專利名稱：轉(zhuǎn)導(dǎo)肽－人源粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白及其藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有藥用價(jià)值的融合蛋白，具體為轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-人源粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白，編碼該融合蛋白的核酸分子。本發(fā)明也涉及含有該融合蛋白的藥物組合物。
背景技術(shù)：
概述粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)是一種多肽鏈的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，刺激骨髓細(xì)胞形成粒細(xì)胞集落形成單位，增加中性粒細(xì)胞(ANC)、單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞數(shù)量。G-CSF主要作用于粒系祖細(xì)胞、粒系前體細(xì)胞增殖、分化，并增強(qiáng)成熟粒細(xì)胞的功能活性；增強(qiáng)ANC的吞噬作用，改善ANC活性氧的釋放功能以加強(qiáng)其殺滅病原微生物能力，對(duì)機(jī)體應(yīng)激防御系統(tǒng)有重要意義。
G-CSF的生物學(xué)性質(zhì)人G-CSF由單個(gè)基因編碼，其基因位于17號(hào)染色體的q21-22區(qū)，長(zhǎng)約2.5kb，有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子；其蛋白質(zhì)由174氨基酸組成，其間有2個(gè)二硫鍵連接而構(gòu)成三級(jí)結(jié)構(gòu)，分子量為22kD。天然的G-CSF含有糖基，糖基化位點(diǎn)位于Thr133，無N-糖基位點(diǎn)，糖基對(duì)G-CSF的生物學(xué)活性沒有貢獻(xiàn)，在E.coli中表達(dá)的G-CSF無糖基，但其功能與天然G-CSF無明顯差別。
G-CSF的生物學(xué)作用是通過與效應(yīng)細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合而產(chǎn)生的。G-CSF受體是高親和力受體，分布于造血祖細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、髓系白血病細(xì)胞、血小板以及T、B淋巴細(xì)胞。某些非造血細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、小細(xì)胞、肺癌細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞等)也有G-CSFR存在。但受體密度相差很大，受體密度約37-1000個(gè)/細(xì)胞。受體與年齡、性別、外周血相中血紅蛋白量、白細(xì)胞數(shù)、血小板的數(shù)量無關(guān)，而與骨髓中原始細(xì)胞的比例呈顯著負(fù)相關(guān)，急性白血病患者G-CSF受體表達(dá)率明顯低于正常。G-CSF受體的數(shù)量隨著細(xì)胞的成熟而增加，因此，G-CSF受體的表達(dá)在某種程度上反映了細(xì)胞的分化程度。體外試驗(yàn)顯示即使中性粒細(xì)胞上有較低水平的G-CSFR表達(dá)，解離常數(shù)很低(3pmol/L)，也能發(fā)揮G-CSF較高的生物活性，因此少量G-CSFR結(jié)合即可誘發(fā)很大的G-CSF生物效應(yīng)。
1、G-CSF能特異性地誘導(dǎo)粒系祖細(xì)胞的增殖與分化G-CSF作用的主要對(duì)象是粒系細(xì)胞，不僅可促進(jìn)粒系祖細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其向終末分化。G-CSF對(duì)CD34+/CD33-的骨髓祖細(xì)胞作用較弱，而對(duì)骨髓粒系定向細(xì)胞(CD34+/CD33+)有明顯的促進(jìn)集落形成作用。G-CSF刺激造血祖細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)研究表明G-CSF可誘導(dǎo)較成熟祖細(xì)胞(早幼粒細(xì)胞)的細(xì)胞分裂，但不能促進(jìn)早期祖細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期。CD34+的骨髓祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)G-CSF獨(dú)自不能維持原始造血祖細(xì)胞的自我更新，因此，G-CSF在造血中的作用時(shí)相為造血細(xì)胞分化晚期。G-CSF與其他細(xì)胞因子(IL-3，IL-12，IL-1B，IL-6)共同作用對(duì)造血祖細(xì)胞的生長(zhǎng)有協(xié)助作用，同時(shí)G-CSF還能影響一些造血調(diào)控因子如GM-CSF，IL-3對(duì)原始及多能祖細(xì)胞的反應(yīng)。
在體內(nèi)，G-CSF能促進(jìn)粒系祖細(xì)胞的增殖、分化及成熟，并促進(jìn)骨髓中中性粒細(xì)胞和干祖細(xì)胞釋放于外周血中(Tsuruta T，Tani K，Shimane M，et al.Br J Haematol，1996；929)。G-CSF可使外周血中造血干/祖細(xì)胞數(shù)量增加10倍，這為外周血造血干細(xì)胞移植提供了理論依據(jù)。G-CSF作為干細(xì)胞動(dòng)員劑，不但使外周血干細(xì)胞移植變得更為可能，且避免了細(xì)胞毒性干細(xì)胞動(dòng)員劑所帶來的骨髓抑制，目前已被臨床廣泛采用。此外，骨髓移植后G-CSF能明顯加速粒細(xì)胞的恢復(fù)，增強(qiáng)粒細(xì)胞的功能，可縮短發(fā)熱天數(shù)和抗生素應(yīng)用時(shí)間。單劑量的G-CSF皮下注射，2小時(shí)后，可見外周血中中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，這一作用12小時(shí)達(dá)高峰，持續(xù)36小時(shí)后逐漸恢復(fù)到原有水平；骨髓中同時(shí)伴有髓祖細(xì)胞的增加，祖細(xì)胞集落形成及骨髓S期細(xì)胞比例增加，但對(duì)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、血小板、網(wǎng)織紅細(xì)胞及血紅蛋白等均無明顯影響。
