專利名稱：轉(zhuǎn)導(dǎo)肽－人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白及其藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有藥用價值的融合蛋白，具體為轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白，編碼該融合蛋白的核酸分子。本發(fā)明也涉及含有該融合蛋白的藥物組合物。
背景技術(shù)：
概述粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colonystimulating factor，GM-CSF)是主要的造血生長因子之一，可刺激早期多能造血干細(xì)胞和粒-單系祖細(xì)胞的增殖與分化；增強(qiáng)成熟中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞功能；協(xié)同刺激紅系、巨核系及高增殖潛能祖細(xì)胞(HPP-CFC)生長；延長巨噬細(xì)胞存活時間及提高其抗腫瘤能力；同時，GM-CSF還能刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長，阻止多種細(xì)胞凋亡，在造血調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。GM-CSF還可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞(DC)等APC分化、成熟和活化及上調(diào)CD86的表達(dá)以激發(fā)對腫瘤的免疫應(yīng)答；促進(jìn)Th、Tc、NK在腫瘤部位浸潤，從而殺傷腫瘤。
作為一個多潛能的造血生長因子，它的主要臨床應(yīng)用是促進(jìn)骨髓造血，目前在臨床上rhGM-CSF已成功地用于治療惡性腫瘤放、化療后所致的白細(xì)胞減少癥，以及用于骨髓移植、再生障礙性貧血和某些存在白細(xì)胞低下的免疫缺陷性疾病的治療等。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，GM-CSF不僅能夠作用于造血干、祖細(xì)胞促進(jìn)骨髓造血，而且還作用于目前已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞，以促進(jìn)免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[[2，3]。另外，GM-CSF還作用于角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黏膜細(xì)胞等。近年來許多文獻(xiàn)報道，rhGM-CSF不但能夠用于防治白細(xì)胞減少癥，而且在創(chuàng)傷愈合、抗病毒、抗真菌等治療中也有著很好的療效，具有重要的臨床應(yīng)用價值。
GM-CSF的性質(zhì)GM-CSF是一種酸性糖蛋白。hGM-CSF基因定位于5號染色體長臂(5q21-32)，基因長度為2.5kb，有4個外顯子和3個內(nèi)含子。hGM-CSF是一種由127個氨基酸組成的糖蛋白，根據(jù)其糖基化程度不同，分為9個以上不同的類型，分子量14kD-32kD。其二級結(jié)構(gòu)由兩個反向平行的β折疊和4個反向平行的α螺旋組成，N端第一螺旋是GM-CSF受體β亞基的識別區(qū)。四個半胱氨酸殘基形成兩個鏈內(nèi)二硫鍵(C54，C96)和(C88，C121)，對GM-CSF的穩(wěn)定性和生物活性起重要作用。
目前已知，GM-CSF的生物學(xué)功能乃是通過表達(dá)于細(xì)胞膜上的特異性受體而介導(dǎo)。GM-CSF通過與受體結(jié)合，激活靶細(xì)胞上Na+/H+轉(zhuǎn)換載體活性，提高細(xì)胞內(nèi)pH數(shù)值，從而引導(dǎo)細(xì)胞增值分化。
GM-CSF的靶細(xì)胞主要有骨髓不同發(fā)育階段的造血細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞等。
GM-CSF的表達(dá)體系利用重組克隆的方法在大腸桿菌、酵母菌和哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中成功表達(dá)了GM-CSF。在大腸桿菌中的表達(dá)方式主要為兩種(1)包涵體形式，GM-CSF在大腸桿菌中表達(dá)最常見的是形成不溶性的包涵體，經(jīng)提取包涵體、變性裂解、復(fù)性、純化等步驟得到GM-CSF。(2)分泌型表達(dá)，即利用外膜蛋白信號肽(OmpA)基因，將GM-CSF基因克隆到OmpA基因后面，用定位突變的方法去除二者間的連接序列，得到成熟的GM-CSF，但表達(dá)量不高，每升發(fā)酵液僅20mg左右。
GM-CSF在酵母系統(tǒng)中的表達(dá)，是將GM-CSF基因克隆到α-因子信號肽基因下游，用定位突變的方法去除GM-CSF與α-因子信號肽間的連接序列，在ADHZ，PGK等啟動子調(diào)控下，于酵母中表達(dá)并分泌到胞外，表達(dá)量可高達(dá)每升發(fā)酵液50-60mg。
GM-CSF在哺乳動物細(xì)胞體系如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)和猴COS-1細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，但表達(dá)量甚微。
