專利名稱：導(dǎo)向雙功能抗腫瘤多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于多肽制藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)、肽類藥物雖然具有專一性強(qiáng)，時效高的優(yōu)點(diǎn)，但在體內(nèi)很快被清除，特別是小分子多肽很快通過腎臟過濾出去，加上被體內(nèi)眾多的蛋白水解酶迅速水解，從而一般半衰期很短。在這神種情況下，如何能延長這些藥物在體內(nèi)地半衰期變?yōu)榻陙淼鞍踪|(zhì)和肽類藥物研究的熱點(diǎn)，特別是用聚乙二醇(polyethylene glycol，簡稱PEG)來修飾的γ-干擾素成為長效藥物用于治療丙種肝炎上市后，帶動了一大批已經(jīng)在臨床上應(yīng)用的蛋白質(zhì)、肽類藥物紛紛采用PEG來獲得長效藥物。然而在眾多的研究中還沒有一個研究與本申請相關(guān)，因此通過本發(fā)明可以把兩種不同功能的多肽雜合在一起，并具有導(dǎo)向和長效功能，特別在腫瘤的治療上，將具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
細(xì)胞粘附肽(簡稱M)是一個五肽，序列為Glu-Ile-Leu-Asp-Val(J.Biol.Chem.1991，Aug.15266(23)15075-15079，Komoriya A.等)，它是由纖粘連蛋白IIICS衍生而來，它是各種細(xì)胞粘著的主要識別位點(diǎn)?？鼓[瘤寡肽(AOP，簡稱O)是一個人工合成的抗腫瘤八肽，包括抗腫瘤寡肽-1(AOP-1)、抗腫瘤寡肽-2(AOP-2)、抗腫瘤寡肽-3(AOP-3)、抗腫瘤寡肽-4(AOP-4)。AOP-1序列為Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala；AOP-2序列為Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala；AOP-3序列為Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala；AOP-4序列為Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala。(抗腫瘤寡肽及其制備方法和應(yīng)用，中國發(fā)明專利，專利申請?zhí)枮?006100768577，2006年，陳鈞輝、張冬梅、王新昌等)，它對小鼠Lewis肺癌和小鼠S180肉瘤的生長有明顯的抑制作用，且具有劑效關(guān)系。可用來制備抗腫瘤藥物，用于治療腫瘤。本發(fā)明需要解決的問題是研制一種通過載體分子PEG把兩個不同功能多肽結(jié)合在一起的方法，制備導(dǎo)向雙功能抗腫瘤多肽(PMO)，包括PMO-1、PMO-2、PMO-3、PMO-4，并研究其抗腫瘤活性和抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能。
本發(fā)明的技術(shù)方案為
1、導(dǎo)向雙功能抗腫瘤多肽(PMO)的制備
(1)細(xì)胞粘附肽M的制備采用液相合成法和活化酯逐個增長法加以合成。
(2)抗腫瘤寡肽(AOP)的制備采用液相合成法或固相合成法合成(詳見中國發(fā)明專利申請?zhí)?006100768577，2006年，陳鈞輝、張冬梅、王新昌等)
(3)PEG對PEG的分子量沒有嚴(yán)格的限定，一般選用分子量為4000～10000，我們選用的是PEG6000。
(4)PEG的活化先把PEG與丁二酸酐反應(yīng)生成聚乙二醇二酸(PEG-DA)，然后再與N-羥基丁二酰亞胺形成聚乙二醇二酸活化酯(PEG-DA-NHS)。
(5)PEG-DA-NHS與粘附M肽、AOP肽反應(yīng)，生成PMO
2、PMO的鑒定
分子量的測定通過HPLC凝膠層析(TSK-3000柱)，氨基酸組成分析通過氨基酸自動分析儀。
3、PMO抗腫瘤活性測定
(1)體外活性測定
采用細(xì)胞計數(shù)的方法，測定PMO對人白血病細(xì)胞U937生長和增殖的抑制作用。當(dāng)細(xì)胞生長成單層后，用含1％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，按每孔1ml接種到24孔培養(yǎng)板上，對照組和實驗組均設(shè)三個重復(fù)孔37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，對照組加入20μl的PBS，試驗組加入不同劑量的AOP肽、PEG-AOP肽和PMO，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，在倒置顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)。
(2)體內(nèi)活性測定
將已接種Lewis肺癌細(xì)胞的荷瘤小鼠處死，無菌操作抽取其腹水，按1∶3比例稀釋，配制成細(xì)胞懸液，于每只實驗用小鼠的右前肢腋窩皮下注射0.2ml瘤細(xì)胞懸液，瘤細(xì)胞不少于105，植瘤24hr后，給藥組分別以不同劑量進(jìn)行靜脈注射，以生理鹽水作為陰性對照組，CTX為陽性對照組，AOP肽連續(xù)注射10天，PEG-AOP肽和PMO每隔3天注射一次，共4次。于停藥4天時處死小鼠，剖取皮下瘤塊，稱瘤重，計算抑瘤率。
(3)抗實驗性腫瘤轉(zhuǎn)移的測定
