專利名稱：一種提取純化小牛血清去蛋白提取物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取純化小牛血清去蛋白提取物的方法。
背景技術(shù)：
小牛血清去蛋白提取物(protein-free calf blood extract)是1-6個(gè)月的幼牛血清經(jīng)過除蛋白后得到的小分子生物活性物質(zhì)，含有小分子多肽、氨基酸、酮酸等物質(zhì)。其主要藥理作用是增強(qiáng)細(xì)胞對氧和葡萄糖的攝取、利用，具有改善細(xì)胞代謝的生理作用，在臨床上應(yīng)用廣泛。
目前，常用小牛血清去蛋白提取物的提取方法主要包括酸解和酶解兩種，其中酸解會嚴(yán)重破壞提取物的基本結(jié)構(gòu)，使產(chǎn)品嚴(yán)重失活；酶解能保證生物活性，如中國發(fā)明專利(ZL 96120777.9)所公開的方法，該方法包括采幼牛靜脈血，分離出血清，用乙醇去蛋白，減壓去除乙醇，加入復(fù)合蛋白酶水解，離心分離留上清，將上清液濃縮、除菌、凍干，即得到小牛血清去蛋白提取物。其中，用乙醇去蛋白時(shí)乙醇的用量為兩倍于血清體積的96％乙醇；減壓去除乙醇是利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，37℃、1個(gè)大氣壓下減壓除乙醇；復(fù)合蛋白酶水解的時(shí)間為24小時(shí)(水解一些核酸及蛋白質(zhì))；水解之后的離心分離是在10000rpm、4℃下離心30分鐘，留上清。但采用上述方法所提取得到的產(chǎn)品純度低、活性低，而且都沒有進(jìn)行病毒滅活，無法保證產(chǎn)品的生物安全性(如?？赡軘y帶瘋牛病、口蹄疫等多種病毒)，帶來臨床應(yīng)用的安全隱患。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取純化小牛血清去蛋白提取物的方法。
本發(fā)明所提供的提取純化小牛血清去蛋白提取物的方法，包括采幼牛靜脈血，分離出血清，用乙醇去蛋白，減壓去除乙醇，加入復(fù)合蛋白酶水解，水解之后離心分離留上清，上清液超濾，其中，超濾液先以葡聚糖G-15凝膠層析脫鹽，收集280nm處有特異吸收的洗脫部分；然后，以DEAE-Sephadex-50凝膠層析分離，收集第二個(gè)280nm處有特異吸收的洗脫部分；然后，采用微孔膜過濾和紫外線照射進(jìn)行病毒滅活；得到小牛血清去蛋白提取物。
在本發(fā)明中，葡聚糖G-15凝膠層析脫鹽所用的洗脫液為Tris-Hcl緩沖液，pH為6.8-7.2，優(yōu)選為7.0；以DEAE-Sephadex-50凝膠層析分離所用的洗脫液為Tris-Hcl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，含NaCl的濃度為0.05mol/l，0.8mol/l，pH為8.0-8.5，優(yōu)選為8.2，洗脫流速為3-5ml/min，層析柱的直徑選擇4cm-5cm，凝膠柱床高度與凝膠柱直徑之比為20-50∶1。
在微孔膜過濾和紫外線照射進(jìn)行病毒滅活時(shí)，是以0.02-0.024微米的微孔膜進(jìn)行過濾，以強(qiáng)度為500-1500μw/cm2、波長為250-260nm的紫外線直接照射6-8秒。
為了能更好的進(jìn)行提取物的分離純化，減壓去除乙醇之后還可以將除乙醇后的液體經(jīng)過截留分子量為100000道爾頓的中空纖維柱粗濾。
在本發(fā)明中，用乙醇去蛋白時(shí)乙醇的用量可選用為兩倍于血清體積的96％乙醇；減壓去除乙醇是利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，37℃、1個(gè)大氣壓下減壓除乙醇；加入復(fù)合蛋白酶水解的時(shí)間為24小時(shí)；水解之后離心分離留上清是在10000rpm、4℃下離心30分鐘；上清液超濾是以截留分子量為5000道爾頓的中空纖維柱超濾。
本發(fā)明純化方法通過增加層析分離步驟，除掉了很多非活性成分，降低產(chǎn)物的分子量范圍和發(fā)生不良反應(yīng)的幾率，并且使產(chǎn)品的生物活性刺激指數(shù)由原來的2.5以上提高到3.0以上，提高了產(chǎn)品的純度和和生物活性；通過增加病毒滅活步驟，能夠有效殺滅小牛血清去蛋白提取物中的固有病毒，保證產(chǎn)品的安全性。本發(fā)明提取的產(chǎn)品可以做成水針、凍干分針、腸溶膠囊、腸溶片劑、凝膠劑等多種臨床應(yīng)用劑型，具有廣闊的應(yīng)用前景。
