專利名稱：一種脫鈣骨支架材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于骨損傷修復(fù)的支架材料及其制備方法，特別是涉及一種脫鈣骨支架材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
骨缺損的治療是骨科面臨的難題之一，其療效以自體骨移植為佳，但因骨源不足，臨床應(yīng)用受到限制，因此尋找自體骨理想的替代材料一直是研究人員進(jìn)行骨組織工程研究的方向(Kokubo，S.，F(xiàn)ujimoto，R.，Yokota，S.，F(xiàn)ukushima，S.，Nozaki，K.，Takahashi，K.，and Miyata，K.(2003).Bone regeneration by recombinant humanbone morphogenetic protein-2 and a novel biodegradable carrier in a rabbitulnar defect model.Biomaterials 24，1643-1651.；Shors，E.C.(1999).Corallinebone graft substitutes.Orthop Clin North Am 30，599-613.)。研究表明，一種適于骨修復(fù)的支架材料應(yīng)具備以下特點(diǎn)(1)一定的機(jī)械強(qiáng)度以保持特定形態(tài)，(2)良好的細(xì)胞和組織相容性，(3)合適的孔徑大小以利于骨細(xì)胞生長(zhǎng)，(4)合適的降解率等(Damien，C.J.，and Parsons，J.R.(1991).Bone graft and bone graftsubstitutesa review of current technology and applications.J Appl Biomater2，187-208.)。目前，常用的骨支架材料包括骨水泥，聚合材料(如PLGA，鈦合金等)等，但上述材料都或多或少地存在細(xì)胞相容性差及因降解造成局部炎癥等問(wèn)題(Mastrogiacomo，M.，Scaglione，S.，Martinetti，R.，Dolcini，L.，Beltrame，F(xiàn).，Cancedda，R.，and Quarto，R.(2006).Role of scaffold internal structureon in vivo bone formation in macroporous calcium phosphate bioceramics.Biomaterials 27，3230-3237.)。
脫鈣骨基質(zhì)是目前臨床及科研中常用的一種支架材料(Chakkalakal，D.A.，Strates，B.S.，Garvin，K.L.，Novak，J.R.，F(xiàn)ritz，E.D.，Mollner，T.J.，and McGuire，M.H.(2001).Demineralized bone matrix as a biological scaffoldfor bone repair.Tissue Eng 7，161-177.)。該材料保持了天然骨的小梁結(jié)構(gòu)與有機(jī)成分，因而是一種很好的骨填充材料。目前常用的脫鈣骨基質(zhì)材料多采用顆?；蚰z的形式，這樣的形態(tài)雖然能夠很好的填充不規(guī)則的骨缺損，但由于其沒(méi)有機(jī)械強(qiáng)度，不能保持一個(gè)固定的形態(tài)，因而常會(huì)造成材料的移動(dòng)和散失，導(dǎo)致骨修復(fù)的不均一性和不可預(yù)測(cè)性，而且現(xiàn)有的處理方法無(wú)法有效控制免疫原，給移植帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)，這些缺陷極大地限制了現(xiàn)有脫鈣骨基質(zhì)材料在治療較大骨缺損中的應(yīng)用。因此，迫切需要一種具有良好的細(xì)胞和組織相容性，合適的孔徑及一定機(jī)械強(qiáng)度的脫鈣骨支架材料。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有良好的細(xì)胞和組織相容性，合適孔徑及一定機(jī)械強(qiáng)度的脫鈣骨支架材料。