上述三種體系表達(dá)的GM-CSF，其主要區(qū)別是N-位點(diǎn)及O-位點(diǎn)的糖基化。大腸桿菌表達(dá)的GM-CSF(E.coli-GM)，N-位點(diǎn)和O-位點(diǎn)均未糖基化，分子量為14.6kD；酵母表達(dá)的GM-CSF(Yeast-GM)，僅N-位點(diǎn)糖基化，而O-位點(diǎn)未糖基化，分子量15.6-30kD；哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的GM-CSF(CHO-GM)，N-位點(diǎn)和O-位點(diǎn)均被糖基化，分子量18-24kD。體外實(shí)驗表明糖基化與非糖基化GM-CSF在生物學(xué)活性方面無明顯差異。
臨床應(yīng)用方面，Dorr比較了E.coil-GM和Yeast-GM的毒副作用，結(jié)果E.coil-GM組出現(xiàn)液體滯留，呼吸困難，發(fā)燒，肌痛/骨痛/關(guān)節(jié)痛和斑疹的平均頻率分別為18.4％，55.2％，40.7％，28.5％和12.5％，Yeast-GM組相對應(yīng)分別為8.3％，13.4％，21.7％，16％和14.3％。表明Yeast-GM毒副作用較輕。Hussein等將E.coil-GM，Yeast-GM和CHO-GM分別用于自體骨髓移植后的乳腺癌或黑色素瘤病人，結(jié)果在升高白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的恢復(fù)方面，E.coli-GM和Yeast-GM明顯高于CHO-GM，而CD34+細(xì)胞數(shù)量，CHO-GM組最高，Yeast-GM組又高于E.coil-GM。其作用機(jī)理仍需進(jìn)一步探討。
GM-CSF的生物學(xué)作用GM-CSF主要有以下的生物學(xué)作用能在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞水平有效刺激粒細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞系增殖、分化和成熟。體外半固體培養(yǎng)中可有效刺激正常髓系多向造血祖細(xì)胞、粒/巨噬細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞克隆形成。還具爆式促進(jìn)因子(BPA)的活性，與GM-CSF協(xié)同促進(jìn)爆式紅系集落形成單位形成。GM-CSF也能促進(jìn)巨核系細(xì)胞生長和血小板的生成。還刺激某些白血病細(xì)胞(HL 60和KG 1)增殖生長，誘導(dǎo)HL 60細(xì)胞向成熟方向分化。骨髓內(nèi)皮細(xì)胞是造血微環(huán)境的基質(zhì)細(xì)胞之一，對造血有重要調(diào)控作用，外源性GM-CSF可刺激其增殖。GM-CSF不僅可刺激未成熟前體細(xì)胞的增殖，還可提高成熟血細(xì)胞的功能，延長其生存期，在調(diào)節(jié)成熟血細(xì)胞功能中似乎起中心作用。GM-CSF對中性粒細(xì)胞的作用主要表現(xiàn)為增加蛋白質(zhì)合成，延長生存期；促進(jìn)ADCC作用；改變細(xì)胞表面受體表達(dá)，抑制其在炎癥區(qū)的移動；上調(diào)細(xì)胞表面黏附蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)胞漿內(nèi)脫顆粒作用；增強(qiáng)氧化代謝，增加超氧化物產(chǎn)生；加速Ca2+流，誘導(dǎo)游走，增加LTB4合成。還可增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬、細(xì)胞毒和殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)、黏附及氧化代謝。對嗜酸粒細(xì)胞主要是增強(qiáng)細(xì)胞毒作用及白三烯合成、組胺釋放。此外，多種非造血起源的腫瘤細(xì)胞系對GM-CSF也有敏感反應(yīng)。
GM-CSF是一種具有廣譜效應(yīng)的多肽生長因子，它通過結(jié)合特定的高親和力受體起作用。在調(diào)節(jié)造血和白細(xì)胞功能中有重要作用，能刺激骨髓祖細(xì)胞增殖和分化，刺激中性、嗜酸性粒細(xì)胞、MΦ及DC增殖和成熟；也可促進(jìn)巨核細(xì)胞生長。對紅細(xì)胞生長有輔助調(diào)節(jié)作用，有促紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞作用，提高單核巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬功能，增加粒細(xì)胞數(shù)目，提高黏附分子表達(dá)及ADCC殺瘤作用，減少感染機(jī)會，提高免疫力，尤其具有增強(qiáng)機(jī)體腫瘤免疫的功能。
臨床應(yīng)用GM-CSF是諸多造血因子中重要一員，自90年代應(yīng)用于臨床以來，特別是腫瘤放療、化療所致的白細(xì)胞減少、骨髓移植、骨髓異常增生綜合征、再生障礙性貧血等治療取得了一定療效。近年來的臨床應(yīng)用中又發(fā)現(xiàn)對放、化療所致黏膜炎、真菌感染、病毒性肝炎、糖尿病合并脂肪漸進(jìn)性壞死的不愈性小腿潰瘍和肺泡蛋白沉積癥等亦有較好的療效。
1、腫瘤放化療所致的造血功能障礙腫瘤化療的療效很大程度取決于化療藥物的劑量強(qiáng)度、密度，而兩者增加常造成骨髓抑制、免疫功能損害，以致化療失敗。骨髓抑制粒細(xì)胞減少，又繼發(fā)細(xì)菌和真菌感染甚至導(dǎo)致病人死亡。十多年的臨床實(shí)踐已證明應(yīng)用GM-CSF，G-CSF可有效預(yù)防和治療化療所致粒細(xì)胞減少，縮短中性粒細(xì)胞減少時間，降低感染的發(fā)生。