圖1為小牛血清去蛋白提取物的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、提取小牛血清去蛋白提取物1、提取純化方法(1)采幼牛靜脈血，分離出血清在無菌條件下采6個(gè)月以內(nèi)小牛靜脈血，放于4℃冰箱中過夜，使其自然分離出一部分血清，剩余部分在無菌條件下，4000rpm，4℃離心15分鐘，分離出血清備用。
(2)乙醇除蛋白按照乙醇和血清體積比為2∶1的量向血清中加入96％乙醇，不斷攪拌，靜置60分鐘，使蛋白質(zhì)變性沉淀，離心(4000轉(zhuǎn)/分，10分鐘)后留上清棄沉淀。
(3)除乙醇利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，37℃，1個(gè)大氣壓減壓除乙醇。
(4)粗濾用截留分子量100000D的中空纖維柱粗濾，收集濾液。
(5)酶解在濾液中加入復(fù)合蛋白酶，每10升血清加入復(fù)合蛋白酶9-10mg，其中木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的比例為800∶1。
(6)離心在4℃、10000rpm條件下離心30分鐘，棄沉淀留上清。
(7)超濾用截留分子量5000D的中空纖維柱超濾，收集濾液。
(8)純化用交聯(lián)葡聚糖G-15凝膠層析脫鹽(層析液為pH 7.0的Tris-Hcl緩沖液)，收集280nm波長紫外線有特異吸收的部分，調(diào)pH為8.2；然后選用DEAE-Sephadex-50凝膠層析(膠床高度和直徑的比為20∶1，柱直徑選用4.5cm)，洗脫液為Tris-Hcl緩沖液，含NaCl的濃度為0.05mol/l，0.8mol/l，pH為8.2，流速為3-5ml/min，用280nm波長紫外線監(jiān)控，棄去第一洗脫部分，收集第二洗脫部分，然后減壓濃縮到相對密度為1.05-1.08。
(9)病毒滅活采用微孔濾膜濾過+短波紫外線照射進(jìn)行病毒滅活；采用的微孔濾膜為Millipore公司的Viresolve70系列(膜孔徑為0.02-0.024微米)；短波紫外線照射法具體是指用波長為254nm的短波紫外線，強(qiáng)度為1000μw/cm2，直接照射時(shí)間為6-8秒；得到小牛血清去蛋白提取物產(chǎn)品。
2、產(chǎn)品檢測1)液相檢測將所得提取物樣品，按照高效液相色譜法(《中國藥典》二部附錄VD)，用十八烷基鍵合膠為填充劑，以0.68％磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-甲醇(820∶180)為流動相，流速為每分鐘0.75ml，檢驗(yàn)波長為293nm。本方法提取的產(chǎn)品能夠得到穩(wěn)定的指紋圖譜，色譜圖呈兩主峰且兩主峰面積之和應(yīng)為總面積的75％以上，理論板數(shù)以第一峰計(jì)不低于4000。如圖1所示，第一峰理論板數(shù)為6015，兩峰面積之合為84.31％。
作為對比，采用現(xiàn)有方法提取得到的產(chǎn)品，色譜圖不穩(wěn)定，圖譜難以突現(xiàn)出主峰，且定義有效成分的峰面積占總面積的比例不超過50％；說明本發(fā)明方法能提高產(chǎn)品純度。
2)產(chǎn)品的生物活性刺激指數(shù)測定SX《照國家藥品標(biāo)準(zhǔn)-化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)》第十六冊16-83呼吸活性測定法檢測呼吸活性，計(jì)算刺激指數(shù)。
測得本發(fā)明所提取得到產(chǎn)品的生物活性刺激指數(shù)為3.8；作為對比，采用現(xiàn)有方法提取得到的產(chǎn)品，其生物活性刺激指數(shù)為2.7；表明，本發(fā)明方法有效的提高了產(chǎn)品生物活性。
3)病毒滅活有效性測定按照本發(fā)明提取方法，收集到經(jīng)過5000D中空纖維柱超濾得到的超濾液后，向其中加入腦心肌炎病毒(EMCV)和牛腹瀉病毒(BVDV)為指示病毒，經(jīng)過微孔膜濾過后，用波長為254nm的短波紫外線照射，強(qiáng)度為1000μw/cm2，直接照射時(shí)間為6-8秒；通過病毒對照培養(yǎng)，結(jié)果顯示，采用上述滅活方法可以使腦心肌炎病毒滴度下降≥5.00LgTCID50/0.1ml；可以使牛腹瀉病毒滴度下降≥4.00LgTCID50/0.1ml。