本發(fā)明所提供的脫鈣骨支架材料，是將動(dòng)物松質(zhì)骨依次用丙酮、鹽酸、雙氧水和胰酶進(jìn)行處理后得到的產(chǎn)品。
所述鹽酸的濃度為0.5-0.7M；雙氧水的質(zhì)量百分濃度為10-15％；胰酶的質(zhì)量百分濃度為0.4-0.6％。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種脫鈣骨支架材料的制備方法。
本發(fā)明所提供的脫鈣骨支架材料的制備方法，包括以下步驟1)取動(dòng)物松質(zhì)骨，去除軟骨及脂肪等附著組織；2)清洗松質(zhì)骨；3)將松質(zhì)骨用丙酮處理48-72小時(shí)；4)將松質(zhì)骨置于0.5-0.7M的鹽酸中脫鈣24-48小時(shí)，直至松質(zhì)骨材料出現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，并且再無(wú)明顯的無(wú)機(jī)成分被洗出；5)將脫鈣松質(zhì)骨用質(zhì)量百分濃度為10-15％的雙氧水漂白10-30分鐘；6)清洗松質(zhì)骨，平衡12-24小時(shí)；7)室溫下，將松質(zhì)骨用質(zhì)量百分濃度為0.4-0.6％的胰酶處理6-8小時(shí)；8)清洗松質(zhì)骨，平衡12-24小時(shí)；9)將脫鈣松質(zhì)骨凍干、滅菌后，得到可用于骨損傷修復(fù)的脫鈣骨支架材料。
在上述制備方法中，所述步驟1)中松質(zhì)骨的來(lái)源是廣泛的，如牛、羊、馬或豬等大型哺乳動(dòng)物。
步驟2)、步驟6)和步驟8)中可用去離子水對(duì)松質(zhì)骨進(jìn)行清洗；步驟步驟6)和步驟8)中平衡用水為去離子水。
步驟3)中可根據(jù)實(shí)際需要，先將松質(zhì)骨分割成合適的大小，再用丙酮進(jìn)行處理。
步驟7)中胰酶的濃度優(yōu)選為0.5％。
步驟9)中可用射線照射法對(duì)脫鈣松質(zhì)骨進(jìn)行滅菌，如用鈷60(Co60)進(jìn)行照射。
本發(fā)明提供了一種脫鈣骨支架材料及其制備方法。經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明的脫鈣骨支架材料具有適合骨細(xì)胞生長(zhǎng)的孔徑，良好的物理特性及細(xì)胞和組織相容性，且無(wú)免疫原性，總蛋白含量為93-94％，水份含量為6-7％，膠原蛋白含量為85-92％，灼燒殘?jiān)鼮?.4-0.5％，有效地去除了無(wú)機(jī)成分。在該脫鈣骨支架材料的制備方法中，采用丙酮對(duì)其進(jìn)行處理的目的是去除脂肪組織；使用鹽酸的目的是脫鈣；使用雙氧水的目的是漂白；使用胰酶的目的是盡可能的去除非膠原類蛋白。該制備方法簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求低、成本低廉，可應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，從而滿足骨組織工程研究和臨床治療(特別是治療骨缺損和骨不連)中對(duì)骨損傷修復(fù)材料的需求。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
圖1A為脫鈣骨支架材料的表觀形態(tài)觀察結(jié)果圖1B為脫鈣骨支架材料的掃描電鏡觀察結(jié)果圖2為人原代成纖維細(xì)胞在脫鈣骨支架材料上的生長(zhǎng)情況圖3A為皮下包埋四周后脫鈣骨支架材料的宏觀照片圖3B為放大10倍的皮下包埋四周后脫鈣骨支架材料的切片3C為放大20倍的皮下包埋四周后脫鈣骨支架材料的切片圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所述百分比濃度均為質(zhì)量百分濃度。
實(shí)施例1、脫鈣骨支架材料的制備及其鑒定一、制備脫鈣骨支架材料以牛的松質(zhì)骨為原材料制備脫鈣骨支架材料，具體制備過(guò)程包括如下步驟1)取牛松質(zhì)骨，去除軟骨及脂肪等附著組織；2)用去離子水將松質(zhì)骨清洗干凈；3)將松質(zhì)骨按每塊約0.5-5cm3的大小進(jìn)行分割，并在丙酮中處理48小時(shí)；4)將松質(zhì)骨置于0.5M的鹽酸中脫鈣24小時(shí)，可看到松質(zhì)骨材料出現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，并且再無(wú)明顯的無(wú)機(jī)成分被洗出；5)將經(jīng)脫鈣處理的松質(zhì)骨用10％雙氧水漂白30分鐘；6)用去離子水沖洗，平衡12-24小時(shí)；7)室溫下，用0.4％胰酶處理8小時(shí)；8)用去離子水沖洗，平衡12-24小時(shí)；9)將脫鈣松質(zhì)骨凍干，分裝，用Co60照射滅菌，得到脫鈣骨支架材料。