G-CSF能增強(qiáng)成熟粒細(xì)胞的趨化性、吞噬作用及殺菌能力，促進(jìn)其生存。G-CSF可促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放花生四烯酸和白細(xì)胞堿性磷酸酶及髓過氧化物酶，并介導(dǎo)中性粒細(xì)胞超氧陰離子的產(chǎn)生及抗體依賴的細(xì)胞殺傷活性(ADCC)作用〔Aman MJ，Stockdreher K，Thews A，etal.Ann Hematol，1996；73231；Thomas P.Carsten K，Janet M，et al.Blood，1996；87900]。
2、其他血細(xì)胞的作用125I標(biāo)記G-CSF，通過γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定淋巴細(xì)胞表面無G-CSF特異性受體存在，Morikawa等〔Morikawa K，Miyawaki T，Oseko F，et al.Eur J Hematol，1993；51144〕用生物素標(biāo)記G-CSF在流式細(xì)胞儀上的測(cè)定結(jié)果顯示，B-淋巴細(xì)胞表面有G-CSF特異性受體存在。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)G-CSF可促進(jìn)B-淋巴細(xì)胞的增殖，但其促進(jìn)B-淋巴細(xì)胞分泌免疫球蛋白的作用更為顯著，且發(fā)現(xiàn)高濃度的G-CSF，才能引起B(yǎng)-淋巴細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生反應(yīng)，但G-CSF刺激髓系細(xì)胞則無需如此高的濃度，推測(cè)在細(xì)菌感染情況下，機(jī)體可釋放有活性的G-CSF，使體內(nèi)G-CSF的血液濃度明顯升高，各種細(xì)胞包括粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞均參與炎癥反應(yīng)，且分泌各種有活性的包括G-CSF在內(nèi)的可溶性因子，因此在炎癥局部G-CSF的濃度相當(dāng)高，有可能達(dá)到促進(jìn)B-淋巴細(xì)胞增殖及分泌免疫球蛋白的作用。
Shimoda等[Shimoda K，Okamura S，Harada N，et al.J ClinInvest，1993；911310]首次報(bào)道血小板上有G-CSF特異性受體存在，且有較高的親合力(解離常數(shù)KD300±150pM)。結(jié)合位點(diǎn)412±158/細(xì)胞，且發(fā)現(xiàn)低濃度的G-CSF(0.1ng/ml)即可改變ADP對(duì)血小板引起的繼發(fā)性凝集反應(yīng)，也有大劑量G-CSF在體內(nèi)引起血小板介導(dǎo)中性粒細(xì)胞超氧陰離子的產(chǎn)生及抗體依賴的細(xì)胞殺傷活性(ADCC)作用數(shù)量增加的報(bào)告。
3、G-CSF對(duì)非造血細(xì)胞的作用G-CSF不僅對(duì)造血系統(tǒng)細(xì)胞有明顯作用，對(duì)某些非造血細(xì)胞也有一定作用。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)G-CSF可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生及遷移，刺激H-69，H-128，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，對(duì)某些大腸癌細(xì)胞系也有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。G-CSF與轉(zhuǎn)染G-CSF受體的肝癌細(xì)胞系(Hep 3B)細(xì)胞共同孵育，可促使其細(xì)胞產(chǎn)生急性期反應(yīng)蛋白[Mitsuru H，ThomasH，Tsutomu A，et al.Archives Bioche Biophysics，1995；324344]。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞上有G-CSF受體存在，G-CSF對(duì)胎盤細(xì)胞的生長(zhǎng)及生存也有重要作用。
4、G-CSF對(duì)白血病細(xì)胞的作用體外培養(yǎng)中，G-CSF能顯著增加急性髓細(xì)胞性白血病(AML)細(xì)胞的集落形成，AML細(xì)胞的DNA合成率也明顯增加，能促進(jìn)白血病細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，對(duì)G-CSF依賴的細(xì)胞系(如NFS-60細(xì)胞系)等也有同樣作用。這些作用均與細(xì)胞表面表達(dá)特異性G-CSF受體有關(guān)，其促進(jìn)增殖的信息傳導(dǎo)過程尚不十分明確〔Baer MR，Bernstein SH，Brunetto VI.，et al.Blood，1996；871484]。