結(jié)論所采用的病毒滅活方法可以有效滅活非脂包膜病毒和脂包膜病毒，能保證產(chǎn)品的安全性。
權(quán)利要求
1.一種提取純化小牛血清去蛋白提取物的方法，包括采幼牛靜脈血，分離出血清，用乙醇去蛋白，減壓去除乙醇，加入復(fù)合蛋白酶水解，水解之后離心分離留上清，上清液超濾，其特征在于超濾液先以葡聚糖G-15凝膠層析脫鹽，收集280nm處有特異吸收的洗脫部分；然后，以DEAE-Sephadex-50凝膠層析分離，收集第二個(gè)280nm處有特異吸收的洗脫部分；然后，采用微孔膜過濾和紫外線照射進(jìn)行病毒滅活；得到小牛血清去蛋白提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述葡聚糖G-15凝膠層析脫鹽所用的洗脫液為pH 6.8-7.2的Tris-HCl緩沖液；以DEAE-Sephadex-50凝膠層析分離所用的洗脫液為pH 8.0-8.5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，含NaCl的濃度為0.05mol/l，0.8mol/l，洗脫流速為3-5ml/min，層析柱直徑為4-5cm，凝膠柱床高度與凝膠柱直徑之比為20-50∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述葡聚糖G-15凝膠層析脫鹽所用的洗脫液pH為7.0；以DEAE-Sephadex-50凝膠層析分離所用的洗脫液pH為8.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于微孔膜過濾和紫外線照射進(jìn)行病毒滅活是以0.02-0.024微米的微孔膜進(jìn)行過濾，以強(qiáng)度為500-1500μw/cm2、波長為250-260nm的紫外線直接照射6-8秒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于減壓去除乙醇之后經(jīng)過截留分子量為100000道爾頓的中空纖維柱粗濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述用乙醇去蛋白時(shí)乙醇的用量為兩倍于血清體積的96％乙醇；減壓去除乙醇是利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，37℃、1個(gè)大氣壓下減壓除乙醇；加入復(fù)合蛋白酶水解的時(shí)間為24小時(shí)；水解之后離心分離留上清是在10000rpm、4℃下離心30分鐘；上清液超濾是以截留分子量為5000道爾頓的中空纖維柱超濾。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提取純化小牛血清去蛋白提取物的方法，包括采幼牛靜脈血，分離出血清，用乙醇去蛋白，減壓去除乙醇，加入復(fù)合蛋白酶水解，水解之后離心分離留上清，上清液超濾，其中，超濾液先以葡聚糖G－15凝膠層析脫鹽，收集280nm處有特異吸收的洗脫部分；然后，以DEAE－Sephadex－50凝膠層析分離，收集第二個(gè)280nm處有特異吸收的洗脫部分；然后，采用微孔膜過濾和紫外線照射進(jìn)行病毒滅活；得到小牛血清去蛋白提取物。本發(fā)明純化方法通過增加層析分離步驟，提高了產(chǎn)品的純度和和生物活性；通過增加病毒滅活步驟，保證產(chǎn)品的安全性。本發(fā)明提取的產(chǎn)品可以做成水針、凍干分針、腸溶膠囊、腸溶片劑、凝膠劑等多種臨床應(yīng)用劑型，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P3/00GK1843376SQ200610080520
公開日2006年10月11日 申請日期2006年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月15日
發(fā)明者于洪儒, 王洪新, 楊菁 申請人:錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司