二、鑒定
1、表觀形態(tài)及掃描電鏡觀察首先對(duì)步驟一獲得的脫鈣骨支架材料進(jìn)行表觀形態(tài)觀察，如圖1A所示，該材料多孔，且具有親水性。在凍干狀態(tài)下，該材料具有較好的機(jī)械強(qiáng)度；在潤(rùn)濕的情況下，該材料則具有較高的彈性，因此將其移植到體內(nèi)時(shí)能夠保持一定的形態(tài)。然后用掃描電鏡對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步地觀測(cè)，掃描電鏡觀測(cè)結(jié)果如圖1B所示，從微觀角度顯示了該材料的多孔結(jié)構(gòu)及孔徑大小，孔徑介于400-600μm之間，適于骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。上述觀測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明的脫鈣骨支架材料具有合適的孔徑和良好的物理特性。
2、膠原含量測(cè)定測(cè)定步驟一獲得的脫鈣骨支架材料的膠原含量，結(jié)果該材料中總蛋白含量為94％，水份含量為7％，膠原蛋白含量為92％，灼燒殘?jiān)鼮?.5％，表明本發(fā)明的脫鈣骨支架材料中無(wú)機(jī)成分的去除十分有效。
3、細(xì)胞相容性檢測(cè)為驗(yàn)證本發(fā)明的脫鈣骨支架材料是否適合細(xì)胞的生長(zhǎng)，現(xiàn)將原代人成纖維細(xì)胞與脫鈣骨支架材料進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果如圖2所示(標(biāo)尺＝100μm)，材料的內(nèi)部和外部均有大量細(xì)胞的生長(zhǎng)，沿著材料支架，細(xì)胞貼附在表面成簇生長(zhǎng)，沒(méi)有明顯的排異反應(yīng)，表明本發(fā)明的脫鈣骨支架材料具有良好的細(xì)胞相容性。
4、免疫原性檢測(cè)免疫原性評(píng)價(jià)是檢測(cè)移植材料的一個(gè)重要指標(biāo)?，F(xiàn)用皮下包埋法檢測(cè)本發(fā)明脫鈣骨支架材料的免疫原性，具體方法為將材料移植到大鼠皮下，觀察組織對(duì)于該材料的反應(yīng)。包埋四周后該材料的宏觀照片如圖3A所示，沒(méi)有明顯的免疫排斥的跡象，周圍組織向內(nèi)生長(zhǎng)，材料邊緣開始降解。皮下包埋四周后的切片圖如圖3B(放大倍數(shù)10×)和圖3C(放大倍數(shù)20×)所示，大量的纖維樣組織填充在材料的空隙之中，以成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞為主，在材料周圍沒(méi)有過(guò)度增殖的免疫細(xì)胞，而且材料開始變的松散，降解。上述檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明的脫鈣骨支架材料沒(méi)有引起組織明顯的反應(yīng)，證明該骨材料具有良好的組織相容性，且無(wú)免疫原性，可用于骨損傷修復(fù)。
實(shí)施例2、脫鈣骨支架材料的制備及其鑒定一、制備脫鈣骨支架材料以豬的松質(zhì)骨為原材料制備脫鈣骨支架材料，具體制備過(guò)程包括如下步驟1)取豬松質(zhì)骨，去除軟骨及脂肪等附著組織；2)用去離子水將松質(zhì)骨清洗干凈；3)將松質(zhì)骨按每塊約0.5-5cm3的大小進(jìn)行分割，并在丙酮中處理72小時(shí)；
4)將松質(zhì)骨置于0.7M的鹽酸中脫鈣48小時(shí)，可看到松質(zhì)骨材料出現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，并且再無(wú)明顯的無(wú)機(jī)成分被洗出；5)將經(jīng)脫鈣處理的松質(zhì)骨用15％雙氧水漂白10分鐘；6)用去離子水沖洗，平衡12-24小時(shí)；7)室溫下，用0.5％胰酶處理6小時(shí)；8)用去離子水沖洗，平衡12-24小時(shí)；9)將脫鈣松質(zhì)骨凍干，分裝，用Co60照射滅菌，得到脫鈣骨支架材料。
