專利名稱：：原兒茶醛的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及原兒茶醛在制備治療或預(yù)防急慢性腎功能衰竭及腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：文獻報道原兒茶醛具有降低紅細(xì)胞胞漿Ca"濃度、增加微循環(huán)障礙大鼠微循環(huán)灌流量、降低瘀血證患者的單核細(xì)胞趨化游走能力等藥理作用。本發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗研究，提供了原兒茶醛在預(yù)防或治療急慢性腎功能衰竭及腎纖維化中的應(yīng)用
發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明提供了原兒茶醛在制備治療或預(yù)防急慢性腎功能衰竭的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了原兒茶醛在制備治療或預(yù)防腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了以原兒茶醛為活性成分的用于腎功能衰竭和腎纖維化的藥物組合物。本發(fā)明提供的藥物組合物，其注射時使用劑量范圍是25rag500rag;優(yōu)選25250mg，口服時使用劑量范圍是50mg2000mg;優(yōu)選501000mg。本發(fā)明提供的藥物組合物，其有效成分的含量為25200mg。本發(fā)明提供的藥物組合物，可以以片劑、膠囊、凍干粉針、注射液的劑型存在，可以采用藥學(xué)常規(guī)方法制備。本發(fā)明提供的原兒茶醛可以由下述方法制備丹參堿液提取液經(jīng)弱堿性樹脂吸附，洗脫，洗脫液調(diào)PH值1-4，弱極性樹脂酸性條件吸附，先用純水或酸性水洗脫，再用低濃度醇洗脫，收集醇洗液，濃縮，冷卻，靜置，得到原兒茶醛結(jié)晶體，過濾，洗滌，干燥，即得。本發(fā)明人通過下列試驗證實了原兒茶醛在急慢性腎功能衰竭及腎纖維化方面的應(yīng)用。具體實施例方式制備例l原兒茶醛的制備將藥材丹參50kg用0.4免的氫氧化鈉1200L溶液提取，獲得含有原兒茶醛的提取液；提取液用鹽酸調(diào)節(jié)至中性，用填充了弱堿性大孔吸附樹脂D301M的吸附柱進行吸附，待吸附劑飽和后，用乙醇溶液50%(V/V)400L洗脫，用氫氧化鈉水溶液0.4%(m/V)500L進行洗脫，收集洗脫液，濃縮至約20L,用鹽酸調(diào)至ra值為2，用填充了弱極性吸附劑AB-8的吸附柱進行酸性條件(預(yù)處理，處理好的樹脂用鹽酸溶液洗脫至洗脫液PH值為2)吸附，用純水800L洗脫，再改用5%乙醇溶液洗脫800L，收集洗脫液，濃縮，得到濃縮液2L;冷卻，靜置，得到原兒茶醛結(jié)晶體，過濾，洗漆，干燥，得到原兒茶醛結(jié)晶體238g，經(jīng)HPLC檢測，純度達(dá)到93%。制備例2原兒茶醛的制備將藥材丹參50kg用0.4%的氫氧化鈉溶液1200L提取，獲得含有丹參素的提取液；提取液用鹽酸調(diào)節(jié)至中性，用填充了弱堿性大孔吸附樹脂D301R的吸附柱進行吸附，待吸附劑飽和后，用乙醇溶液60%(V/V)450L洗脫，用氫氧化鈉水溶液O.5%(m/V)600L進行洗脫，收集洗脫液，濃縮至約10L，用鹽酸調(diào)至PH值3，用填充了弱極性吸附劑AB-8的吸附柱進行酸性條件(處理好的樹脂用鹽酸溶液洗脫至洗脫液PH值為3)吸附，鹽酸水溶液0.2%(V/V)750L洗脫，在改用10%乙醇溶液洗脫500L,收集洗脫液，濃縮，得到濃縮液1.5L，冷卻，靜置，得到原兒茶醛結(jié)晶體，過濾，洗滌，干燥，得到原兒茶醛結(jié)晶體196g，經(jīng)HPLC檢測，純度達(dá)到96%。制備例3:制備注射用原兒茶醛凍干粉針稱取25g原兒茶醛，加入注射用水2000ml,加入0.1%的針用活性炭85'C保溫30分鐘，G3垂熔玻璃漏斗過濾，0.22um的微孔濾膜過濾；濾液分裝于10ml西林瓶中，每支裝量2ml，經(jīng)凍干機凍干制成凍干粉針。制備例4:制備注射用原兒茶醛凍干粉針稱取50g原兒茶醛，加入注射用水2000ml，加入O.1%的針用活性炭85匸保溫30分鐘，G3垂熔玻璃漏斗過濾，0.22um的微孔濾膜過濾；濾液分裝于10ml西林瓶中，每支裝量2ml，經(jīng)凍干機凍干制成凍干粉針。制備例5原兒茶醛膠囊的制備稱取50.0g原兒茶醛、35.0g糖粉、40.0g乳糖和23.0g羧甲基淀粉鈉充分混合均勻后過100目篩，加入適量3y。PVPK3。水溶液制軟材，20目篩制粒，6(TC干燥3小時，18目篩整粒，加入2.0g硬脂酸鎂，混合均勻后灌膠囊，每粒約150mg，即得。制備例6原兒茶醛片的制備稱取50.0g原兒茶醛、35.0g糖粉、40.0g乳糖和23.0g羧甲基淀粉鈉充分混合均勻后過100目篩,加入適量3免PVPk3。