取對數(shù)生長期的B16細(xì)胞，消化后用無血清培養(yǎng)液配制成2.5×104的細(xì)胞懸液，生理鹽水組每只小鼠尾靜脈注射0.2ml(5×104cell/只)，樣品組動物左尾靜脈先注射樣品液0.5ml，右尾靜脈再注射細(xì)胞懸液0.2ml(5×104cell/只)。接種后28日脫頸處死動物，稱體重，解剖取肺臟，用生理鹽水漂洗后計數(shù)肺部黑色集落數(shù)，計算每組抑制率。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的效果
利用本發(fā)明的技術(shù)合成的PMO突破了傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物的概念，將兩種不同功能的多肽分子通過一個載體連接形成一個雜合分子，不僅具有原來的兩個多肽分子的功能，即抑制腫瘤細(xì)胞的生長和抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的雙重功能，而且具有將藥物導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞和長效的功能。實驗結(jié)果表明POM不論其體外活性，還是體內(nèi)的抑瘤效果均高于AOP肽和PEG-AOP。在相同摩爾濃度的基礎(chǔ)上，其體外活性是AOP肽的3倍，是PEG-AOP的1.2倍。其體內(nèi)抑瘤活性是AOP肽的8倍，是PEG-AOP的2倍。由于PMO具有長效功能，不需每天注射，這不僅方便了患者，而且可以減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本發(fā)明所述PMO可作為制備抗腫瘤藥物。
具體實施例方式
實施例1聚乙二醇二酸(PEG-DA)和聚乙二醇二酸活化酯(PEG-DA-NHS)的制備
30g PEG6000與2.5g丁二酸，溶于100ml氯仿，回流48小時后，抽去有機(jī)溶劑，加乙醚沉淀，真空干燥，得27.5gPEG-DA。
15.5g PEG-DA溶于50ml二氯甲烷，加入1.04g二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)和0.602gN-羥基丁二酰亞胺的50ml四氫呋喃溶液，室溫反應(yīng)24小時后，過濾，濾液加乙醚沉淀，真空干燥，得14.9g PEG-DA-NHS。
實施例2PMO-1的制備半或全部為雄鼠。將已接種Lewis肺癌細(xì)胞的荷瘤小鼠處死，無菌操作抽取其腹水，按1∶3比例稀釋，配制成細(xì)胞懸液，于每只實驗用小鼠的右前肢腋窩皮下注射0.2ml瘤細(xì)胞懸液，瘤細(xì)胞不少于105，植瘤24hr后，給藥組分別以不同劑量進(jìn)行靜脈注射，以生理鹽水作為陰性對照組，CTX為陽性對照組，AOP-1肽連續(xù)注射10天，PEG-AOP-1肽和PMO-1肽每隔3天注射一次，共4次。于停藥4天時處死小鼠，剖取皮下瘤塊，稱瘤重，計算抑瘤率。結(jié)果如表2所示。
表2 PMO-1對小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
實施例6PMO-1的體內(nèi)抗實驗性腫瘤轉(zhuǎn)移的測定
將小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為
1)PMO-18μmol/kg組(樣品和細(xì)胞懸液左右尾靜脈分開注射)
2)PMO-116μmol/kg(樣品和細(xì)胞懸液左右尾靜脈分開注射)
3)生理鹽水對照組
取對數(shù)生長期的B16細(xì)胞，消化后用無血清培養(yǎng)液配制成2.5×104的細(xì)胞懸液，生理鹽水組每只小鼠尾靜脈注射0.2ml(5×104cell/只)，1)、2)組動物左尾靜脈先注射樣品液0.5ml，右尾靜脈再注射細(xì)胞懸液0.2ml(5×104cell/只)。接種后28日脫頸處死動物，稱體重，解剖取肺臟，用生理鹽水漂洗后計數(shù)肺部黑色集落數(shù)，計算每組抑制率。
稱取720mg PEG-DA-NHS，溶于10ml二甲基甲酰胺(DMF)，加入含M肽105.84mg和AOP-1肽152.28mg的120ml pH8.5、0.5mol/L硼酸緩沖液，在室溫反應(yīng)3小時，然后放入截留分子量為1000的透析袋中充分透析，透析液經(jīng)凍干得產(chǎn)品781.3mg，得率87.6％。
實施例3PMO-1的鑒定
用TSK-3000凝膠柱在HPLC上進(jìn)行分子量測定，用氨基酸自動分析儀對PMO-1的氨基酸進(jìn)行測定，再用紫外法對PMO-1中M肽、AOP-1肽的含量進(jìn)行測定。
實施例4PMO-1的體外活性測定
采用細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞計數(shù)的方法，人白血病細(xì)胞U937以RPMI1640為培養(yǎng)基，視不同情況加入10％左右的小牛血清，用T-25培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中單層培養(yǎng)。
當(dāng)細(xì)胞生長成單層后，用含1％小牛血清的培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，按每孔1ml接種到24孔培養(yǎng)板上，對照組和實驗組均設(shè)三個重復(fù)孔37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，對照組加入20μl的PBS，試驗組加入不同劑量的AOP-1肽、PEG-AOP-1肽和PMO-1，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，在倒置顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，結(jié)果如表1所示。
表1 PMO-1對U937細(xì)胞增殖的抑制作用
實施例5PMO-1的體內(nèi)抗腫瘤活性測定