用與實(shí)施例1相同的方法對(duì)制備的脫鈣骨支架材料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明的脫鈣骨支架材料具有合適的孔徑，良好的物理特性及細(xì)胞和組織相容性，且無(wú)免疫原性，總蛋白含量為93％，水份含量為6％，膠原蛋白含量為87％，灼燒殘?jiān)鼮?.4％，無(wú)機(jī)成分的去除十分有效，可用于骨損傷修復(fù)。
權(quán)利要求
1.一種脫鈣骨支架材料，是將動(dòng)物松質(zhì)骨依次用丙酮、鹽酸、雙氧水和胰酶進(jìn)行處理后得到的產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫鈣骨支架材料，其特征在于所述鹽酸的濃度為0.5-0.7M。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脫鈣骨支架材料，其特征在于所述雙氧水的質(zhì)量百分濃度為10-15％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脫鈣骨支架材料，其特征在于所述胰酶的質(zhì)量百分濃度為0.4-0.6％。
5.一種脫鈣骨支架材料的制備方法，包括以下步驟1)取動(dòng)物松質(zhì)骨，去除軟骨及附著組織；2)清洗松質(zhì)骨；3)將松質(zhì)骨用丙酮處理48-72小時(shí)；4)將松質(zhì)骨置于0.5-0.7M的鹽酸中脫鈣24-48小時(shí)；5)將松質(zhì)骨用質(zhì)量百分濃度為10-15％的雙氧水漂白10-30分鐘；6)清洗松質(zhì)骨，平衡12-24小時(shí)；7)室溫下，將松質(zhì)骨用質(zhì)量百分濃度為0.4-0.6％的胰酶處理6-8小時(shí)；8)清洗松質(zhì)骨，平衡12-24小時(shí)；9)將脫鈣松質(zhì)骨凍干、滅菌后，得到脫鈣骨支架材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中的松質(zhì)骨來(lái)源于牛、羊、馬或豬。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)、步驟6)和步驟8)中用去離子水對(duì)松質(zhì)骨進(jìn)行清洗；步驟步驟6)和步驟8)中平衡用水為去離子水。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中先將松質(zhì)骨進(jìn)行分割，再用丙酮進(jìn)行處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟7)中胰酶的濃度為0.5％。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟9)中用鈷60對(duì)脫鈣松質(zhì)骨進(jìn)行照射滅菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脫鈣骨支架材料及其制備方法。該脫鈣骨支架材料是將動(dòng)物松質(zhì)骨依次用丙酮、鹽酸、雙氧水和胰酶進(jìn)行處理后得到的產(chǎn)品。其制備方法包括以下步驟1)取動(dòng)物松質(zhì)骨，去除軟骨及附著組織；2)清洗；3)用丙酮處理48－72小時(shí)；4)置于0.5－0.7M的鹽酸中脫鈣24－48小時(shí)；5)用質(zhì)量百分濃度為10－15％的雙氧水漂白10－30分鐘；6)清洗，平衡12－24小時(shí)；7)室溫下，用質(zhì)量百分濃度為0.4－0.6％的胰酶處理6－8小時(shí)；8)清洗，平衡12－24小時(shí)；9)凍干、滅菌后，得到脫鈣骨支架材料。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1850295SQ200610080609
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者林航, 戴建武 申請(qǐng)人:煙臺(tái)正海生物技術(shù)有限公司, 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所