GM-CSF可刺激造血的增殖，主要是通過與效應(yīng)細(xì)胞(正常增殖骨髓干細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)表面的GM-CSF受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。它除刺激干細(xì)胞、祖細(xì)胞的分化、增殖外，還有類似巨核細(xì)胞克隆刺激因子的活性，增加白細(xì)胞介素-3(1L-3)對巨核細(xì)胞克隆形成效用，協(xié)同促紅細(xì)胞生成素刺激紅細(xì)胞增殖[劉魏，馮魏健，王玉華等.GM-CSF與化療同步應(yīng)用的臨床觀察.中國腫瘤生物治療雜志，2000；7(3)181]。
2、加快骨髓移植后造血功能的重建骨髓移植是當(dāng)前血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療的主要手段，近年來對實(shí)體瘤如乳腺癌、黑色素瘤、肺癌也取得了一定的成功。一般說來，骨髓移植后需三周中性粒細(xì)胞才能恢復(fù)，此期間極易發(fā)生感染，死于感染者約占10％-15％。大劑量化療，骨髓移植應(yīng)用GM-CSF能加速骨髓造血功能重建，升高周圍白細(xì)胞，減少細(xì)菌感染[趙忠信.重組人粒細(xì)胞-巨細(xì)胞集落刺激因子的臨床新用途.中國腫瘤生物治療雜志，zooo；7(1)71]。
3、治療骨髓異常綜合癥(MDS)和再生障礙性貧血(SAM)文獻(xiàn)報告GM-CSF可有效的恢復(fù)MDS病人粒系再生能力，可使白細(xì)胞升高5-70倍，用藥物48h開始上升，一周達(dá)到穩(wěn)定，但也有人認(rèn)為從GM-CSF促進(jìn)白細(xì)胞分化、成熟上看，GM-CSF可誘導(dǎo)MDS潛在白血病細(xì)胞增殖，也是臨床醫(yī)生擔(dān)心的問題。
再生障礙性貧血是一種異源性疾病，自從上個世紀(jì)90年代GM-CSF應(yīng)用于臨床有很多有關(guān)GM-CSF治療“再障”的報道，可使外周血白細(xì)胞數(shù)增加5-20倍，中性粒細(xì)胞數(shù)增加5-373倍，其他如單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等也都有不同程度的升高。盡管如此，由于不同原因所致的再障，其治療結(jié)果也不盡相同，有的甚至效果較差。用GM-CSF治療“再障”仍是一個需要進(jìn)一步研究的課題[TroussardX，Macro M，Vie B，et al.Human recombinantganulocyte-macrophage colony stimulating factor(hrGM-CSF)improves double hemibody irradiation(DHBI)tolerance inpatients with stage U1 multiple myelomaa pilot study.Br JHaematal，1995；89191]。
4、艾滋病(AIDS)所致的白細(xì)胞減少的治療白細(xì)胞減少是愛滋病的主要并發(fā)病，當(dāng)白細(xì)胞減少，常易導(dǎo)致嚴(yán)重感染，威脅AIDS病人的生命安全，應(yīng)用GM-CSF不但能增加AIDS病人外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量，而且也能增加其功能。由于中性粒細(xì)胞可產(chǎn)生抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)，對AIDS的HIV有拮抗作用。最近文獻(xiàn)報告GM-CSF與Eidovudin干擾素治療，使粒細(xì)胞迅速恢復(fù)，但也有人報告GM-CSF可使HIV產(chǎn)抗原(病毒復(fù)制)水平升高，故確切療效尚需深人研究。
5、增強(qiáng)免疫，抗腫瘤作用單核細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵的細(xì)胞之一，除具有吞噬細(xì)胞功能外，還有調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)的重要作用，此作用是由于GM-CSF促使單核巨噬細(xì)胞的ADCC作用和合成釋放抗腫瘤因子。英國Christie醫(yī)院應(yīng)用GM-CSF治療晚期惡性腫瘤20例，7例腫瘤穩(wěn)定70天，1例脂肪肉瘤縮小50％，并持續(xù)6個月[張守岌，宋希林.粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子在腫瘤應(yīng)用進(jìn)展腫瘤防治雜志，2000；7(5)518]。
6、惡性腫瘤放、化療所致黏膜炎癥、潰瘍的預(yù)防和治療作用口腔黏膜潰瘍是惡性腫瘤放、化療過程中不可避免的并發(fā)癥，而這種并發(fā)癥不但影響治療的繼續(xù)進(jìn)行，而且易導(dǎo)致細(xì)菌、真菌等微生物的感染，加重病情。目前臨床上對這種并發(fā)癥的處理還沒有什么好的治療手段，常規(guī)的治療措施是積極抗感染、補(bǔ)充維生素及加強(qiáng)營養(yǎng)等，但這些辦法幾乎沒有多少臨床效果。
rhGM-CSF不僅能夠促進(jìn)骨髓造血，而且對口腔黏膜潰瘍也有著很好的防治作用。1994年Reynos等采用rhGM-CSF加生理鹽水漱口的方法對大劑量化療、異基因骨髓移植和自體外周血干細(xì)胞移植所導(dǎo)致的口腔黏膜潰瘍進(jìn)行了研究，證明rhGM-CSF對防治口腔黏膜潰瘍有著很好的效果。rhGM-CSF無論是采用皮下注射，還是采用溶于生理鹽水漱口的方式，它均能有效地促進(jìn)潰瘍愈合，這也許在臨床上是一個很好的選擇。