水溶液制欽材，20目篩制粒，6(TC干燥3小時，18目篩整粒，加入2.0g硬脂酸鎂，混合均勻后壓片，每粒約150mg，即得。試驗例1原兒茶醛對大鼠急性腎衰的影響1.1藥品與試劑原兒茶醛按制備例1制備甲強龍(比利時法瑪西亞普強公司，規(guī)格40mg/支，批號040706)肌酐和尿素氮試劑盒(北京中生科技公司，批號050606)實驗動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重280g—350g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動物實驗中心提供。合格證號魯動質(zhì)字200106005號。1.2試驗方法與結(jié)果大鼠120只，體重150-200g，動物喂養(yǎng)1周，將動物分為12組，即正常組，模型組，甲強龍(12mg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射小劑量(lmg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射中劑量(2.5mg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射大劑量(10mg/kg)組1，原兒茶醛靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2，原兒茶醛靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3，原兒茶醛灌胃劑量(5mg/kg)組1，原兒茶醛灌胃劑量(50mg/kg)組2，原兒茶醛灌胃劑量(100mg/kg)組3，原兒茶醛灌胃劑量(200mg/kg)組4。甘油配成50%(V/V),除正常組外，給大鼠禁水，16h后一次性肌注，劑量為lmL/100g，各組連續(xù)給藥3天，從眼眶取血，測定血清肌酐和尿素氮(肌酐和尿素氮試劑盒測定肌酐和尿素氮)從表1結(jié)果可以看出，原兒茶醛靜脈注射中劑量(2.5mg/kg)組，原兒茶醛灌胃劑量(5mg/kg)組1降低大鼠急性腎衰血清肌酐和尿素氮(與模型組比較，p〈0.05);甲強龍(12mg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射大劑量(10mg/kg)組l，原兒茶醛靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2，原兒茶醛靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3，原兒茶醛灌胃劑量(50mg/kg)組2,原兒茶醛灌胃劑量(100mg/kg)組3，原兒茶醛灌胃劑量(200mg/kg)組4明顯降低大鼠急性腎衰血清肌酑和尿素氮(與模型組比較，p〈0.01);原兒茶醛靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2降低大鼠急性腎衰血清肌酐和尿素氮與原兒茶酲靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3比較，無顯著性差異；原兒茶醛灌胃劑量(100mg/kg)組3降低大鼠急性腎衰血清肌酐和尿素氮與原兒茶醛灌胃劑量(200mg/kg)組4比較，無顯著性差異。表1原兒茶醛對大鼠急性腎衰血清肌酐和尿素氮的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>'，p<0.05，**，p〈0.Ql，與模型組比較試驗2原兒茶醛對腺嘌呤導(dǎo)致大鼠慢性腎衰的影響2.1藥品與試劑原兒茶醛按制備例1制備腺嘌呤(常州華通化工公司)甲強龍(比利時法瑪西亞普強公司，規(guī)格40mg/支，批號040706)肌酐和尿素氮試劑盒(北京中生科技公司，批號050606)實驗動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重280g—350g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動物實驗中心提供。合格證號魯動質(zhì)字200106005號。2.2試驗方法與結(jié)果大鼠120只，體重150-200g，動物喂養(yǎng)1周，將動物分為12組，即正常組，甲強龍(12mg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射小劑量(lmg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射中劑量(2.5mg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射大劑量(10mg/kg)組l，原兒茶醛靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2，原兒茶醛靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3,原兒茶醛灌胃劑量(5mg/kg)組1，原兒茶醛灌胃劑量(50mg/kg)組2，原兒茶醛灌胃劑量(100mg/kg)組3，原兒茶醛灌胃劑量(200mg/kg)組4，除正常組外，每只大鼠ip腺嘌呤150mg/kg，連續(xù)給予5天腺嘌呤，2天后大鼠眼框取血，測定血清肌酐和尿素氮，觀察造模情況，從第8天開始給藥，連續(xù)給藥14天，從眼眶取血，測定血清肌酐和尿素氮(肌酐和尿素氮試劑盒測定肌酐和尿素氮)，處死作病理切片，觀察腎功能的病理改變。