G-CSF不僅促進(jìn)髓系細(xì)胞的增生，也能促進(jìn)其分化。Fukunage等[Fukunaga R，Etsuko i.shizaka一lkada，Nagata S.Cell，1993；741079]在轉(zhuǎn)染G-CSF受體的小鼠髓祖細(xì)胞FDC-P1細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，G-CSF能促進(jìn)MPD及LE的mRNA的表達(dá)。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)G-CSF使FDC-P1細(xì)胞向早幼粒細(xì)胞分化。Santini等[Santini V，Colombat PH，DelwelR，et al.Leuk Res，1991；15341]在AML細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中加入適量的G-CSF，培養(yǎng)14天發(fā)現(xiàn)，成熟中性粒細(xì)胞的比例明顯增加，并指出這種分化作用通常是不完全的；但有實(shí)驗(yàn)顯示在體外G-CSF不能使AML細(xì)胞向粒細(xì)胞終末分化，在體內(nèi)G-CSF能否誘使白血病向正常細(xì)胞的分化，尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。
近年來研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF不僅對(duì)髓細(xì)胞性白血病有作用，對(duì)急淋細(xì)胞也有作用。CD7+CD3-的ALL，CD10+的B-細(xì)胞ALL，T-原始淋巴細(xì)胞性淋巴瘤等細(xì)胞表面也有G-CSF受體存在；體外培養(yǎng)顯示G-CSF也能促進(jìn)其細(xì)胞的增殖〔Inukai T，Sugita K，lijima K，et al.BrJ Hematol，1995；89623；Morikawa K，Morikawa S，Miyawaki T，et al.Br J Haematol，1996；94250〕。提示人們要注意觀察G-CSF在治療ALL及淋巴瘤的過程中的作用。
5、G-CSF與凋亡有學(xué)者認(rèn)為G-CSF可抑制細(xì)胞的凋亡(apoptosis)從而提高依賴G-CSF生長(zhǎng)的細(xì)胞的增殖及生存能力〔Bin Hu，Kozo Y.Int J Hematol，1997；66179〕，體外培養(yǎng)也表明造血祖細(xì)胞在去除G-CSF后，細(xì)胞則發(fā)生凋亡現(xiàn)象，化療藥物不僅直接引起白血病細(xì)胞的壞死，合適濃度也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。G-CSF與多種細(xì)胞毒性藥物同時(shí)加入白血病細(xì)胞懸液中，共同孵育一定時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的比例較單用細(xì)胞毒性藥物明顯減低，提示G-CSF有抑制細(xì)胞凋亡的作用。然而，Dong等分析G-CSF受體功能區(qū)段的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染G-CSF受體基因后的32D細(xì)胞系，在含有G-CSF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞未出現(xiàn)分化現(xiàn)象，卻出現(xiàn)了典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型G-CSF受體的32D細(xì)胞系及大鼠白血病細(xì)胞系(LT12細(xì)胞)在G-CSF作用下，失去了進(jìn)一步的分化能力，而以凋亡的形式發(fā)生了死亡。Bessho等在表達(dá)內(nèi)源性G-CSF受體的小鼠髓性細(xì)胞系也證實(shí)了G-CSF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的現(xiàn)象，說明無論內(nèi)源性表達(dá)G-CSF受體的細(xì)胞或轉(zhuǎn)染G-CSF受體的細(xì)胞，G-CSF均有誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡的作用，且發(fā)現(xiàn)調(diào)亡的發(fā)生與G-CSF受體胞內(nèi)區(qū)有密切關(guān)系。凋亡發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)理，以及與細(xì)胞分化的相互關(guān)系目前尚不清楚。
G-CSF的臨床應(yīng)用G-CSF可用于中性粒細(xì)胞減少的治療，應(yīng)用于實(shí)體瘤化療或放療后的中性粒細(xì)胞減少，療效良好，在白血病化療后的中性粒細(xì)胞減少的治療中也有廣泛的應(yīng)用。治療非腫瘤化療藥導(dǎo)致的粒細(xì)胞減少和先天粒細(xì)胞減少癥也有明顯的療效，但有研究顯示，長(zhǎng)期應(yīng)用有誘發(fā)骨髓異常增生癥(MDS)及AML的可能性。G-CSF用于骨髓及外周血干細(xì)胞移植后的粒細(xì)胞恢復(fù)，治療MDS也有部分療效。G-CSF用于外周血干細(xì)胞動(dòng)員，單用G-CSF或聯(lián)合使用阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺等動(dòng)員外周造血干細(xì)胞，應(yīng)用G-CSF后可比不用時(shí)采集的造血干細(xì)胞數(shù)量高數(shù)十倍。特殊的感染性疾病應(yīng)用G-CSF可以增加吞噬細(xì)胞的數(shù)量，釋放炎性介質(zhì)，促進(jìn)趨化作用，活化B淋巴細(xì)胞促進(jìn)抗體釋放，全面提升抗感染作用。
1、腫瘤放化療后的ANC大劑量化療可最大限殺死腫瘤細(xì)胞，提高化療緩解率和治愈率。但增加劑量會(huì)造成細(xì)胞增殖活躍的組織如骨髓造血系統(tǒng)、黏膜上皮等嚴(yán)重?fù)p傷，造成骨髓抑制、繼發(fā)感染等并發(fā)癥。近年來新藥的不斷問世和化療方案的不斷改進(jìn)，使AL緩解率有了明顯提高，但提高長(zhǎng)期無病存活率還必須反復(fù)接受大劑量化療，隨之而來的骨髓毒性又會(huì)影響療效。應(yīng)用rhG-CSF可以起到彌補(bǔ)作用。