7、對真菌感染的治療目前，真菌感染已成為腫瘤患者的主要死亡原因之一。有文獻(xiàn)報道，對于持續(xù)發(fā)熱并伴有白細(xì)胞低下的患者，經(jīng)抗生素治療1周后，系統(tǒng)性真菌感染的發(fā)生率約為33％，而對于骨髓移植患者，侵人性真菌感染的發(fā)生率也高達(dá)15％-30％。這些現(xiàn)象已經(jīng)明確地顯示，真菌感染對惡性腫瘤患者的預(yù)后產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。
現(xiàn)在臨床上常用的抗真菌制劑主要有兩性霉素、制霉菌素、克霉哇、氟康哇、酮康哩等，這些藥物都有著一定的抗真菌作用，但是它們同時均有著一個嚴(yán)重的副反應(yīng)—骨髓抑制，以致許多患者不得不終止治療。GM-CSF是一種具有多項潛能的造血生長因子，它不僅能夠促進(jìn)造血前體細(xì)胞的增殖、分化和成熟，恢復(fù)因腫瘤化療所致的骨髓抑制，而且對機(jī)體免疫機(jī)能的調(diào)節(jié)也起著一定的作用。鑒于此，GM-CSF在治療真菌感染中能夠發(fā)揮良好的作用。Peter等[Peters BG，AdkinsDR，Harrison BR，et al.Antifungal effects of yeast derivedrhuGM-GSF in patients receiving high dose chemotherapy givenwith or without autologous stem cell transplantation；Aretrospective analysis.Bone Marrow Transulant.1996.18(1)93]對145例進(jìn)行自體干細(xì)胞移植患者的真菌感染情況進(jìn)行了回顧性分析，發(fā)現(xiàn)采用rhGM-CSF治療的70例患者中有2例存在真菌感染，發(fā)生率為2.9％；而在對照組，75例患者中有9例發(fā)生真菌感染，發(fā)生率為12％。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)處理，P值為0.023，兩者之間存在明顯差異。rhGM-CSF對真菌感染確實(shí)有著良好的療效，它能夠增強(qiáng)抗真菌藥物的作用。
8、病毒肝炎的治療傳統(tǒng)HBV，HCV都以干擾素為主要治療手段，但臨床越來越感到不很理想，不少病例因治療中出現(xiàn)骨髓抑制而不得不停止治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，GM-CSF可激活T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞(APC)的功能，增加細(xì)胞MHC，協(xié)同刺激分子(CM)參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)抗病毒藥物的療效。目前GM-CSF已用于慢性肝炎的治療。GM-CSF提高a-INF對慢性乙型肝炎抗病毒治療效果，其機(jī)理可能與升高血液單核細(xì)胞數(shù)量提高抗原遞呈能力有關(guān)[邵春忠，劉文彥，陳小霞等.粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子與α-干擾素聯(lián)合治療慢性乙型肝炎的療效觀察.中華實(shí)驗和臨床病毒學(xué)雜志，2001；15(1)86]。
9、GM-CSF在新生兒期的應(yīng)用新生兒由于自身免疫的特點(diǎn)，感染的發(fā)病率和病死率高，傳統(tǒng)的治療模式主要包括抗生素的使用及輸注各種血制品(包括血漿、粒細(xì)胞、靜脈用丙種球蛋白)，后者療效好，但潛在副作用大。應(yīng)用CSF可增強(qiáng)吞噬細(xì)胞系統(tǒng)功能，提高機(jī)體免疫力，為新生兒感染的預(yù)防和治療開辟了一條新的途徑。但目前還處于初步階段，尚需進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗來探討[張擁軍，徐英美.粒細(xì)胞-粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子在新生兒期的應(yīng)用.國外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊，2001；28(2)99]。
GM-CSF毒副作用絕大部分病人對臨床使用的rGM-CSF劑量都能很好耐受。雙盲、隨機(jī)和平行性的比較研究發(fā)現(xiàn)，rGM-CSF治療組病人腹瀉、視力疲勞、皮疹和感覺不適的發(fā)生率較高，其它副作用的類型和發(fā)生率與安慰劑對照組比較無明顯差異。開放性試驗表明，使用rGM-CSF的患者，大多都有類似流感的癥狀，表現(xiàn)為肌肉疼痛，骨痛，疲勞和頭痛，部分病人發(fā)熱，小部分病人有毛細(xì)血管滲出癥狀，出現(xiàn)液體儲留，浮腫，心包和胸膜液體滲出，導(dǎo)致停藥。亦有報道在皮下注射部位出現(xiàn)皮疹，個別病人有中央靜脈導(dǎo)管血栓形成和呼吸窘迫，因而，目前主張對有既往肺病史的患者，使用rGM-CSF應(yīng)特別注意。
劑量和用法用酵母來源的rGM-CSF治療自體骨髓移植術(shù)后骨髓細(xì)胞的重建，美國推薦骨髓輸注后2-4h使用，250ug/m2，每日2h靜滴，連續(xù)使用21d。用rGM-CSF治療骨髓移植失敗的病人，美國主張250ug/m2/d，2h靜滴，連續(xù)14d，如有必要，間隔7d后再按上法使用，第三療程rGM-CSF的劑量可增加到500ug/m2/d，rGM-CSF 500ug/m2/d為臨床使用的最大劑量，如病人病情無改善，不要再加大劑量。rGM-CSF的藥動學(xué)特性與給藥途徑有關(guān)。靜脈內(nèi)給rGM-CSF，血漿rGM-CSF迅速下降，分布半衰期為5-15min，消除半衰期為1.5-2h。皮下給rGM-CSF后2h，rGM-CSF血藥濃度達(dá)峰值，以后逐漸下降，為3h。靜脈注射rGM-CSF 15ug/kg，可維持有效濃度1ug/L 8-22h，皮下注射等量rGM-CSF，可維持有效濃度16h。