從表2結(jié)果可以看出，原兒茶醛靜脈注射中劑量(2.5mg/kg)組，原兒茶醛灌胃劑量(5mg/kg)組1降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮(與模型組比較，p<0.05);甲強龍(12mg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射大劑量(10mg/kg)組l，原兒茶醛靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2，原兒茶醛靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3，原兒茶醛灌胃劑量(50mg/kg)組2，原兒茶醛灌胃劑量(100mg/kg)組3，原兒茶醛灌胃劑量(200mg/kg)組4明顯降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮(與模型組比較，p<0.01);原兒茶醛靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮與原兒茶醛靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3比較，無顯著性差異；原兒茶醛灌胃劑量(100mg/kg)組3降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮與原兒茶醛灌胃劑量(200mg/kg)組4比較，無顯著性差異。病理檢查正常對照組腎組織結(jié)構(gòu)正常，模型組有明顯腎組織結(jié)晶沉淀物，腎小管破壞，萎縮，管腔變小，其中可見淋巴細(xì)胞浸潤及局部纖維組織增生，腎小球腫大，腎小球上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，內(nèi)皮細(xì)胞下出現(xiàn)大量疏松物質(zhì)，基底膜增厚，定量分析腎小管面積與腎小球體積，模型組與正常對照組比較有顯著性差異。原兒茶醛各組各劑量組隨劑量增加損傷程度明顯減輕，但仍未恢復(fù)至正常水平。表2原兒茶醛對大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*，p<0.05，"，p〈0.01'與模型組比較試驗3原兒茶醛對腎切除導(dǎo)致大鼠慢性腎衰的影響3.1藥品與試劑原兒茶醛按制備例1制備甲強龍(比利時法瑪西亞普強公司，規(guī)格40mg/支，批號040706)肌酐和尿素氮試劑盒(北京中生科技公司，批號050606)實驗動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重280g—350g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動物實驗中心提供。合格證號魯動質(zhì)字200106005號。3.2試驗方法與結(jié)果大鼠180只，體重150-200g，動物喂養(yǎng)1周，將動物分為12組，每組15只，即正常組，甲強龍(12mg/kg)組，原兒茶醛注射小劑量(lmg/kg)組，原兒茶醛注射中劑量(2.5mg/kg)組，原兒茶醛注射大劑量(10mg/kg)組l，原兒茶醛注射大劑量(25mg/kg)組2，原兒茶醛注射大劑量(50mg/kg)組3，原兒茶酸灌胃劑量(5mg/kg)組1，原兒茶醛灌胃劑量(50mg/kg)組2，原兒茶醛灌胃劑量(100mg/kg)組3，原兒茶醛灌胃劑量(200mg/kg)組4，除正常組外，大鼠用5/6腎切除方法制成慢性腎衰模型，第一次手術(shù)切除左腎2/3，一周后行第二次手術(shù)切除右腎，第二次手術(shù)后一周開始給藥，給藥方式為灌胃給藥或腹腔注射給藥，給藥后4周、8周分別大鼠眼框取血，測定血清肌酐和尿素氮，給藥后4周處死5只，試驗結(jié)束處死10只，作病理切片，觀察腎功能的病理改變。