醇聚合物或其衍生物的一個或多個末端基團，所述的Y可以相同或不同，選自H，RO或者靶向性基團，其中，所述的R為含有1-12個碳原子的烷基、環(huán)烷基或者芳烷基。
直鏈聚乙二醇(PEG)的結構通式如下所示
其中n為任何整數，表征其聚合度。
直鏈聚乙二醇有兩個末端羥基，當一端羥基被一個惰性基團取代，則稱聚乙二醇的一端封端。其結構通式如下所示
其中 R’為H、C1-12烷基、環(huán)烷基或芳烷基； n為任何整數，表征其聚合度。
R’為低級烷基時，R’可以是含有1-6個碳原子的任何低級烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、正戊基或正己基。當R’為環(huán)烷基時，R’優(yōu)選為含3-7個碳原子的環(huán)烷基，如環(huán)丙基、環(huán)丁基和環(huán)己基。優(yōu)選的環(huán)烷基為環(huán)己基。其典型的化合物是甲氧基聚乙二醇(mPEG)，其他聚乙二醇類似物或聚乙二醇共聚物也可用于此發(fā)明應用。
對聚乙二醇而言，一般采用分子量予以表示，只要使形成結合物的聚乙二醇的分子量為300～60,000道爾頓，這相當于n為大約6～1300。更優(yōu)選為，n為28、112和450，這分別相應于分子量為1325、5000和20,000。由于通常由其平均分子量而非自重復單元限定的起始PEG化合物的潛在不均一性，優(yōu)選用分子量表征聚乙二醇聚合物，而不是用整數n表示PEG聚合物中的自重復單元。各種分子量的起始PEG化合物可以通過本領域中的已知方法制備或者可以從商業(yè)來源得到。
根據本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，直鏈聚乙二醇(PEG)乙醛衍生物可以具有以下通式的結構(Ia)
聚乙二醇衍生物除直鏈結構以外，還可以有分支結構，此時，本發(fā)明的化合物可以表示如下
其中 R”為中心分支原子，選自C或N，或其他原子； X1，X2為連接基團，所述的X1和X2可以相同或不同，分別選自由O、C1-12烷基、芳烷基、酯基、碳酸酯基、酰胺基、酰胺酯基、醚基和氨基甲酸酯基組成的組； Y1，Y2為末端基團，，所述的Y1和Y2可以相同或不同，分別選自由H，RO或者靶向性基團組成的組，其中，所述的R為含有1-12個碳原子的烷基、環(huán)烷基或者芳烷基。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述的分支形聚乙二醇(PEG)乙醛衍生物具有以下通式的結構(IIa)
根據本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，所述的分支形聚乙二醇(PEG)乙醛衍生物包括具有以下通式的結構(IIb)
根據本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，所述的分支形聚乙二醇(PEG)乙醛衍生物包括具有以下通式的結構(IIc)
根據本發(fā)明的又一個優(yōu)選實施方案，所述的分支形聚乙二醇(PEG)乙醛衍生物包括具有以下通式的結構(IId)
根據本發(fā)明的再又一個優(yōu)選實施方案，所述的分支形聚乙二醇(PEG)乙醛衍生物包括具有以下通式的結構(IIe)
本發(fā)明中所稱的聚乙二醇聚合物衍生物是指本領域中公知的那些具有聚乙二醇的乙二醇單元聚合物，并在聚乙二醇基礎上進行結構化修飾以滿足其分子空間拓撲結構的需求，如本發(fā)明所特別提到的各種分支結構的聚乙二醇，所有這些結構都必須和本發(fā)明所強調的以酰胺基為側位的醛基為主要活性官能團。
根據本發(fā)明的另一個方面，其提供包含上述聚乙二醇(PEG)-藥物結合物作為活性成分的藥物組合物。
根據本發(fā)明的再一個方面，其提供所述結合物在制備藥物組合物中的用途。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的化合物與蛋白質藥物的結合物，所述的蛋白質選自由溶纖酶、促白細胞生成素(GCSF)、促紅細胞生成素(EPO)、生長素(GH)、白介素(IL)、干擾素、水蛭素、抗體(antibody)和抗體片段(Fab)組成的組。