2、骨髓移植后的造血恢復(fù)骨髓移植分為自體骨髓移植(ABMT)和異基因骨髓移植(alto-BMT)。應(yīng)用rhG-CSF的目的在于促進(jìn)移植后的造血恢復(fù)，雖不能縮短移植后粒細(xì)胞缺乏期，但能顯著加速ANC的恢復(fù)。rhG-CSF在2ug/kg/d-22ug/kg/d劑量范圍均有促進(jìn)造血的作用，并呈劑量依賴性[G Visani，B Gamberi，P Greenbery，et al.The use of GM-CSFas an adjunct to autologous/syngeneic bone marrowtransplanta-tiona prospective randomized controlled trial[J].Bone Marrow Transplant，1991，7(Supply 2)81.)。
3、外周血干細(xì)胞動(dòng)員生理狀態(tài)下干細(xì)胞在外周血中含量極少，分離困難，不能滿足移植需要，因此常采用環(huán)磷酞胺等藥物動(dòng)員外周血干細(xì)胞(PBSC)，經(jīng)過一段時(shí)間的ANC缺乏期，干細(xì)胞在外周血中反跳性升高，此時(shí)可分離出較多的PBSC用于移植，但因每次分離的PBSC量不穩(wěn)定，常與骨髓造血細(xì)胞聯(lián)合移植；化療后應(yīng)用rhG-CSF，不僅縮短了ANC缺乏期，減少了感染并發(fā)癥；而且還使干細(xì)胞在外周血中反跳時(shí)間提前，幅度提高，通過較少次數(shù)的白細(xì)胞分離便可獲得大量的PBSC，從而為單獨(dú)PBSC移植提供了條件。
4、在抗感染治療中的應(yīng)用由于rhG-CSF促進(jìn)粒系祖細(xì)胞向粒、巨噬細(xì)胞增殖分化，并逐漸成熟為具有吞噬活性的功能細(xì)胞，ANC一過性增高且功能增強(qiáng)，因此適用于協(xié)同治療合并細(xì)菌或霉菌感染者。臨床多用于預(yù)防或治療癌癥患者化療后因粒細(xì)胞缺乏所合并的感染，劑量范圍100ug/m2-400ug/m2。
5、再生障礙性貧血長(zhǎng)期應(yīng)用rhG-CSF治療5例難治性再障，1--2月后所有患者白細(xì)胞明顯上升，ANC平均增加27倍，其中2例患者貧血改善。黎民君報(bào)道15例合并感染的再障患者，經(jīng)rhG-CSF治療后外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)上升3倍-8倍，ANC計(jì)數(shù)上升2.4倍-6倍，而PLT及Hb無明顯變化；rhG-CSF治療后2d-14d，發(fā)熱、感染得到控制。停用G-CSF后3d-10d，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)基本恢復(fù)治療前的水平[23]。
6、系統(tǒng)性紅斑狼瘡在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的治療中，由于疾病本身或應(yīng)用環(huán)磷酞胺引起的粒細(xì)胞減少癥及由此而繼發(fā)的感染，常常不得不中斷治療而影響療效。王振剛報(bào)道的5例SLE病人在WBC低于3.0×109/L或者出現(xiàn)感染時(shí)停用CTX，應(yīng)用rhG-CSF。在使用后第3d即可出現(xiàn)WBC明顯回升，隨著WBC升高，炎癥消退，CTX得以繼續(xù)應(yīng)用。
7、G-CSF在急性心肌梗死中的治療作用G-CSF是骨髓干細(xì)胞的強(qiáng)有力動(dòng)員劑，能動(dòng)員骨髓中的兩類干細(xì)胞造血干(祖)細(xì)胞和基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入外周血流。這兩種細(xì)胞都具有高度的可塑性，可分化為神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、干細(xì)胞和心肌細(xì)胞等。而不同種類的細(xì)胞形成心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力并不一樣，用G-CSF動(dòng)員骨髓中干細(xì)胞至外周血使其“募集”到梗死區(qū)修復(fù)心肌，可能比移植單一種類型的干細(xì)胞更為有效。正常生理狀態(tài)下，骨髓中造血干細(xì)胞(HSC)約占有核細(xì)胞的0.1％-1％，而在外周血中僅占0.01％。G-CSF在臨床上已廣泛用于外周血造血干細(xì)胞的動(dòng)員以獲得足夠數(shù)量的干細(xì)胞，但目前對(duì)HSC動(dòng)員的確切機(jī)制尚未完全了解[Kronenwett R，Martin S，Haas R.The role of cytokines andadhesion molecules for mobilization of peripheral blood stemcells.Stem Cells，2000，18(5)320-330]。
8、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答rhG-CSF是一種具有多潛能的造血因子，它不但能夠促進(jìn)骨髓前體細(xì)胞的增殖分化，提高外周血細(xì)胞的水平；而且可以通過多種機(jī)制激活機(jī)體的T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。它還能夠增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞(APC)的功能，增加細(xì)胞表面MHC分子、協(xié)同刺激分子(CM)和黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，呈現(xiàn)免疫佐劑的作用PA，rhC-CSF用于病毒性肝炎的治療，能增強(qiáng)抗病毒藥物的治療效果，增強(qiáng)宿主對(duì)肝炎疫苗的應(yīng)答反應(yīng)，艾滋病人發(fā)生機(jī)會(huì)性感染和腫瘤增多，應(yīng)用rhG-CSF對(duì)HIV相關(guān)性疾病的白細(xì)胞減少有效。
rhG-CSF的毒副作用大多數(shù)患者能耐受G-CSF短期應(yīng)用的毒副作用。rhG-CSF的主要不良反應(yīng)表現(xiàn)為關(guān)節(jié)痛、骨痛、肌肉酸痛、低熱等感冒樣癥狀，肝功ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)輕度升高，皮疹等等，停藥后會(huì)自動(dòng)緩解。rhG-CSF引起過敏變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生率很低，發(fā)生的遲早不一，但可能出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征，不可忽視。某些患者會(huì)出現(xiàn)首次劑量反應(yīng)，表現(xiàn)為缺氧、低血壓綜合征，毛細(xì)血管滲出綜合征如水儲(chǔ)留、全身水腫、紅皮病等。