50只健康昆明種小白鼠，體重20±2克，平均分五組，每組10只，雌雄各
表3 PMO-1一次靜脈給藥對小鼠B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的療效
實施例7PMO-2的制備
同實施例2，不同之處僅在于AOP-2替代AOP-1。
實施例8PMO-2的鑒定
用TSK-3000凝膠柱在HPLC上進(jìn)行分子量測定，用氨基酸自動分析儀對PMO-2的氨基酸進(jìn)行測定，再用紫外法對PMO-2中M肽、AOP-2肽的含量進(jìn)行測定。
實施例9PMO-2的體外活性測定
測定方法同實施例4，其結(jié)果如表4。
表4 PMO-2對U937細(xì)胞增殖的抑制作用
實施例10PMO-2的體內(nèi)抗腫瘤活性測定
方法同實施例5，其結(jié)果如表5。
表5 PMO-2對小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
實施例11PMO-2的體內(nèi)抗實驗性腫瘤轉(zhuǎn)移的測定
方法同實施例6，其結(jié)果如表6所示。
表6 PMO-2一次靜脈給藥對小鼠B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的療效
實施例12PMO-3的制備
同實施例2，不同之處僅在于AOP-3替代AOP-1。
實施例13PMO-3的鑒定
用TSK-3000凝膠柱在HPLC上進(jìn)行分子量測定，用氨基酸自動分析儀對PMO-3的氨基酸進(jìn)行測定，再用紫外法對PMO-3中M肽、AOP-3肽的含量進(jìn)行測定。
實施例14PMO-3的體外抗腫瘤活性的測定
方法同實施例4，其結(jié)果如表7所示。
表7 PMO-3對U937細(xì)胞增殖的抑制作用
實施例15PMO-3的體內(nèi)抗腫瘤活性測定
方法同實施例5，其結(jié)果如表8。
表8 PMO-3對小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
實施例16PMO-3的體內(nèi)抗實驗性腫瘤轉(zhuǎn)移的測定
方法同實施例6，其結(jié)果如表9所示。
表9 PMO-3一次靜脈給藥對小鼠B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的療效
實施例17PMO-4的制備
同實施例2，不同之處在于AOP-4替代AOP-1。
實施例18PMO-4的鑒定
用TSK-3000凝膠柱在HPLC上進(jìn)行分子量測定，用氨基酸自動分析儀對PMO-4的氨基酸進(jìn)行測定，再用紫外法對PMO-4中M肽、AOP-4肽的含量進(jìn)行測定
實施例19PMO-4的體外抗腫瘤活性的測定
測定方法同實施例4，其結(jié)果如表10。
表10 PMO-4對U937細(xì)胞增殖的抑制作用
實施例20PMO-4的體內(nèi)抗腫瘤活性的測定
方法同實施例5，其結(jié)果如表11。
表11 PMO-4對小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
實施例21PMO-4的體內(nèi)抗實驗性腫瘤轉(zhuǎn)移的測定
方法同實施例6，其結(jié)果如表12所示。
表12 PMO-4一次靜脈給藥對小鼠B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的療效
權(quán)利要求
1、一種導(dǎo)向雙功能抗腫瘤多肽，其特征在于利用一個載體分子聚乙二醇把兩個不同功能的多肽連接在一起，其中一個多肽為細(xì)胞粘附肽，序列為
Glu-Ile-Leu-Asp-Val；另一個為抗腫瘤寡肽，序列為
Tyr-X-Glu-Pro-Gly-Pro-Y-Ala，其中X為Leu或Ile，Y為Thr或Ser，形成一個共價連接的雜合分子即導(dǎo)向雙功能抗腫瘤多肽。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述導(dǎo)向雙功能抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于由以下幾個步驟構(gòu)成
(1)制備細(xì)胞粘附肽；
(2)制備抗腫瘤寡肽；
(3)聚乙二醇活化形成聚乙二醇二酸活化酯PEG-DA-NHS；
(4)PEG-DA-NHS與粘附肽、抗腫瘤寡肽反應(yīng)，生成導(dǎo)向雙功能抗腫瘤多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述導(dǎo)向雙功能抗腫瘤多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于多肽制藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用一個載體分子聚乙二醇(polyethylene glycol，簡稱PEG)把兩個不同功能的多肽連接在一起，其中一個多肽為細(xì)胞粘附肽，序列為Glu－Ile－Leu－Asp－Val；另一個為抗腫瘤寡肽，序列為Tyr－X－Glu－Pro－Gly－Pro－Y－Ala，其中X為Leu或Ile，Y為Thr或Ser，合成的雜合分子稱導(dǎo)向雙功能抗腫瘤多肽。它具有抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的功能，可在制備治療腫瘤藥物中應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK1883709SQ200610082398
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月21日
發(fā)明者王新昌, 王文剛, 陳鈞輝, 曾名嘉, 聶永軍, 李俊, 張冬梅 申請人:南京大學(xué)