從表3、表4結(jié)果可以看出，原兒茶醛靜脈注射中劑量(2.5mg/kg)組，原兒茶醛灌胃劑量(5mg/kg)組1降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮(與模型組比較，p〈0.05);甲強龍(12mg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射大劑量(10mg/kg)組l，原兒茶醛靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2，原兒茶醛靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3,原兒茶醛灌胃劑量(50mg/kg)組2，原兒茶醛灌胃劑量(馳g/kg)組3，原兒茶醛灌胃劑量(200mg/kg)組4明顯降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮(與模型組比較，p〈0.01);原兒茶醛靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮與原兒茶醛靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3比較，無顯著性差異；原兒茶醛灌胃劑量(100mg/kg)組3降低大鼠慢性腎衰血清肌酐和尿素氮與原兒茶醛灌胃劑量(200mg/kg)組4比較，無顯著性差異。病理改變給藥第4周模型組光鏡下見腎小球有不同程度代償性肥大，系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增多，腎小球毛細(xì)血管襻呈分葉狀，部分腎小球囊腔消失，毛細(xì)血管管壁增厚，腎小管腫脹、擴張，管腔內(nèi)有蛋白沉積，部分小管萎縮，間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤，各給藥組亦見上述改變，但病變程度較輕，隨劑量增大，病變程度減輕；給藥第8周模型組光鏡下見系膜細(xì)胞增生，基質(zhì)明顯增多，毛細(xì)血管管壁塌陷，毛細(xì)血管節(jié)段性硬化，硬化區(qū)多在血管壁附近硬化的腎小球內(nèi)可見均質(zhì)圓形PAS染色深紅色的沉積物，個別腎小球有局灶球囊粘連，局灶新月體形成，間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤，纖維組織增生，各組腎小球硬化程度不等，隨劑量增大，病變程度減輕。表3原兒茶醛對大鼠腎切除慢性腎衰給藥4周血清肌酐和尿素氮的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>試驗4原兒茶醛對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響4.1材料實驗動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重150-200g，SD大鼠，山東綠葉天然藥物研究開發(fā)公司實驗動物中心提供，合格號SYXK(魯)20030020。藥物原兒茶醛按制備例l制備；苯那普利，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，批號040306;羥脯氨酸試劑盒，南京建成生物公司，批號050906。4.2試驗方法與結(jié)果大鼠130只，體重150-200g，動物喂養(yǎng)1周，各大鼠以10%水合氯醛3.OmL/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺上，剪毛后用碘酒、75%酒精消毒手術(shù)區(qū)，行左側(cè)腹切口，逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露并分離左側(cè)輸尿管，假手術(shù)組僅切開腹腔并游離左側(cè)輸尿管，但不結(jié)扎和剪斷，其他各組大鼠用4-0絲線結(jié)扎兩道，上一道結(jié)扎點位于左腎下極水平，然后在兩道結(jié)扎點間剪斷輸尿管，逐層縫合，將動物分為13組，即假手術(shù)組，模型組、苯那普利(10mg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射小劑量(lmg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射中劑量(2.5mg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射大劑量(10mg/kg)組1，原兒茶醛靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2，原兒茶醛靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3，原兒茶醛灌胃小劑量(5mg/kg)組，原兒茶醛灌胃中劑量(25mg/kg)組，原兒茶醛灌胃大劑量(50mg/kg)組1，原兒茶醛灌胃大劑量(馳g/kg)組2，原兒茶醛灌胃大劑量(200mg/kg)組3,術(shù)后各組開始給藥，21天后10%水合氯醛麻醉后處死各組動物，生理鹽水反復(fù)灌洗后留取左側(cè)腎臟，腎組織經(jīng)4%的多聚甲醛緩沖液固定。