GM-CSF的給藥途徑包括靜脈和皮下注射。皮下注射方法可以減小GM-CSF的劑量。目前GM-CSF的使用必需是靜脈注射和皮下注射給藥方式，長期采用注射途徑給病人(除血透病人)帶來痛苦和不便，如果改用非創(chuàng)傷性給藥方式如皮膚或粘膜穿透給藥，易被病人接受，而且通過皮膚進(jìn)入體內(nèi)還可以提高安全性及延長藥物的半衰期。為解決以上問題，本發(fā)明利用能高效攜帶蛋白質(zhì)分子穿透生物膜包括皮膚、粘膜、血腦屏障的小分子轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(Protein Transduction Domain，PTD)，將原核表達(dá)的重組GM-CSF通過非創(chuàng)傷性給藥方式進(jìn)入體內(nèi)，從而達(dá)到治療貧血的目的。
轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是一種能高效穿過生物膜的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，它能將與其共價連接的多肽、蛋白質(zhì)及DNA等分子跨膜導(dǎo)入幾乎所有的組織和細(xì)胞，還可以穿過血腦屏障。1988年Green發(fā)現(xiàn)HIV的Tat蛋白能夠高效地自由進(jìn)出細(xì)胞。1994年Fawell將TAT的36 Aa的區(qū)域化學(xué)交聯(lián)到異源蛋白上后，交聯(lián)蛋白也可轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。Schwarze SR等人將TAT的PTD區(qū)域短肽與大分子半乳糖苷酶在原核細(xì)胞中融合表達(dá)后，將融合蛋白在小鼠體內(nèi)注射，發(fā)現(xiàn)有活性的酶分子在體內(nèi)的各組織中都有表達(dá)，尤為重要的是可以通過血腦屏障。除TAT肽外，來自果蠅觸角足同源異型轉(zhuǎn)錄因子Antp的43-58位的多肽序列，來自瘡疹單病毒DNA結(jié)合蛋白VP22的267-300序列均具有與TAT肽完全相似的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能和轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，它們被統(tǒng)稱為PTD。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一個方面涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-人源GM-CSF融合蛋白。本發(fā)明中，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)所述人源GM-CSF的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽可以選自反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蠅同源異型轉(zhuǎn)錄因子ANTP和單純皰疹病毒I型VP22轉(zhuǎn)錄因子的PTD序列或其功能性類似物或片段。優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)肽具有SEQID NO.2(YGRKKRRQRRR)所述的氨基酸序列或其功能性片段。實(shí)際上，只要能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明所述人源GM-CSF的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽均適用于本發(fā)明。
本發(fā)明中，所述融合蛋白的人源GM-CSF含有SEQ ID NO4(APARSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA AEMNETVEVI SEMFDLQEPTCLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH YKQHCPPTPE TSCATQIITFESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE)的氨基酸序列或其功能性片段。優(yōu)選的，人源粒細(xì)胞集落刺激因子由SEQ ID NO4組成。本發(fā)明的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-人源GM-CSF融合蛋白具有SEQ ID NO6的序列(YGRKKRRQRRR GGS APARSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA AEMNETVEVI SEMFDLQEPTCLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH YKQHCPPTPE TSCATQIITFESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE)。