根據本發(fā)明的結合物可改善藥物吸收，延長作用時間，增強療效，降低給藥劑量及避免某些毒副作用。
圖1為末端含靶向糖分子的聚二醇乙醛與蛋白質結合物的凝膠電泳圖。
具體實施例方式 在本發(fā)明的聚乙二醇(PEG)醛類衍生物中所用的聚乙二醇是一種親水性聚合物，包括聚乙二醇與聚丙二醇、聚乙烯醇、或者聚丙烯嗎啉的共聚物，其中特別優(yōu)選是聚乙二醇。并且可根據實際需要，選擇適當的聚乙二醇結構進行相應的修飾，使其具有活性醛基。該聚合物能夠提供與藥物分子的連接點，由此與蛋白質、多肽或者其他天然藥物活性成分中的氨基連接在一起。
在本發(fā)明的聚乙二醇(PEG)醛類衍生物中，醛基是通過一個穩(wěn)定酰胺鍵與聚乙二醇衍生物連接起來，旁側的酰胺鍵對醛基的穩(wěn)定性有較大提高。
現在以聚乙二醇衍生物為例，說明本發(fā)明中親水性聚合物醛基改造過程。
本發(fā)明聚乙二醇(PEG)醛類衍生物可以采用兩種方法獲得 方法一
方法二
實施例 下面結合實例描述本發(fā)明的結合物及其制備方法，它不限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍由權利要求限定。
實施例1 甲氧基聚乙二醇乙醛的制備
10克甲氧基聚乙二醇乙酸-N-羥基丁二酰亞胺酯(分子量為20000)溶解在50毫升二氯甲烷中，加入0.1ml 2，2-二乙氧基乙胺，氮氣保護下攪拌過夜。減壓濃縮溶液，加入100毫升乙醚。過濾收集沉淀真空干燥，產率9.5克(95％)。
9克甲氧基聚乙二醇二乙縮醛(分子量為20000，由上步制得)溶解在pH＝5的磷酸鹽緩沖溶液中，室溫下反應48小時。加30克氯化鈉溶解，二氯甲烷萃取三次，合并有機相，減壓濃縮，乙醚沉淀，過濾收集沉淀，乙醚洗滌。產率7.2克(80％)。NMR(D2O)1.80(q，1個氫)，2.72(t，1個氫)，3.29(s，3個氫)，3.61(s，PEG中氫)，5.06(t，1個氫)。熔點56-58℃。
實施例2 甲氧基聚乙二醇乙醛的制備
10克甲氧基聚乙二醇乙酸-N-羥基丁二酰亞胺酯(分子量為20000)溶解在50毫升二氯甲烷中，加入0.1ml乙醇胺，氮氣保護下攪拌過夜。減壓濃縮溶液，加入100毫升乙醚。過濾收集沉淀真空干燥，產率9.5克(95％)。
9克甲氧基聚乙二醇乙酸-2-羥基乙酰胺(分子量為20000，由上步制得)溶解在DMSO中，加入二氯乙酸(DCAA)，攪拌溶解，再加入二環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)，室溫下攪拌反應過夜。乙醚沉淀，過濾收集沉淀，乙醚洗滌。產率4.5克(50％)。NMR(D2O)1.80(q，1個氫)，2.72(t，1個氫)，3.29(s，3個氫)，3.61(s，PEG中氫)，5.06(t，1個氫)。熔點56-58℃。
實施例3 Y形聚乙二醇乙醛的制備
10克Y形聚乙二醇乙酸-N-羥基丁二酰亞胺酯(分子量為40000)溶解在50毫升二氯甲烷中，加入70ul 2，2-二乙氧基乙胺，氮氣保護下攪拌過夜。減壓濃縮溶液，加入100毫升乙醚。過濾收集沉淀真空干燥，產率10.1克(99％)。
9克Y形聚乙二醇乙酸二乙縮醛(分子量為40000，由上步制得)溶解在200ml去離子水中，氮氣保護，滴加10％磷酸調pH＝2.0。反應36小時，用5％磷酸氫二鈉調pH＝6，加氯化鈉30克，二氯甲烷萃取三次，合并有機相，減壓濃縮，異丙醇沉淀，過濾收集沉淀，乙醚洗滌。產率7.2克(80％)。NMR(D2O)1.20(q，1個氫)，，3.29(s，3個氫)，3.61(s，PEG中氫)，4.13(t，1個氫)。熔點59-61℃。
實施例4 末端含靶向糖分子的聚二醇乙醛的制備
10克氨基葡萄糖聚乙二醇乙酸-N-羥基丁二酰亞胺酯(分子量為35000)溶解在50毫升二氯甲烷中，加入70ul 2，2-二乙氧基乙胺，氮氣保護下攪拌過夜。減壓濃縮溶液，加入100毫升乙醚。過濾收集沉淀真空干燥，產率10.1克(99％)。NMR(DMSO)1.22(t，6個氫)，1.43(s，1個氫)，2.70(s，1個氫)，3.64(PEG中的氫)，4.02(d，4個氫)，4.50(t，2個氫)，5.26(s，1個氫)。