此外，臨床應(yīng)用時(shí)還應(yīng)注意的是，rhG-CSF可導(dǎo)致特殊的類白血病反應(yīng)，即外周血出現(xiàn)幼稚細(xì)胞，骨髓中原始細(xì)胞數(shù)量增加，但這種現(xiàn)象呈一過性，應(yīng)注意結(jié)合病史進(jìn)行判斷分析。髓系惡性白血病患者治療較棘手，因rhG-CSF可以使某些骨髓增生性綜合征(MDS)病例向真正的白血病轉(zhuǎn)化。
在AMI的病人，對(duì)G-CSF的副作用最為關(guān)注的莫過于血液高凝狀態(tài)，再次引起心絞痛或AMI。對(duì)于AMI病人，本身白細(xì)胞較發(fā)病前升高，加上G-CSF刺激白細(xì)胞升高和引起的凝血因子改變可加重血液的高凝狀態(tài)。有報(bào)道，使用G-CSF時(shí)，控制白細(xì)胞在70×109/L是安全的。但對(duì)于AMI病人，權(quán)衡利弊，G-CSF還是極具治療價(jià)值的。
目前G-CSF的使用必需是靜脈注射和皮下注射給藥方式，長(zhǎng)期采用注射途徑給病人(除血透病人)帶來痛苦和不便，如果改用非創(chuàng)傷性給藥方式如皮膚或粘膜穿透給藥，易被病人接受，而且通過皮膚進(jìn)入體內(nèi)還可以提高安全性及延長(zhǎng)藥物的半衰期。
為解決以上問題，本發(fā)明利用能高效攜帶蛋白質(zhì)分子穿透生物膜包括皮膚、粘膜、血腦屏障的小分子轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(Protein TransductionDomain，PTD)，將原核表達(dá)的重組G-CSF通過非創(chuàng)傷性給藥方式進(jìn)入體內(nèi)，從而達(dá)到治療貧血的目的。
轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是一種能高效穿過生物膜的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，它能將與其共價(jià)連接的多肽、蛋白質(zhì)及DNA等分子跨膜導(dǎo)入幾乎所有的組織和細(xì)胞，還可以穿過血腦屏障。1988年Green發(fā)現(xiàn)HIV的Tat蛋白能夠高效地自由進(jìn)出細(xì)胞。1994年Fawell將TAT的36Aa的區(qū)域化學(xué)交聯(lián)到異源蛋白上后，交聯(lián)蛋白也可轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。Schwarze SR等人將TAT的PTD區(qū)域短肽與大分子半乳糖苷酶在原核細(xì)胞中融合表達(dá)后，將融合蛋白在小鼠體內(nèi)注射，發(fā)現(xiàn)有活性的酶分子在體內(nèi)的各組織中都有表達(dá)，尤為重要的是可以通過血腦屏障。除TAT肽外，來自果蠅觸角足同源異型轉(zhuǎn)錄因子Antp的43-58位的多肽序列，來自瘡疹單病毒DNA結(jié)合蛋白VP22的267-300序列均具有與TAT肽完全相似的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能和轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，它們被統(tǒng)稱為PTD。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一個(gè)方面涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-人源粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白。本發(fā)明中，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)所述人源粒細(xì)胞集落刺激因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽可以選自反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蠅同源異型轉(zhuǎn)錄因子ANTP和單純皰疹病毒I型VP22轉(zhuǎn)錄因子的PTD序列或其功能性類似物或片段。優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)肽具有SEQ ID NO2(YGRKKRRQRRR)所述的氨基酸序列或其功能性片段。實(shí)際上，只要能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明所述人源粒細(xì)胞集落刺激因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽均適用于本發(fā)明。
本發(fā)明中，所述融合蛋白的人源粒細(xì)胞集落刺激因子含有SEQ IDNO4(TPLGPASSLP QSFLLKCLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLLGHSLGIPWAP LSSCPSQALQ LAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELGPTLDTLQLDV ADFATTIWQQ MEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGGVLVASHLQSF LEVSYRVLRH LAQP)的氨基酸序列或其功能性片段。優(yōu)選的，人源粒細(xì)胞集落刺激因子由SEQ ID NO4組成。