本發(fā)明的再一方面涉及含有上述編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-人源GM-CSF融合蛋白的核苷酸的核酸分子，所述核酸分子優(yōu)選為SEQ ID NO5(TAC GGCCGC AAG AAA CGC CGC CAG CGC CGC CGC GGT GGTACC gcaccggcacgtagcccgag cccgagcacg cagccgtggg agcatgtgaa tgccatccaggaggcccgtc gtctgctgaa cctgagccgt gacaccgcgg cggagatgaatgaaaccgtg gaagtcatca gcgaaatgtt tgacctgcag gagccgacctgcctgcagac ccgcctggag ctgtacaagc agggcctgcg tggcagcctgaccaagctga agggcccgct gaccatgatg gccagccact acaagcagcactgcccgccg accccggaaa ccagctgtgc aacccagacc atcacctttgaaagcttcaa agagaacctg aaggactttc tgctggtcat cccgtttgactgctgggagc cggtccagga gtaa)所示的核苷酸序列。
上述核苷酸序列可以插入表達(dá)載體中。優(yōu)選的，本發(fā)明所述表達(dá)載體為原核或真核表達(dá)載體，其中優(yōu)選為pGEX、pET、pBV220和peDNA。
本發(fā)明通過將所述核酸分子導(dǎo)入原核表達(dá)載體pET28，pGEX-4T-1等中，通過原核細(xì)胞培養(yǎng)獲得與轉(zhuǎn)導(dǎo)肽融合表達(dá)的人源GM-CSF。
方法易于操作、成本低、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。蛋白純化在變性條件下進(jìn)行，使以包涵體形式存在的融合蛋白的純化過程大大簡化。使變性蛋白的天然構(gòu)象變成相對靈活的鏈狀結(jié)構(gòu)，擺脫空間構(gòu)象的限制，具備更高的能量，使轉(zhuǎn)導(dǎo)效率大大提高。當(dāng)融合蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，重新折疊，恢復(fù)天然構(gòu)象使GM-CSF發(fā)揮其生物學(xué)活性，而與其共價連接的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域不影響細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)或功能。
本發(fā)明又一方面涉及含有本發(fā)明所述融合蛋白的藥物組合物，所述藥物組合物用于惡性腫瘤放、化療后所致的白細(xì)胞減少癥，骨髓移植、再生障礙性貧血和某些存在白細(xì)胞低下的免疫缺陷性疾病的治療，以及創(chuàng)傷愈合、抗病毒、抗真菌等治療。
所述藥物組合物可以含有非注射劑型常用的藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。優(yōu)選的，本發(fā)明所述劑型為可穿越皮膚、粘膜、角膜、結(jié)膜、漿膜、肌膜、血管及淋巴管膜、脈絡(luò)膜、神經(jīng)膜、血腦屏障等一切細(xì)胞膜及生物膜的劑型。特別是舌下含服、肺吸入、鼻噴劑、肛栓及皮膚吸收等多種方式用藥。
借助本發(fā)明的融合蛋白，可以經(jīng)非注射途徑將人源GM-CSF輸入機(jī)體使臨床用藥更為安全、方便。
實(shí)施例實(shí)施例1 人外周血單核細(xì)胞總RNA的提取健康人抗凝外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出單核細(xì)胞。在含20％小牛血清、10-8mol/L TPA和2ug/ul PHA的1640培養(yǎng)液中，在37℃和含50％CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)20h，收集貼壁的單核細(xì)胞。采用Promega公司的RNAgentsR Total RNA Isolation System提取總RNA。
實(shí)施例2 hGM-CSF cDNA的克隆參考Genebank中hGM-CSF cDNA序列設(shè)計引物前面引人了限制性內(nèi)切酶EcoR I位點(diǎn)和起始密碼子ATG，下游引物中含天然GM-CSFcDNA 3’端非編碼區(qū)中部分序列，后面引入限制性內(nèi)切酶BamH I位點(diǎn)，其序列為引物15′-G GAATTC ATGGCA CCA GCT CGT TCT CCA-3′(SEQ IDNO7)引物25′-CT GGATCC CGATCGGGATCATGAGAGAG CAGCTC-3′(SEQID NO8)以實(shí)施例1得到的RNA作為模板，參照試劑盒廠家推薦方案進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得全長的hGM-CSF cDNA，5′和3′端分別攜帶EcoRI，BamH I位點(diǎn)。
反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增用Perkin ElmerCetus公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒。取提取的細(xì)胞總RNA 1-2ug，加入20ul反轉(zhuǎn)錄體系中，以oligo dT為引物，于42℃作用1h，合成cDNA第一鏈。99℃5min終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將20ul逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入到100ul的PCR反應(yīng)體系中，其中含上下游引物。96℃變性10min后加入Taq DNA聚合酶，進(jìn)行PCR循環(huán)，反應(yīng)參數(shù)為94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)后72℃再延伸7min。