9克氨基葡萄糖聚乙二醇二乙縮醛(分子量為35000，由上步制得)溶解在200ml去離子水中，氮氣保護，滴加10％磷酸調pH＝2.0。反應36小時，用5％磷酸氫二鈉調pH＝6，加氯化鈉30克，二氯甲烷萃取三次，合并有機相，減壓濃縮，異丙醇沉淀，過濾收集沉淀，乙醚洗滌。產率7.2克(80％)。NMR(D2O)1.43(s，1個氫)，2.70(s，1個氫)，3.64(PEG中的氫)，4.02(d，4個氫)，4.50(t，2個氫)，5.26(s，1個氫)。
實施例5 末端含靶向糖分子的聚二醇乙醛與蛋白質結合物的制備 2.0毫克溶菌酶溶解在2毫升100mM磷酸鹽緩沖液pH＝5～6，加入20mM氰硼氫化鈉。加入20毫克末端含靶向糖分子的聚二醇乙醛(由實施例4制備)，室溫下震搖反應2小時。SDS-PAGE檢測反應(條件堆積膠濃度5％，分離膠濃度15％，電泳約40分鐘，染色半小時，脫色1小時)。
圖1顯示所述末端含靶向糖分子的聚二醇乙醛與蛋白質結合物的凝膠電泳圖，其中，M標準蛋白及分子量；1蛋白與PEG質量比為1∶10；2蛋白與PEG質量比為1∶15。
權利要求
1.通式I的化合物
其中，
所述的PEG是分子量為150～60,000的聚乙二醇聚合物或其衍生物，所述的聚乙二醇聚合物或其衍生物具有分支、直鏈、星形或樹形的結構；
所述的X是選自由O、C1-12烷基、芳烷基、酯基、碳酸酯基、酰胺基、酰胺酯基、醚基、氨基甲酸酯基組成的組的連接基團；
所述的Y是所述聚乙二醇聚合物或其衍生物的一個或多個末端基團，所述的Y可以相同或不同，選自H，RO或者靶向性基團，其中，所述的R為含有1-12個碳原子的烷基、環(huán)烷基或者芳烷基。
2.如權利要求1所述的化合物，其中，所述的R選自甲氧基、乙氧基、環(huán)己基或芐基。
3.如權利要求1所述的化合物，其中，所述的R是靶向性基團，所述的靶向性基團選自氨基葡萄糖、氨基半乳糖或單克隆抗體。
4.如權利要求1所述的化合物，其中，所述的PEG的分子量在300-60000Da的范圍內。
5.如權利要求1所述的化合物，所述的化合物具有通式II的結構。
其中
所述的R”為中心分支原子，選自C或N；
所述的X1和X2為連接基團，所述的X1和X2可以相同或不同，分別選自由O、C1-12烷基、芳烷基、酯基、碳酸酯基、酰胺基、酰胺酯基、醚基、氨基甲酸酯基組成的組；
所述的Y1，Y2為末端基團，所述的Y1，Y2可以相同或不同，分別選自由H，RO或者靶向性基團組成的組，其中，所述的R為含有1-12個碳原子的烷基、環(huán)烷基或者芳烷基。
6.如權利要求1所述的化合物，所述的化合物具有通式Ia的結構
7.如權利要求5所述的化合物，其中，所述的化合物具有選自如下通式IIa至IIe之一的結構
8.權利要求1中所述的化合物，其中，所述的聚乙二醇聚合物是聚乙二醇的均聚物，或者，聚乙二醇與聚丙二醇、聚乙烯醇或聚丙烯嗎啉的共聚物。
9.如權利要求1-8之一的化合物與蛋白質藥物的結合物。
10.如權利要求9所述的結合物，其中，所述的蛋白質藥物選自由溶纖酶、促白細胞生成素、促紅細胞生成素、生長素、白介素、干擾素、水蛭素、抗體和抗體片段組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類酰胺鍵為過渡基團的親水性聚合物乙醛衍生物以及與蛋白質分子的結合物，其中，PEG為分子量150～60,000、分支、直鏈、星形或樹形的結構的聚乙二醇聚合物或其衍生物；X是選自由O、C1-12烷基、芳烷基、酯基、碳酸酯基、酰胺基、酰胺酯基、醚基、氨基甲酸酯基組成的組的連接基團；Y是聚乙二醇聚合物或其衍生物的末端基團，選自H，RO或者靶向性基團，其中，所述的R為含有1-12個碳原子的烷基、環(huán)烷基或者芳烷基。
文檔編號A61K47/48GK101108895SQ20061009908
公開日2008年1月23日 申請日期2006年7月19日 優(yōu)先權日2006年7月19日
發(fā)明者嵇世山, 宣 趙, 強 顧 申請人:北京鍵凱科技有限公司