另一方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)肽與人源粒細(xì)胞集落刺激因子的融合蛋白，該融合蛋白優(yōu)選具有SEQ ID NO6(YGRKKRRQRRR GGS TPLGPASSLPQSFLLKCLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLL GHSLGIPWAPLSSCPSQALQ LAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELG PTLDTLQLDVADFATTIWQQ MEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGG VLVASHLQSFLEVSYRVLRH LAQP)的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及編碼所述轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-人源粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的核酸分子。
本發(fā)明的再一方面涉及含有上述編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-人源粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的核苷酸的核酸分子，所述核酸分子優(yōu)選為SEQ ID NO5(TAC GGC CGC AAG AAA CGC CGC CAG CGC CGC CGC GGTGGTACC actccactgg gtccggcaag cagcctgccg cagagcttcc tgctgaagtgcctggagcaa gtgcgtaaga tccagggcga tggcgcagcg ctgcaggagaagctgtgtgc cacctacaag ctgtgccacc cggaggagct ggtgctgctgggtcacagcc tgggcatccc gtgggcaccg ctgagcagct gcccgagccaggccctgcag ctggcaggct gcctgagcca actgcatagc ggcctgttcctgtaccaggg tctgctgcag gccctggaag gcatcagccc ggagctgggtccgaccctgg acaccctgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccatctggcagcag atggaagaac tgggtatggc cccggccctg cagccgacccagggtgccat gccggccttc gccagcgcgt tccagcgccg tgcaggcggtgtcctggttg ccagccatct gcagagcttc ctggaggtga gctaccgcgttctgcgccac ctggcccagc cgtaa)所示的核苷酸序列。
上述核苷酸序列可以插入表達(dá)載體中。優(yōu)選的，本發(fā)明所述表達(dá)載體為原核或真核表達(dá)載體，其中優(yōu)選為pGEX、pET、pBV220和pcDNA。
本發(fā)明通過將所述核酸分子導(dǎo)入原核表達(dá)載體pET28，pGEX-4T-1等中，通過原核細(xì)胞培養(yǎng)獲得與轉(zhuǎn)導(dǎo)肽融合表達(dá)的人源G-CSF。
方法易于操作、成本低、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。蛋白純化在變性條件下進(jìn)行，使以包涵體形式存在的融合蛋白的純化過程大大簡(jiǎn)化。使變性蛋白的天然構(gòu)象變成相對(duì)靈活的鏈狀結(jié)構(gòu)，擺脫空間構(gòu)象的限制，具備更高的能量，使轉(zhuǎn)導(dǎo)效率大大提高。當(dāng)融合蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，重新折疊，恢復(fù)天然構(gòu)象使G-CSF發(fā)揮其生物學(xué)活性，而與其共價(jià)連接的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域不影響細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)或功能。
本發(fā)明又一方面涉及含有本發(fā)明所述融合蛋白的藥物組合物，用于腫瘤放化療后的中性粒細(xì)胞減少、骨髓移植后的造血恢復(fù)、外周血干細(xì)胞動(dòng)員、抗感染治療、再生障礙性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等的治療。
所述藥物組合物可以含有非注射劑型常用的藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。優(yōu)選的，本發(fā)明所述劑型為可穿越皮膚、粘膜、角膜、結(jié)膜、漿膜、肌膜、血管及淋巴管膜、脈絡(luò)膜、神經(jīng)膜、血腦屏障等一切細(xì)胞膜及生物膜的劑型。
借助本發(fā)明的融合蛋白，可以經(jīng)非注射途徑將人源粒細(xì)胞集落刺激因子輸入機(jī)體，使臨床用藥更為安全、方便。
實(shí)施例實(shí)施例1 人脾臟單核細(xì)胞mRNA的提取取外傷后破裂切除之新鮮脾臟，制備組織懸液，經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離單核細(xì)胞，培養(yǎng)2h除去非貼壁細(xì)胞，在含LPS(300ug/ml)培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)2.5h后收集細(xì)胞，采用Promega公司的RNAgentsRTotal RNA Isolation System提取總RNA，再用Oligo(dt)親和層析柱純化得到Poly(A)+mRNA。
實(shí)施例2 hG-CSF cDNA的克隆參考Genebank中hG-CSF cDNA序列設(shè)計(jì)引物第2個(gè)引物作為逆轉(zhuǎn)錄的引物。