切取適量腎組織，按羥脯氨酸試劑盒測定說明測定羥脯氨酸。從表5結(jié)果可以看出，原兒茶醛靜脈注射中劑量(2.5mg/kg)組、原兒茶醛灌胃小劑量(5mg/kg)組降低單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎羥脯氨酸含量(與模型組比較，p<0.05);苯那普利(10mg/kg)組，原兒茶醛靜脈注射大劑量(10mg/kg)組l，原兒茶醛靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2,原兒茶醛靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3，原兒茶醛灌胃中劑量(25mg/kg)組，原兒茶醛灌胃大劑量(50mg/kg)組l，原兒茶醛灌胃大劑量(100mg/kg)組2，原兒茶醛灌胃大劑量(200mg/kg)組3,明顯降低單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎羥脯氨酸含量(與模型組比較，p<0.01);原兒茶醛灌胃大劑量(100mg/kg)組2降低單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎羥脯氨酸含量與原兒茶醛灌胃大劑量(200mg/kg)組3比較，無顯著性差異；原兒茶醛靜脈注射大劑量(25mg/kg)組2降低單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎羥脯氨酸含量與原兒茶醛靜脈注射大劑量(50mg/kg)組3比較，無顯著性差異。常規(guī)病理學(xué)檢査①肉眼檢査假手術(shù)組腎臟顏色鮮紅，表面光滑，包膜光澤，無粘連。其他各組腎臟體積增大，顏色蒼白，表面呈顆粒狀，類似人體大白腎，少數(shù)區(qū)域腎包膜粘連。②光鏡檢査假手術(shù)組腎單位結(jié)構(gòu)清晰，腎小球囊無擴張或縮小，腎小管上皮細(xì)胞無明顯變性及壞死，管腔內(nèi)無脫落上皮細(xì)胞或管型，間質(zhì)中無血管擴張或炎細(xì)胞浸潤。模型對照組大片腎小管壞死，腎間質(zhì)纖維細(xì)胞增生，腎小管擴張，內(nèi)有大量棕黃色折光物質(zhì)或壞死脫落的上皮細(xì)胞，腎小球數(shù)目減少，部分腎小球纖維化并與包曼氏囊壁粘連，囊腔消失。給藥各組病變與模型對照組類似，但均有不同程度的形態(tài)學(xué)改善，尤以原兒茶醛灌胃大劑量和原兒茶醛靜脈注射大劑量各組顯著，與模型對照組比較有明顯差異。表5原兒茶醛對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎羥脯氨酸含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*,p<0.05，**，p〈0.01'與模型組比較權(quán)利要求1.原兒茶醛在制備治療或預(yù)防急性腎功能衰竭的藥物中的應(yīng)用。2.原兒茶醛在制備治療或預(yù)防慢性腎功能衰竭的藥物中的應(yīng)用。3.原兒茶醛在制備治療或預(yù)防腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。4.以原兒茶醛為活性成分的用于腎功能衰竭及腎纖維化的藥物組合物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其有效成分的含量為25-200mg。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的組合物，其注射使用劑量范圍是25-500mg，口服使用劑量范圍是50-2000mg。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其注射使用劑量范圍是25-250mg，口服使用劑量范圍是50-1000mg。8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的組合物，其以片劑、膠囊、凍干粉針或注射液劑型存在。全文摘要本發(fā)明提供了原兒茶醛在制備治療或預(yù)防急慢性腎功能衰竭及腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了原兒茶醛的制備方法。提供了以原兒茶醛為活性成分的用于腎功能衰竭及腎纖維化的藥物組合物。文檔編號A61K31/11GK101167707SQ20061006992公開日2008年4月30日申請日期2006年10月26日優(yōu)先權(quán)日2006年10月26日發(fā)明者岳喜典,曲桂武,田京偉,蔣王林申請人:山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司