實(shí)施例3 重組hG-CSF表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定
hGM-CSF的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后，與經(jīng)同樣酶切回收的表達(dá)載體pBV220片段，按4∶1摩爾比連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，篩選陽性重組子pBV hGM-CSF。送上海申工公司測序。
實(shí)施例4 pBV hG-CSF在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)將過夜培養(yǎng)的實(shí)施例3篩選的陽性單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中(含Amp 60mg/L)，于30℃培養(yǎng)至OD600＝0.45后，迅速升溫至42℃，誘導(dǎo)5h左右，至OD600＞1.2。于4℃下6000g離心10min，收集菌體。SDS-PAGE電泳鑒定rhGM-CSF的表達(dá)水平，并鑒定表達(dá)形式。
實(shí)施例5 rhGM-CSF的復(fù)性與純化將上述誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體超聲破解。12000g離心20min，棄上清。沉淀經(jīng)洗滌、溶解，將包涵體溶解液上樣到Sephacryl S-200柱(3.6×100cm)，洗脫液為含8mol/L尿素、1mmol/L DTT的TE緩沖液，流速0.5ml/min。上述收集液用TE稀釋至蛋白濃度為100ug/ml以下，尿素濃度保持在1mol/L，加入0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽(G-S-S-G)，1mmol/L還原型谷胱甘肽(GSH)，10℃復(fù)性2小時。用TE緩沖液平衡QSepharose Fast Flow層析柱(1.5×20cm)。將復(fù)性液上樣，待穿過峰過后，分別用含0.3mol/L，0.5mol/L，1.0mol/L NaCl的TE洗脫，流速1ml/min，收集目的峰，對PBS透析。
實(shí)施例6 生物活性測定采用小鼠白血病細(xì)胞株NFS-60依賴性MTT測定法。將NFS-60在含10ng/ml GM-CSF的完全培養(yǎng)基RPMI-1640中傳代。檢測當(dāng)天，NFS-60用RPMI-1640洗3遍(1000r/min離心5min)，用含15％血清的培養(yǎng)基調(diào)整為5×104/ml。樣品根據(jù)測算蛋白濃度稀釋至10ng/ml，hGM-CSF標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品均倍比稀釋。陰性對照不加GM-CSF。細(xì)胞在50％CO2，37℃飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)72h。加MTT顯色液及溶解液二甲基亞砜，用570nm波長濾光片測OD值。
按下式計算rhGM-CSF活性單位 根據(jù)蛋白濃度計算每毫克rhG-CSF的單位數(shù)即為比活性(U/mg)。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所<120>轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-人源粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白及其藥物組合物<160>8<210>I<211>33<212>DNA<213>編碼PTD的核苷酸序列<400>1TACGGCCGCA AGAAACGCCG CCAGCGCCGC CGC 33<210>2<211>11<212>氨基酸序列<213>PTD的氨基酸序列<400>2YGRKKRRQRR R 11<210>3<211>384<212>DNA<213>編碼人源粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的核苷酸序列<400>3gcaccggcac gtagcccgag cccgagcacg cagccgtggg agcatgtgaa tgccatccaggaggcccgtc gtctgctgaa cctgagccgt gacaccgcgg cggagatgaa tgaaaccgtggaagtcatca gcgaaatgtt tgacctgcag gagccgacct gcctgcagac ccgcctggagctgtacaagc agggcctgcg tggcagcctg accaagctga agggcccgct gaccatgatggccagccact acaagcagca ctgcccgccg accccggaaa ccagctgtgc aacccagaccatcacctttg aaagcttcaa agagaacctg aaggactttc tgctggtcat cccgtttgactgctgggagc cggtccagga gtaa 384<210>4<211>127<212>氨基酸序列<213>人源粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的氨基酸序列<400>4APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV EVISEMFDLQ EPTCLQTRLELYKQGLRGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQT ITFESFKENL KDFLLVIPFDCWEPVQE 127<210>5<211>426