引物15′-GGAATTCACACCATTAGGCCCTGCCAGCTCCCTG-3′(SEQ IDNO7)引物25′-GGGATCCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3′(SEQ IDNO8)以實(shí)施例1得到的mRNA作為模板，參照試劑盒廠家推薦方案進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得全長(zhǎng)的hG-CSF cDNA，其5′和3′端分別攜帶EcoRI，BamH I位點(diǎn)。
實(shí)施例3 重組hG-CSF表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定上述hG-CSF的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后，與經(jīng)同樣酶切回收的表達(dá)載體pBV220片段，按4∶1摩爾比連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，篩選陽性重組子pBV hG-CSF。送上海申工公司測(cè)序。
實(shí)施例4 pBV hG-CSF在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)將過夜培養(yǎng)的實(shí)施例3中篩選得到的陽性單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中(含Amp 60mg/L)，于30℃培養(yǎng)至OD600＝0.45后，迅速升溫至42℃，誘導(dǎo)5h左右，至OD600＞1.2。于4℃下6000g離心10min，收集菌體。SDS-PAGE電泳鑒定rhG-CSF的表達(dá)水平，并鑒定表達(dá)形式。
實(shí)施例5 rhG-CSF的復(fù)性與純化將上述誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體超聲破解。12000g離心20min，棄上清。沉淀經(jīng)洗滌、溶解、復(fù)性。上樣于用20mmol/L NaAc-HAC pH4.0平衡的CM-Sepharose FF層析柱，用含1.0mol/L NaCl的該緩沖液線性梯度洗脫，收集各蛋白峰，電泳鑒定rhG-CSF目標(biāo)蛋白峰后，用相應(yīng)鹽濃度的系統(tǒng)緩沖液洗脫，并規(guī)模制備。
實(shí)施例6 生物活性測(cè)定采用小鼠白血病細(xì)胞株NFS-60依賴性MTT測(cè)定法。將NFS-60在含10ng/ml G-CSF的完全培養(yǎng)基RPMI-1640中傳代。檢測(cè)當(dāng)天，NFS-60用RPMI-1640洗3遍(1000r/min離心5min)，用含15％血清的培養(yǎng)基調(diào)整為5×104/ml。樣品根據(jù)測(cè)算蛋白濃度稀釋至10ng/ml，hG-CSF標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品均倍比稀釋。陰性對(duì)照不加G-CSF。細(xì)胞在50％CO2，37℃飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)72h。加MTT顯色液及溶解液二甲基亞砜，用570nm波長(zhǎng)濾光片測(cè)OD值。
按下式計(jì)算rhG-CSF活性單位
根據(jù)蛋白濃度計(jì)算每毫克rhG-CSF的單位數(shù)即為比活性(U/mg)。
序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所<120>轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-人源粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白及其藥物組合物<160>8<210>1<211>33<212>DNA<213>編碼PTD的核苷酸序列<400>ITACGGCCGCA AGAAACGCCG CCAGCGCCGC CGC 33<210>2<211>11<212>氨基酸序列<213>PTD的氨基酸序列<400>2YGRKKRRQRR R 11<210>3<211>525<212>DNA<213>編碼人源粒細(xì)胞集落刺激因子的核苷酸序列<400>3actccactgg gtccggcaag cagcctgccg cagagcttcc tgctgaagtg cctggagcaagtgcgtaaga tccagggcga tggcgcagcg ctgcaggaga agctgtgtgc cacctacaagctgtgccacc cggaggagct ggtgctgctg ggtcacagcc tgggcatccc gtgggcaccgctgagcagct gcccgagcca ggccctgcag ctggcaggct gcctgagcca actgcatagcggcctgttcc tgtaccaggg tctgctgcag gccctggaag gcatcagccc ggagctgggtccgaccctgg acaccctgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcagatggaagaac tgggtatggc cccggccctg cagccgaccc agggtgccat gccggccttcgccagcgcgt tccagcgccg tgcaggcggt gtcctggttg ccagccatct gcagagcttcctggaggtga gctaccgcgt tctgcgccac ctggcccagc cgtaa525<210>4<211>174<212>氨基酸序列<213>人源粒細(xì)胞集落刺激因子的氨基酸序列<400>4TPLGPASSLP QSFLLKCLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLL GHSLGIPWAPLSSCPSQALQ LAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELG PTLDTLQLDV ADFATTIWQQMEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGG VLVASHLQSF LEVSYRVLRH LAQP 174