<212>DNA<213>編碼PTD-人源粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的核苷酸序列<400>5tacggccgca agaaacgccg ccagcgccgc cgcggtggta ccgcaccggc acgtagcccgagcccgagca cgcagccgtg ggagcatgtg aatgccatcc aggaggcccg tcgtctgctgaacctgagcc gtgacaccgc ggcggagatg aatgaaaccg tggaagtcat cagcgaaatgtttgacctgc aggagccgac ctgcctgcag acccgcctgg agctgtacaa gcagggcctgcgtggcagcc tgaccaagct gaagggcccg ctgaccatga tggccagcca ctacaagcagcactgcccgc cgaccccgga aaccagctgt gcaacccaga ccatcacctt tgaaagcttcaaagagaacc tgaaggactt tctgctggtc atcccgtttg actgctggga gccggtccaggagtaa 426<210>6<211>141<212>氨基酸序列<213>轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-人源粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的氨基酸序列<400>6YGRKKRRQRR RGGSAPARSP SPSTQPWEHV NAIQEARRLL NLSRDTAAEM NETVEVISEMFDLQEPTCLQ TRLELYKQGL RGSLTKLKGP LTMMASHYKQ HCPPTPETSC ATQTITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE 141<210>7<211>28<212>DNA<213>引物<400>76GAATTCATG GCACCAGCTC GTTCTCCA 28<210>8<211>34<212>DNA<213>引物<400>8CTGGATCCCG ATCGGGATCA TGAGAGAGCA GCTC 3權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其含有轉(zhuǎn)導(dǎo)肽和人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)肽選自反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蠅同源異型轉(zhuǎn)錄因子ANTP和單純皰疹病毒I型VP22轉(zhuǎn)錄因子的PTD序列或其功能性類似物或片段。
3.權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)肽具有SEQ ID NO2的序列或其功能性片段。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的融合蛋白，其中所述人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子具有SEQ ID NO4的序列。
5.權(quán)利要求1的融合蛋白，其具有SEQ ID NO6的序列。
6.核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-5中任一項的融合蛋白。
7.權(quán)利要求6的核酸分子，其具有SEQ ID NO5的序列。
8.包含權(quán)利要求7的核酸分子的表達(dá)載體。
9.藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-5中任一項的融合蛋白。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其劑型為可穿越皮膚、粘膜、角膜、結(jié)膜、漿膜、肌膜、血管及淋巴管膜、脈絡(luò)膜、神經(jīng)膜、血腦屏障等一切細(xì)胞膜及生物膜的劑型。
11.權(quán)利要求9的藥物組合物，其適合于舌下含服、肺吸入、鼻噴劑、肛栓及皮膚吸收用藥。
12.權(quán)利要求1-5中任一項的融合蛋白在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療惡性腫瘤放化療后所致的白細(xì)胞減少癥、骨髓移植、再生障礙性貧血和某些存在白細(xì)胞低下的免疫缺陷性疾病，以及創(chuàng)傷愈合、抗病毒、抗真菌治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)導(dǎo)肽－人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白以及含有編碼所述融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本發(fā)明還涉及含有上述核酸分子的表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及所述融合蛋白在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于惡性腫瘤放、化療后所致的白細(xì)胞減少癥、骨髓移植、再生障礙性貧血和某些存在白細(xì)胞低下的免疫缺陷性疾病的治療，以及創(chuàng)傷愈合、抗病毒、抗真菌等治療。
文檔編號A61K9/00GK101074267SQ20061008245
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者李前, 孫曼霽 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所