<210>5<211>567<212>DNA<213>編碼PTD-人源粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的核苷酸序列<400>5tacggccgca agaaacgccg ccagcgccgc cgcggtggta ccactccact gggtccggcaagcagcctgc cgcagagctt cctgctgaag tgcctggagc aagtgcgtaa gatccagggcgatggcgcag cgctgcagga gaagctgtgt gccacctaca agctgtgcca cccggaggagctggtgctgc tgggtcacag cctgggcatc ccgtgggcac cgctgagcag ctgcccgagccaggccctgc agctggcagg ctgcctgagc caactgcata gcggcctgtt cctgtaccagggtctgctgc aggccctgga aggcatcagc ccggagctgg gtccgaccct ggacaccctgcagctggacg tcgccgactt tgccaccacc atctggcagc agatggaaga actgggtatggccccggccc tgcagccgac ccagggtgcc atgccggcct tcgccagcgc gttccagcgccgtgcaggcg gtgtcctggt tgccagccat ctgcagagct tcctggaggt gagctaccgcgttctgcgcc acctggccca gccgtaa 567<210>6<211>188<212>氨基酸序列<213>轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-人源粒細(xì)胞集落刺激因子的氨基酸序列<400>6YGRKKRRQRR RGGSTPLGPA SSLPQSFLLK CLEQVRKIQG DGAALQEKLC ATYKLCHPEELVLLGHSLGI PWAPLSSCPS QALQLAGCLS QLHSGLFLYQ GLLQALEGIS PELGPTLDTLQLDVADFATT IWQQMEELGM APALQPTQGA MPAFASAFQR RAGGVLVASH LQSFLEVSYRVLRHLAQP 188<210>7<211>34<212>DNA<213>引物<400>7GGAATTCACACCATTAGGCCCTGCCAGCTCCCTG 34<210>8<211>34<212>DNA<213>引物<400>8GGGATCCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC 3權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其含有轉(zhuǎn)導(dǎo)肽和人源粒細(xì)胞集落刺激因子。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)肽選自反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蠅同源異型轉(zhuǎn)錄因子ANTP和單純皰疹病毒I型VP22轉(zhuǎn)錄因子的PTD序列或其功能性類似物或片段。
3.權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)肽具有SEQ ID NO2的序列或其功能性片段。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的融合蛋白，其中所述人源粒細(xì)胞集落刺激因子具有SEQ ID NO4的序列。
5.權(quán)利要求1的融合蛋白，其具有SEQ ID NO6的序列。
6.核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的融合蛋白。
7.權(quán)利要求6的核酸分子，其具有SEQ ID NO5的序列。
8.包含權(quán)利要求7的核酸分子的表達(dá)載體。
9.藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的融合蛋白。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其劑型為可穿越皮膚、粘膜、角膜、結(jié)膜、漿膜、肌膜、血管及淋巴管膜、脈絡(luò)膜、神經(jīng)膜、血腦屏障等一切細(xì)胞膜及生物膜的劑型。
11.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的融合蛋白在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療腫瘤放化療后的中性粒細(xì)胞減少、骨髓移植后的造血恢復(fù)、外周血干細(xì)胞動(dòng)員、抗感染治療、再生障礙性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)導(dǎo)肽－人源粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白以及含有編碼所述融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本發(fā)明還涉及含有上述核酸分子的表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及所述融合蛋白在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于腫瘤放化療后的中性粒細(xì)胞減少、骨髓移植后的造血恢復(fù)、外周血干細(xì)胞動(dòng)員、抗感染治療、再生障礙性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等治療。
文檔編號(hào)A61P37/02GK101074266SQ20061008245
公開日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2006年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者李前, 孫曼霽 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所